CN102268397A - 特征香高效产生地衣芽孢杆菌及其在中国白酒酿造中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了系列酱香特征香高效产生菌株及其在中国白酒酿造中的应用，属于生物工程技术领域。本发明提供的菌株，其分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：3961，CGMCC NO：3962，CGMCC NO：3963。菌株来源于中国白酒高温大曲，均能在55℃高温下生长，在麸皮、大麦、小麦、高粱制成的液体和固态培养基中发酵，均能产生明显的酱香特征香香气，且均能发酵代谢产生为C4类、吡嗪类、酸类、苯酚类、芳香环类物质。菌株单独或混合应用于酱香型、芝麻香型白酒生产工艺中，生产的白酒品质提高，特征香更突出且更持久，同时，白酒中酯、酸、芳香环、苯酚、吡嗪类风味物质的浓度提高。

Description

特征香高效产生地衣芽孢杆菌及其在中国白酒酿造中的应用

技术领域

本发明涉及特征香高效产生地衣芽孢杆菌及其在中国白酒酿造中的应用，尤其是酱香特征香高效产生芽孢杆菌及其在中国白酒酿造中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

白酒行业是我国的传统优势行业，对国民经济的发展具有重要的作用。然而，我国白酒制造业在酿造工业技术水平上却与国际酿造酒工业存在着明显的差距，主要表现在：功能微生物及酿造机理不清楚，缺少特有的酿造科学理论与技术体系，传统操作粗放式生产，批次不稳定、优质品率低等问题。

中国白酒的特色在于其独特的风格特征，而高温大曲是形成我国白酒独特风味的重要原因之一，对赋予酱香型、芝麻香、优质浓香型等大多数优质白酒典型特征香的突出、优雅细腻、香味谐调、回味悠长，尤其是空杯留香持久等特点具有重要风味贡献。高温大曲的重要功能实际上就是产特征香微生物功能的体现。因此，认识白酒典型风格及特征最根本的是要明确高温大曲中产特征香的功能细菌。白酒技术发展和进步的关键是酿造工艺技术水平的提升。白酒功能微生物研究的最终目标就是将其应用于白酒生产，形成有效的应用工艺，落实于酿造技术水平的提升。

因此分离产特征香的功能细菌处于非常重要的地位，对有效提高白酒生产的稳定性和白酒品质，实现白酒行业技术水平与行业竞争力的提升具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的一个技术问题是提供酱香特征香高效产生地衣芽孢杆菌，来源于中国白酒高温大曲，其分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，已于2010年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC NO：3961，CGMCC NO：3962，CGMCC NO：3963。

所述菌株微生物学特征是：革兰氏阳性、兼性厌氧、化能异养菌，从葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖产酸，接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，V-P反应阳性，可水解酪蛋白、明胶和淀粉，不利用柠檬酸盐、丙酸盐；能耐受60℃高温生长，可发酵麸皮、大麦、小麦、高粱一种或其组合制成的液体和固态培养基，产生明显的酱香香气。

所述液体培养基的发酵条件为30～60℃，0～200rpm，发酵2～10天。

所述固体培养基的发酵条件为30～60℃，发酵5～15天。

本发明要解决的另一个技术问题就是提供了所述菌株在中国白酒酿造中的应用工艺。将菌株以液体或固体培养物形式接种于白酒大曲、堆积醅或窖池发酵酒醅中，菌株以单独接种或按不同混合比例接种，菌株液体培养物总接种量为0.1％～20％(v/w)，菌株固体培养物总接种量为0.1％～20％(w/w)。

本发明提供了特征香高效产生地衣芽孢杆菌，该菌能耐受60℃的高温；该菌应用于中国白酒酿造中，生产白酒品质提高，酱香特征香突出且更持久，同时提高白酒中的酯、酸、芳香环、苯酚、吡嗪类等风味物质的浓度。

本发明针对中国白酒酿造中存在的主要问题，获得了高温大曲产酱香特征香的功能地衣芽胞杆菌，并提供了功能菌株在中国白酒中的应用工艺。不但对于实现白酒行业技术水平与行业竞争力的提升具有重要的意义，而且对于节约成本，节能减排，促进白酒的可持续性发展具有明显的应用价值。

生物材料样品保藏

三株特征香高效产生，其分类命名为地衣芽孢杆菌，已于2010年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，其保藏编号为CGMCC NO：3961，CGMCC NO：3962，CGMCC NO：3963，菌株存活证明已在专利号为201010238685.5的专利申请中提交国家知识产权局。

具体实施方式

实施例1：产酱香特征香地衣芽孢杆菌菌株的分离筛选。

本发明涉及的菌株来源于生产‘口子窖酒’、‘郎酒’、‘今世缘’、‘山东梁山’、‘洋河’和‘茅台酒’等白酒高温大曲。

步骤1：称取5g粉碎均匀的曲样于20mL无菌生理盐水中，150r/min振荡30min。取菌悬液经适当稀释后，在营养琼脂培养基平板上涂布，37℃培养1d。挑取生长较好、性状不同菌落接种于肉汤琼脂斜面，作为筛选用菌株。

步骤2：将实施例1中筛选得到的菌株按实施例2中的液体种子培养物方式培养，按实施例3进行液态发酵。

步骤3：每个样品由四名品评人员分三次进行品评。品评人员由国家评酒委员和从事白酒研究工作并经过半年闻香训练的人员组成。在20℃的品评环境下，评价发酵液的特征香。筛选得到3株高效产特征香菌株。

实施例2：产酱香特征香地衣芽胞杆菌发酵大麦和小麦混合浸出液体培养基

步骤1：液体种子培养物的制备：在无菌条件下挑1环菌株于装有100ml液体种子培养基的250ml摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得液体种子培养物。

种子液培养基(g/L)：牛肉膏10，葡萄糖10，NaCl 5，pH 7.0，1×105Pa灭菌20min。

步骤2：一级液体种子培养物分别以体积百分比为1％的接种量接种到装有已灭菌的100mL大麦和小麦混合浸出液体培养基的250mL摇瓶中，37℃静置培养6d。

大麦和小麦混合浸出液体培养基：大麦和小麦分别100g，加水800mL，于100℃蒸煮10min。过滤取上清液，pH6.2。1×105Pa灭菌20min。

步骤2：利用上述菌株的发酵产物分析方法为：取上述发酵液以8000rpm离心8分钟。8mL上清液进行HS-SPME和GC-MS分析，采用标准品及其标准曲线进行成分定性与定量，风味成分见表1。

表1特征香高效产生地衣芽孢杆菌液态发酵的香气成分

注：化合物浓度单位，mg/L

实施例3：产酱香特征香地衣芽孢杆菌发酵麸皮固态培养基

步骤1：液体种子培养物的制备：在无菌条件下挑1环于装有100ml液体种子培养基的250ml摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得液体种子培养物。

种子液培养基(g/L)：牛肉膏10，葡萄糖10，NaCl 5，pH 7.0，1×105Pa灭菌20min。

步骤2：一级液体种子培养物分别以体积百分比为1％的接种量接种到装有已灭菌的100g小麦固态培养基的三角瓶中，37℃培养10d。

麸皮固体培养基：采用粉碎后的麸皮，添加40％的水，100℃蒸煮30min。

步骤3：发酵产物分析方法为：准确称取10g酒醅放入100mL离心管，加入20mL超纯水浸泡30min，4℃，10000rpm离心10min，取上清液。进行HS-SPME和GC-MS分析，采用标准品及其标准曲线进行成分定性与定量，风味成分见表2。

表2特征香高效产生地衣芽孢杆菌液态发酵的香气成分

注：化合物浓度单位，mg/g

实施例4：产酱香特征香地衣芽孢杆菌单独在芝麻香型白酒生产中的应用。

步骤1：液体种子培养物的制备：在无菌条件下挑1环于装有100ml液体种子培养基的250ml摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得一级液体种子培养物。

二级种子培养物的制备：10％接种量接种于装有2L液体种子培养基的5L摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得二级液体种子培养物。

上述种子液培养基(g/L)：牛肉膏10，葡萄糖10，NaCl 5，pH 7.0，1×105Pa灭菌20min。

步骤2：二级液体种子培养物以体积百分比为1％的接种量接种到装有已灭菌的麸皮固体培养基中，37℃培养10d，制成固态麸曲。

步骤3：将上述固态麸曲混在经过蒸酒后的酒醅和新粮、高温大曲粉中进行堆积发酵。用曲量为投料量的20％，堆积时间2d。

步骤4：芝麻香堆积酒醅入窖发酵35d。

实施例5：三株产酱香特征香地衣芽孢杆菌混合菌株在芝麻香型白酒生产工艺中的应用。

步骤1：液体种子培养物的制备：在无菌条件下用接种环挑1-2环于装有100ml液体种子培养基的250ml摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得一级液体种子培养物。

二级种子培养物的制备：10％接种量接种于装有2l液体种子培养基的5l摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得二级液体种子培养物。

上述种子液培养基(g/L)：牛肉膏10，葡萄糖10，NaCl 5，pH 7.0，1×105Pa灭菌20min。

步骤2：三株地衣杆菌的二级液体种子培养物以相同比例，总接种量1％(v/w)的共同接种到装有已灭菌的麸皮固体培养基中，37℃培养10d，制成固态麸曲。

步骤3：将上述固态麸曲混在经过蒸酒后的酒醅和新粮、高温大曲粉中进行堆积发酵。用曲量为投料量的20％，堆积时间2d。

步骤4：芝麻香堆积酒醅入窖发酵35d。

实施例6：芝麻香型白酒感官评价

步骤1：每个酒样由三名品评人员分三次进行品评。品评人员由国家级评酒委员和省级评酒委员组成。芝麻香型酒样稀释酒度至55°在20℃的品评环境下进行品评。

步骤2：感官评价从色、香、味、风格四个方面进行打分品评，色(10分)，香(25分)，味(45分)，格(15分)。

步骤3：特征香1：酒杯中的酒样倒干后放置1h品评杯中的特征香(10分)。特征香2：酒杯中的酒样倒干后放置10h后品评杯中的特征香(+，有特征香；-，无特征香)。

感官品评结果见表3。产特征香地衣芽孢杆菌应用于芝麻香白酒生产工艺中后，特征香更突出，且能够维持10h以上。

表3应用菌株生产芝麻香白酒的感官品评结果

实施例7：芝麻香型白酒香气成分分析

步骤1：20mL顶空瓶中加入8mL稀释至酒精度10％vol的酒样，进行HS-SPME和GC-MS分析。采用标准品及其标准曲线进行成分定性与定量，风味成分见表4。产特征香地衣芽孢杆菌能够明显提高芝麻香白酒中的酯、酸、芳香环、苯酚、吡嗪类化合物物质的浓度。

表4应用菌株生产芝麻香酒样的风味成分

Claims (8)

1.特征香高效产生地衣芽孢杆菌，来源于中国白酒高温大曲，其分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，已于2010年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC NO：3961，CGMCC NO：3962，CGMCC NO：3963。

2.权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于所述芽孢杆菌能耐受60℃高温生长。

3.权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于所述芽孢杆菌能发酵麸皮、大麦、小麦、高粱一种及其不同比例组合制成的液体和固态培养基，产生明显的酱香香气。

4.权利要求3所述的芽孢杆菌，其特征在于所述液体培养基的发酵条件为30～60℃，0～200rpm，发酵2～10天。

5.根据权利要求3所述的芽孢杆菌，其特征在于所述固体培养基的发酵条件为30～60℃，发酵5～15天。

6.权利要求1所述芽孢杆菌在中国白酒生产工艺中的应用。

7.权利要求6所述的应用，其特征在所述芽孢杆菌以液体或固体培养物形式接种于白酒大曲、堆积醅或窖池发酵酒醅中，菌株以单独接种或按不同混合比例接种，菌株液体培养物总接种量为0.1％～20％(v/w)，菌株固体培养物总接种量为0.1％～20％(w/w)。

8.权利要求7所述的应用，其特征在所述芽孢杆菌应用生产的白酒品质提高，特征香香气更突出且更持久，同时，白酒中的酯、酸、芳香环、苯酚、吡嗪类风味物质的浓度提高。