CN104087526B

CN104087526B - 一种利用地衣芽孢杆菌控制白酒中土臭味的方法

Info

Publication number: CN104087526B
Application number: CN201410270609.0A
Authority: CN
Inventors: 徐岩; 吴群; 郅岩
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-06-17
Filing date: 2014-06-17
Publication date: 2016-09-07
Anticipated expiration: 2034-06-17
Also published as: CN104087526A

Abstract

本发明公开了一种利用地衣芽孢杆菌控制白酒中土臭味的方法，将一株产抗菌脂肽的地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3963应用于白酒酿造，能显著抑制大曲中产土臭素链霉菌的生长和土臭素的合成，属于食品微生物学技术领域。地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3963能够合成抗菌脂肽类活性物质，抑制白酒酿造过程中产土臭素链霉菌的生长和土臭素的合成，从根本上控制浓、清、酱等不同香型白酒中的土臭味。

Description

一种利用地衣芽孢杆菌控制白酒中土臭味的方法

技术领域

本发明属于食品微生物技术领域，具体涉及一种通过向白酒酿造中添加一定量地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3963以控制白酒中土臭味的方法。

背景技术

白酒是我国特有的一种蒸馏酒，并深得消费者喜爱。独特的开放式多菌种固态发酵，以及固态蒸馏模式赋予白酒独特的香味。白酒中的土臭味使白酒的香气和质量大打折扣，优级品率降低，白酒生产企业每年因此而蒙受多达上亿元的巨大经济损失。

现有的包括物理吸附在内的技术手段，虽然能够在一定程度上去除大曲中的土臭味，但此方法不仅耗时费力成本高，且能够同时非特异性地吸附有益香气成分，对白酒的香气和质量带来负面影响。因此这种方法有重大缺陷且难以大规模应用。

已有研究表明，土臭素是白酒中土臭味的化学来源，酿酒大曲中的链霉菌是土臭素的主要产生菌。通过一定手段控制大曲中产土臭素的链霉菌应该是根除白酒中土臭味的基本方法。通过添加化学合成类抗生素来去除大曲中的链霉菌进而防止土臭味产生的方法并不能应用于实际生产过程。这是因为添加抗生素一方面造成食品安全上的巨大风险，另一方面抗生素也能破坏大曲中的有益产酒产香功能微生物的微生态结构，进而影响白酒的香气和质量。因而，目前尚未有一种既能去除白酒生产中的土臭味，又能保留白酒中的有益香气成分，维持大曲中有益功能产酒产香微生物的微生态结构的方法。

来源于土壤、植物叶子及果实表面等天然环境的诸多芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)，能够产生系列抗菌脂肽，具有抑制多种植物病原微生物及人类病原微生物的效果。许多研究者对芽孢杆菌产生的脂肽产生了浓厚的兴趣，包括其优秀的表面活性功能，生物防治及抗生素疗效方面的特征，以及在抗血栓、抗肿瘤方面的药效功能。我们首次发现从高温酿造大曲中分离的地衣芽孢杆菌Bacillus lichenyformisn能够产抗菌脂肽，并有效抑制白酒酿造过程中以Streptomyces albus为代表的产土臭素链霉菌的生长以及土臭素的形成，有效抑制白酒中的土臭味。

发明内容

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明对高温酿酒大曲中分离、筛选获得一株耐高温(45-60℃)，耐酸(pH3.0～5.0)，耐乙醇(0～12％)，能够在白酒酿造过程中的胁迫条件(制曲最高温度达50～60℃；发酵酒醅pH3.5～4.0之间；乙醇最高达7％左右)下生存并发挥功能的地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3963，并对其进行了拮抗产土臭味链霉菌和抑制土臭素合成能力的研究。试验表明这株地衣芽孢杆菌能够抑制产土臭味链霉菌的生长且抑制土臭素合成，同时又对大曲中的有益功能产酒产香微生物的生长没有影响。本发明还对地衣芽孢杆菌CGMCCNO.3963产生的活性物质进行了表征分析，并对活性物质的应用前景进行了实验，从而完成本发明。

实现本发明的技术如下：

本发明涉及的地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3963与白酒酿造过程中产土臭素的链霉菌混合培养时，能有效抑制产土臭素链霉菌的生长，对土臭素的产生有显著抑制作用。

从该地衣芽孢杆菌的培养物中获得具有抗菌活性物质1，被表征为抗菌脂肽surfactin系列物质。具有如说明书所示的质谱图谱，且有如下结构：

抗菌脂肽surfactin及同系物能显著抑制白酒酿造过程中产土臭素链霉菌的生长，且对土臭素的合成有显著的抑制作用。

从该地衣芽孢杆菌的培养物中获得具有抗菌活性物质2，被表征为抗菌脂肽lichenysin系列物质。具有如说明书所示的质谱图谱，有如下结构：

抗菌脂肽lichenysin及同系物能显著抑制白酒酿造过程中产土臭素链霉菌的生长，且对土臭素的合成有显著的抑制作用。

本发明地衣芽孢杆菌在白酒生产中以菌液或固体菌剂形式添加至酿造大曲中，添加的菌体总量为大曲中链霉菌总量的1％至100％。

具体制备步骤如下所述：

1.对地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3963拮抗链霉菌功能的鉴定。

2.地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3963抗菌活性物质的分离纯化及有效成分鉴定：对地衣芽孢杆菌培养2天后发酵液用有机溶剂萃取(见实施例1)提取抗菌活性物质，将萃取后液体真空旋转蒸发浓缩(见实施例1)，并溶于少量的无菌蒸馏水中。用HPLC进一步分离纯化，利用洗脱曲线各峰值的组分进行抗菌活性检测。用UPLC/ESI-TOF-MASS鉴定抗菌物质。

3.对地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3963拮抗产土臭素链霉菌生长及土臭素产生的应用检测。将上述分离得到的地衣芽孢杆菌菌株与产土臭素的链霉菌菌株按照不同比例接种马铃薯-葡萄糖液体培养基，30℃恒温摇床下200rpm培养50h。用qPCR鉴定混合培养中的链霉菌含量；用顶空固相微萃取气相色谱质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)检测混合培养体系中土臭素的含量(见实施例2)。

4.对步骤2提取的抗菌活性物质拮抗产土臭素链霉菌的生长及土臭素产生的应用检测。将提取得到的抗菌活性物质加入到接种有产土臭素链霉菌菌株的马铃薯-葡萄糖液体培养基中，30℃恒温摇床下200rpm培养50h。用qPCR鉴定混合培养中的链霉菌含量；用顶空固相微萃取气相色谱质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)检测混合培养体系中土臭素的含量(见实施例3)。

实施结果

平板抑菌实验表明地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3963对白酒生产过程中的土臭素产生菌S.albus，S.fradiae，S.radiopugnans，S.sampsonii，都有明显的抗菌效果。我们成功的分离到了该菌株的抗菌成分，经质谱鉴定推测为surfactin和lichenysin。

将该地衣芽孢杆菌菌株按一定比例添加到产土臭素的链霉菌的培养基中，共同培养一定时间，经qPCR和HS-SPME-GC-MS检测分析，地衣芽孢杆菌能显著抑制链霉菌的生长及土臭素的产生。

将HPLC分离得到的抗菌活性物质加入到产土臭素的链霉菌的培养基中，培养一定时间，经qPCR和HS-SPME-GC-MS检测分析，抗菌活性物质能显著拮抗产土臭素链霉菌的生长及土臭素的产生。

本发明提供的地衣芽孢杆菌来源于高温酿造大曲，能产生两种抗菌脂肽，可降低酿造大曲中链霉菌含量最高至100％，降低白酒中土臭素浓度最高至100％。

生物材料保藏

地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)于2010年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝阳区北西路1号院3号，保藏编号CGMCC NO.3963。

附图说明

图1是地衣芽孢杆菌在PDA平板上表现的抗链霉菌活性。

图中PDA平板上涂布了80μl链霉菌孢子(1×10⁸孢子/ml)，平板中央滴加2μl过夜培养的地衣芽孢杆菌培养液。在地衣芽孢杆菌的菌落周围形成了明显的抑菌圈。

图2是surfactin的ESI-TOF-MASS图谱。

图3是lichenysin的ESI-TOF-MASS图谱。

具体实施方式：

实施例1

1.地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3963拮抗链霉菌功能的鉴定：

取2μl过夜培养地衣芽孢杆菌菌液点种涂布有链霉菌S.albus，S.fradiae，S.radiopugnans，S.sampsonii孢子的PDA平板中央(含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，加蒸馏水定容至1L，加15g琼脂)于30℃恒温培养箱培养72h，检测平板中央的抑菌圈的有无及大小。

2.地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3963无菌发酵液的制备：

接种保存的地衣芽孢杆菌到100ml灭菌的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜。然后接种1ml新鲜培养物到含有1L新鲜LB培养基的2L三角瓶中，30℃或37℃，200rpm培养48h。然后8000g离心10min收集上清，用0.22μl的滤膜过滤除菌后得到无菌发酵液4℃保存备用。

3.地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3963无菌发酵液抗菌活性物质的纯化：

将得到的地衣芽孢杆菌的无菌发酵液用等体积的乙醇:三氯甲烷(1:1)萃取10-15h。有机相经真空旋转蒸发仪(BUCHI，RotavaporR-210)60℃蒸干，再用少量蒸馏水溶解。溶解后得到的溶液经0.22微米的滤膜过滤后，用SPE C18小柱净化，采用HPLC纯化；200nm紫外检测；流动相为0.1％甲酸溶液和甲醇，收集各个出峰组分，分别取200μl，加到涂布有S.albus孢子的PDA平板中的牛津杯内，30℃恒温培养箱培养72h，观察各组分的抑菌情况。

4.UPLC/ESI-TOF-MASS鉴定抗菌物质

分别对HPLC收集到的具有抑菌活性的组分进行超高效液相色谱飞行时间质谱联用技术(UPLC/ESI-TOF-MASS)分析。UPLC采用UPLC^TMBEHC₁₈(100mm×2.1mm，1.7μm)色谱柱，以甲醇和水作为流动相，进行线性梯度洗脱。质谱采用正离子模式，离子扫描范围50–1500m/z。采用Masslynx4.1软件对数据进行采集和分析。结果见图2-3，分离的抑菌物质分子量为1008及同系物，推测为surfactin；分子量1007及同系物，推测为lichenysin。

实施例2：地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3963抑制链霉菌生长及土臭素产生的应用检测

1.地衣芽孢杆菌与产土臭素链霉菌S.albus的混合培养

将分离得到的地衣芽孢杆菌菌株与产土臭素的链霉菌菌株S.albus按照1:10000,1:1000,1:100,1:10,1:1的比例(对应地，地衣芽孢杆菌菌株的接种量分别为0.1‰，1‰，1％，10％，100％)接种马铃薯-葡萄糖液体培养基，30℃恒温摇床200rpm培养50h。发酵结束后，取1ml菌液离心后收集菌体，做混合培养下链霉菌菌株S.albus的生物量测定。剩余发酵液10000g离心除去菌体，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，得到无菌发酵液，4℃保藏备用。

2.qPCR检测混合培养体系中链霉菌S.albus生物量

采用绝对定量的方法检测混合体系中S.albus生物量

按照用常规细菌基因组提取方法提取纯培养链霉菌S.albus(空白对照组)基因组DNA，并用NanoDrop 1000(NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，USA)测定基因组浓度，计算基因组拷贝数。按照10倍梯度稀释，得到一系列浓度梯度的S.albus基因组DNA作为qPCR模板，制作基因组拷贝数与qPCR Ct值的标准曲线。20μl qPCR体系包括：SsoFast EvaGreen Supermix 10μl(Bio-Rad)，引物各0.4μl，ddH₂O8.2μl，模板1μl；扩增程序为98℃预变性2min，39个循环的98℃变性5s，60℃15s。应用Bio-Rad CFX Manager2.1进行数据采集和处理，得到基因组拷贝数与qPCR Ct值的标准曲线。

按照用常规细菌基因组提取方法提取不同地衣芽孢杆菌接种量的链霉菌S.albus基因组DNA，稀释100倍作为qPCR模板。20μl qPCR体系包括：SsoFastEvaGreen Supermix 10μl(Bio-Rad)，引物各0.4μl，ddH₂O8.2μl，模板1μl；扩增程序为98℃预变性2min，39个循环的98℃变性5s，60℃15s，39循环。应用Bio-Rad CFX Manager2.1进行数据采集和处理，根据qPCR Ct值和基因组拷贝数与qPCR Ct值的标准曲线计算不同地衣芽孢杆菌接种量的链霉菌S.albus基因组拷贝数，并进行绝对定量，结果见表1。从结果可以看出添加1％，10％，100％的地衣芽孢杆菌能有效抑制链霉菌的生长。

表1不同接种量的B.lichenyformis对S.albus的抑制作用

B.lichenyformis接种量	S.albus抑制率
		0％(对照)	0
1％	55％
		10％	90％
100％	100％

3.混合培养对S.albus产土臭素的影响

混合培养的无菌发酵液中的土臭素含量采用HS-SPME-GC-MS方法进行定量。取8ml的无菌发酵液，加入3g NaCl至过饱和。定量结果见表2。结果表明添加不同比例的地衣芽孢杆菌能有效抑制土臭素的产生。

表2不同接种量的B.lichenyformis对S.albus产土臭素的影响

B.lichenyformis接种量	土臭素抑制率
		0％(对照)	0
1％	65％
		10％	70％
100％	100％

实施例3：地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3963抗菌活性组分拮抗产土臭素链霉菌及土臭素产生的应用检测

1.添加地衣芽孢杆菌抗菌活性组分的产土臭素链霉菌S.albus的培养

将HPLC分离得到的抗菌活性组分添加到产土臭素的链霉菌菌株S.albus的马铃薯-葡萄糖液体培养基中，30℃恒温摇床下200rpm培养50h，对照组为添加等体积的甲醇。发酵结束后，取1ml菌液离心后收集菌体，做链霉菌菌株S.albus的生物量测定。剩余发酵液10000g离心除去菌体，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，得到无菌发酵液，4℃保藏备用。

2.qPCR检测链霉菌S.albus生物量

qPCR Ct值和基因组拷贝数的标准曲线的制作方法同实施例2

按照用常规细菌基因组提取方法提取不同地衣芽孢杆菌接种量的链霉菌S.albus基因组DNA，稀释100倍作为qPCR模板。20μl qPCR体系包括：SsoFastEvaGreen Supermix 10μl(Bio-Rad)，引物各0.4μl，ddH2O8.2μl，模板1μl；扩增程序为98℃预变性2min，39个循环的98℃变性5s，60℃15s，39循环。应用Bio-Rad CFX Manager2.1进行数据采集和处理，根据qPCR Ct值和基因组拷贝数的标准曲线得到不同地衣芽孢杆菌接种量的链霉菌S.albus基因组拷贝数，结果如表3，表明添加抑菌组分能够有效抑制链霉菌S.albus的生长。

表3抑菌组分对S.albus的抑制作用

抑菌组分	S.albus抑制率
		对照	0
Surfactin	63％
		Lichenysin	50％

3.抗菌活性组分对S.albus产土臭素的影响

添加抗菌活性组分的发酵液中土臭素含量采用HS-SPME-GC-MS方法进行定量，结果如表4，结果表明添加抑菌组分能够有效抑制土臭素的合成。

表4抑菌组分对对S.albus产土臭素的影响

抑菌组分	土臭素抑制率
		对照	0
Surfactin	100％
		Lichenysin	90％

Claims

1.一种利用地衣芽孢杆菌控制白酒中土臭味的方法，其特征是通过向白酒酿造过程中添加一定量的地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenyformis)以控制白酒中土臭味；所述地衣芽孢杆菌为CGMCC NO.3963，抑制白酒酿造过程中产土臭素的链霉菌(Actinomycetes)的生长。

2.权利要求1所述的方法，其特征是所述地衣芽孢杆菌为CGMCC NO.3963，抑制白酒酿造过程中土臭素的合成。

3.权利要求1所述的方法，其特征是所述地衣芽孢杆菌为CGMCC NO.3963，能够产生抗菌活性物质抗菌脂肽。

4.权利要求3所述的方法，所述抗菌脂肽为surfactin及其同系物，具有如下结构：

5.权利要求3所述的方法，所述抗菌脂肽为lichenysin及其同系物，具有如下结构：

6.权利要求3所述的方法，其特征是所述抗菌脂肽抑制白酒酿造过程中土臭素的产生。

7.权利要求3所述的方法，其特征是所述抗菌脂肽抑制白酒酿造过程中产土臭素链霉菌的生长。

8.权利要求1所述的方法，其特征在于所述地衣芽孢杆菌可以菌液或固体菌剂形式添加至酿造大曲中。