CN112342168A - 一株地衣芽孢杆菌及其促进酱油发酵增香的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物及酱油调味品发酵领域，具体公开了一株地衣芽孢杆菌及其在传统酱油酿造中的应用。本发明提供的地衣芽孢杆菌Mut‑148，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.20896，保藏日期2020年10月15日。该菌株由从四川省泸州市先市酱油酱醅所筛野生产香芽孢杆菌XS‑4通过常压室温等离子体诱变所得，在NB琼脂培养基上生长良好，主要发酵特征满足酱油发酵添加剂的要求，适用于酱油酱醅发酵。在体外模拟高盐体系中具有在高盐环境下分解蛋白质、淀粉、纤维素等大分子的能力，运用于传统酿造酱油，能够缩短酿造时间并增添酱油香气，有望提升传统酱油品质和降低成本。

Description

一株地衣芽孢杆菌及其促进酱油发酵增香的应用

技术领域

本发明涉及微生物及酱油调味品发酵领域，具体涉及地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）Mut-148及其在促进酱油发酵及增香方面的应用。

背景技术

酱油是一种用大豆或者豆粕作为蛋白质原料，面粉或麸皮作为淀粉原料，经微生物发酵一定时间后得到的传统调味品，因味道鲜美可口，色泽红润，具有特殊的酱香，能激发人们的食欲，因而备受全世界尤其是亚洲人们的喜爱。

酱油酿造的关键工艺——制曲和发酵，均与微生物的代谢活动密切相关，其中酱醅发酵是以鲁氏酵母（Saccharomyces rouxii）等酵母菌和芽孢杆菌属（Bacillus）的细菌为主体的混合菌群发酵体系，在稀醪状态下代谢产生醇、酯、酸、酮、醛、酚和杂环类化合物等物质，赋予酱油特殊的风味。芽胞杆菌作为传统发酵食品中常见的微生物，具有良好的耐受性和蛋白酶及淀粉酶分泌能力，在发酵中能促进原料降解且提升发酵食品风味。现已有研究报道，高产谷氨酰胺酶的芽胞杆菌能提升酱油氨态氮的含量，也有研究以降低酱油中有害物质氨基甲酸乙酯为目的筛选出能分解精氨酸生成鸟氨酸而不积累氨基甲酸乙酯前体物质瓜氨酸的芽孢杆菌。随着对酱油发酵过程中微生物群落结构研究的深入，发现芽胞杆菌也是酱醅中的优势菌群，在发酵过程中发挥重要的作用。目前针对芽孢杆菌的产香特征的研究主要是以酱香型白酒的酿造大曲中所存在的芽孢杆菌为研究对象，对芽孢杆菌增加酱香及功能因子的贡献已有研究，而对酱油发酵中芽孢杆菌的产香能力相关报道较少。

前期本实验室在针对先市酱油发酵酱醅微生物群落的研究结果中发现酱醅中的野生芽孢杆菌作为酱醅发酵后期的优势菌株，对酱醅发酵后期酱油香气的形成起到一定贡献。鉴于此，芽胞杆菌对酱油发酵的呈味增香有一定贡献，具有研究价值。

目前，酱油酿造就发酵启动方法和发酵所处环境而言，可分为传统的天然晒露工艺和现代的人工接菌温酿工艺；按原料发酵状态来分，主要可分为高盐稀态发酵工艺、无盐固态发酵工艺、低盐固态发酵工艺、高盐固态发酵工艺等。天然晒露工艺作为传统酱油酿制方法，是中华农耕文明孕育的民间技艺，但当今主流酱油市场已逐渐被现代工艺所覆盖，现代工艺酱油多采用人工接菌技术，具有耗时短，且质量稳定、重复的优点，但长此以往，会使产品的同质化效应加剧，同时工业化生产的酱油也存在香气不足等缺陷。以天然晒露技艺为依托的传统酿造酱油以大豆及小麦（或小麦粉）、麸皮为原料，利用环境中的微生物进行缓慢的天然制曲和自然发酵，所涉及到的微生物区域性强，发酵启动慢且发酵时间长，此类酱油产品的生产周期会长达2年及以上，某些酱油产品从投料到成品甚至会花费三至五年，因此所耗成本高昂。然而通过该酿造方式所得酱油品质优良，香气丰富，现代速酿工艺并不能够完全取代。在现代工艺覆盖市场的今天，它的生存空间越来越小，已高度濒危，亟待拯救。

因此，通过可行的方法筛选出同时具有促进酱醅发酵能力和产香能力的优秀芽孢杆菌菌株于酱油醅料发酵前期添加，菌株产生的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶能够促进酿造原料中的大分子物质——大豆蛋白、淀粉类物质分解为氨基酸和还原糖类，而氨基酸和还原糖类物质又作为美拉德反应的底物，因此能够加快美拉德反应的进行，推动酱油的整个酿造过程，旨在弥补传统酿造酱油因采用天然晒露发酵方法而导致酱油发酵时间偏长的不足；且优秀菌株也能够为后期酱油香气的形成起到一定贡献作用，为酱油增添风味。另一方面，虽然现已有技术公开枯草芽孢杆菌与其他菌复合用于酱油发酵添加剂，但实则难以保证多种外源菌的添加是否会导致酱醅原生微生物生态平衡的改变，而本发明只通过一株地衣芽孢杆菌的添加即可同时达到促进酱油发酵和产香两种目的，且该菌株筛选自酱醅，其添加不会造成酱醅原微生物生态平衡的改变，具有明显运用潜力优势。

已有针对酱油分离芽孢杆菌产酶及芽孢杆菌产酱香的研究报道如下：1）吴博华，促酱醪发酵芽胞杆菌的筛选及应用[J/OL].食品科学:1-12。作者用酪素平板法从高盐稀态酱醪中筛选出 56 株蛋白酶酶活较好的菌株，牛津杯法复筛后制曲测定酶活，分别筛选出3株淀粉酶酶活最高、蛋白酶酶活最高及纤维素酶活最高的菌株，经鉴定都为芽孢杆菌属。分别将3株试验菌与对照菌枯草芽胞杆菌 CS1.03 单独进行制曲后盐卤发酵，SPME-GC-MS 定性分析发酵酱油发现，3 株试验菌与对照菌均具有产生吡嗪类物质及其前体乙偶姻和 2,3-丁二醇的优势，但该文所筛为3株芽孢杆菌分别高产蛋白、淀粉酶及纤维素酶，单株菌的运用价值相对较低。2）卢君，应用功能微生物菌剂提高酱香白酒窖面酒质量的研究[J].酿酒科技，2018(08):73-79。从“国台酒-细菌菌种库”中筛选出功能芽孢杆菌属的菌株，采用感官评价的方法筛选出可能提高窖面酒质量的功能菌株，筛选到A29、A27、B12和M2四株菌株表现出突出的感官特征，即具有产酱香能力，应用四株强化功能芽孢杆菌菌株 A27、A29、M2、B12制作的菌剂能够有效提高窖面酒的质量。但该文中也提到，所筛选出的芽孢杆菌菌株表现为酱香特征非常明显，但其糖化力很低，蛋白酶的活性也较低，综合来讲运用潜力较低。3）罗建超，大曲中产酱香芽孢杆菌的筛选及其代谢产香探析[J].酿酒科技，2012(05):35-40。对茅台酒生产各环节所采集的 28 个样品进行了初步分析，用麦曲模仿升温发酵筛选产香的菌株，经鉴定分别为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等，筛选出产酱香优良的菌株 25株，在大曲发酵过程中能产生蛋白酶和淀粉酶等多种酶类和代谢物质，进而在高温、偏酸环境下通过美拉德反应能够产生吡嗪等多种茅台酒特征香味物质，但该实验结果仅建立在纯种发酵基础上。从以上文献报道进一步说明，鉴于目前的酱油发酵过程以芽孢杆菌作为酱油发酵添加剂的研究较少且不全面，因此，从传统酿制酱油中筛选并通过可行的方法得到能够同时产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶且具有产香能力的优秀芽孢杆菌，具有有利于缩短生产周期、节约发酵成本的潜力，并且能够保证酱油香气品质。因此本发明从先市酱油酱醅中得到的这株芽孢杆菌优势菌株，作为酱油发酵剂的运用具有可行性，对于推动传统古法酿制技艺和现代化产业的有机结合，也有十分重要的意义。

发明内容

本发明旨在针对传统酿造酱油生产时间偏长，以及现有单一芽孢杆菌用于酱油发酵不具有同时促进酱油发酵和产香能力的问题，提供一株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）Mut-148及其促进酱油发酵增香的应用，该地衣芽孢杆菌Mut-148同时满足在10%的高盐环境下分解蛋白质、淀粉和纤维素等大分子，且产香能力强，能够促进酱醅原料中大豆和小麦粉等大分子物质分解为氨基酸和还原糖类，而氨基酸和还原糖类物质又作为美拉德反应的底物，因此能够加快美拉德反应的进行，推动酱油的整个酿造过程，具有弥补传统酿制酱油发酵时间偏长这一不足的运用潜力；另一方面该地衣芽孢杆菌Mut-148具有产香能力，其代谢所产生的挥发性物质包含酱油香气形成的关键物质1-辛基-3-醇、愈创木酚和5-甲基-2-苯基-2-己烯醛等；也能够为后期酱油香气的形成起到一定贡献作用，为传统酿造酱油增添风味，有利于传统酿造酱油的酿造时间的缩短和酱油香气的增添，具有运用于传统酿造酱油实际生产的潜力。

本发明通过以下技术方案实现：本发明提供的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）Mut-148，于2020年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏编号CGMCC No.20896。

所述地衣芽孢杆菌Mut-148是以采集自四川省泸州市的先市酱油（发酵时间为2-3年）酿造酱醅中筛选到的一株具有产香能力的野生地衣芽孢杆菌XS-4（由本实验室前期筛选得到并且自命名的野生产香菌株）为起始菌株，对其进行具有安全性和可靠性的常压室温等离子体诱变（Atmospheric Room Temperature Plasma）后，经筛选得到的1株优秀诱变菌，即地衣芽孢杆菌Mut-148。

所述地衣芽孢杆菌Mut-148在Nutrient Broth（NB）琼脂培养基上生长良好，菌落形态为不规则状，形成具有堤状隆起的白色半透明大菌落，表面略湿润且有黏液。通过光学显微镜对其菌体形态进行观察，菌株以离散状态的短杆状营养体为主，有芽孢。

所述地衣芽孢杆菌Mut-148，通过采用自主设计引物gyrA F和gyrA R对其16SrDNA进行扩增，得到有965 碱基对（bp）组成的目的基因序列，如SEQUENCE LISTING 所示。将测序得到的基因序列输入NCBI数据库进行比对，其与Genebank中的Bacillus licheniformis标准菌株CP045814.1相似率达99.49%，可鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

所述地衣芽孢杆菌Mut-148的主要发酵特征满足酱油发酵剂的要求，高盐环境下具有蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶活性，能够耐受14% NaCl盐浓度和50℃的高温，并能够在pH3.0-9.0生长。在满足最适温度40℃、最适pH（pH=7）的条件下，其在24小时内的生长情况如下：从第4～8小时起，菌株逐渐进入对数期，生长旺盛，10小时后进入稳定期，菌株生长速率逐渐平稳，代谢产物积累。

进一步，为探究地衣芽孢杆菌Mut-148在高盐环境下在高盐环境下分解蛋白质、淀粉、纤维素等大分子的能力，本发明通过将地衣芽孢杆菌Mut-148接种到3种模拟高盐生长环境的体外体系，分别为盐浓度10%的酪素培养基、盐浓度10%的淀粉培养基和盐浓度10%的羧甲基纤维素钠培养基，通过牛津杯法测定菌株直径与水解圈直径之比，并证明所述地衣芽孢杆菌Mut-148在体外模拟的高盐体系中能够分解蛋白质、淀粉、纤维素等大分子。

又进一步，为探究地衣芽孢杆菌Mut-148对先市酱油酱香形成的影响，本发明通过将所述地衣芽孢杆菌Mut-148接种至发酵培养基中，并证实所述地衣芽孢杆菌Mut-148能够产生大量挥发性香气物质，包含酱油香气形成的关键物质1-辛基-3-醇、愈创木酚和5-甲基-2-苯基-2-己烯醛等。

以上研究结果表明，本发明提供的地衣芽孢杆菌Mut-148的主要发酵特征满足酱油发酵的要求，具有在高盐环境下分解蛋白质、淀粉、纤维素等大分子的能力，且能够在发酵培养基中产生挥发性香气物质1-辛基-3-醇、愈创木酚和5-甲基-2-苯基-2-己烯醛等；其中5-甲基-2-苯基-2-己烯醛即可卡醛，具有可可味；愈创木酚是烟熏味的重要代表；而1-辛基-3-醇则被广泛认为具有蘑菇香味，都属于已经被文献报道过的酱油风味重要组成物质。因此本发明提供的地衣芽孢杆菌Mut-148有运用于酱油实际生产的潜力。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：

1、本发明提供的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）Mut-148，以分离自四川省泸州市先市酱油酿造酱醅的野生产香芽孢杆菌XS-4为起始菌株，对其进行常压室温等离子体诱变（Atmospheric Room Temperature Plasma）后，经筛选所得到1株优秀诱变菌，即地衣芽孢杆菌Mut-148。与起始菌株XS-4相比，地衣芽孢杆菌Mut-148在10%高盐环境下对蛋白质、淀粉和纤维素等大分子分解能力均有一定程度提升，提升率分别为20.75%、27.43%和26.96%，具有较好的分解蛋白质、淀粉和纤维素等大分子的能力；在产挥发性香气物质方面，地衣芽孢杆菌Mut-148产苯乙醛、2-（2-呋喃基）-3-甲基-2-丁烯醛、1-辛基-3-醇和甲酸己酯等香气物质的能力优于起始菌株XS-4，同时地衣芽孢杆菌Mut-148所产的愈创木酚和5-甲基-2-苯基-2-己烯醛也是酱油香气组成关键成分。因此，可以认为地衣芽孢杆菌Mut-148较起始菌株XS-4在对于促进酱油发酵和产香方面的能力均有较大提升。

2、本发明提供的地衣芽孢杆菌Mut-148应用于传统酿造酱油，既能促进传统酱油酿造酱醅原料中大豆和小麦粉等大分子物质分解为氨基酸和还原糖类，而氨基酸和还原糖类物质又作为美拉德反应的底物，因此能够加快美拉德反应的进行，推动酱油的整个酿造过程，缩短了传统酿制酱油的发酵时间；另一方面该优秀诱变菌具有产香能力，也能够为后期酱油香气的形成起到一定贡献作用，为传统酿造酱油增添风味，而且该菌株筛选自酱醅，其添加不会造成酱醅原微生物生态平衡的改变，有望提升传统酱油品质和降低成本。

附图说明

图1为本发明地衣芽孢杆菌Mut-148在NB琼脂培养基的菌落形态图；

图2为本发明地衣芽孢杆菌Mut-148在光学显微镜下的经革兰氏染色后的细胞形态图；

图3为本发明地衣芽孢杆菌Mut-148耐盐曲线图。

图4为本发明地衣芽孢杆菌Mut-148温度耐受曲线图。

图5为本发明地衣芽孢杆菌Mut-148 pH耐受曲线图。

图6为本发明地衣芽孢杆菌 Mut-148所属起始诱变菌地衣芽孢杆菌XS-4在NB琼脂培养基的菌落形态图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明，但本发明的实施方式不限于此，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

以下为本发明实施例中所采用的培养基：

一、NB琼脂培养基：10g蛋白胨、3g牛肉浸粉、5g氯化钠、18g琼脂粉、1L蒸馏水，pH 值7.2±0.2，121℃灭菌15min。

二、主要发酵特征检测培养基：

1）10%盐浓度牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨 10g/L、牛肉膏 3g/L、琼脂 20g/L、NaCl100g/L，pH 7.0，121℃灭菌 20min；

2）10%盐浓度酪素培养基：干酪素 4g/L 于碱性条件下溶解后调节 pH 至中性，115℃灭菌 20min 后与 100g/L 盐浓度牛肉膏蛋白胨培养基混匀；

3）10%盐浓度淀粉培养基：取牛肉膏 5g/L、蛋白胨 10g/L、氯化钠 100g/L、可溶性淀粉2g/L、琼脂 20g/L，pH 7.0，121℃灭菌 20min；

4）10%盐浓度羧甲基纤维素钠培养基：CMC-Na 10g/L、磷酸二氢钾 1g/L、酵母粉 10g/L、蛋白胨 10g/L、氯化钠 100g/L、琼脂 20g/L、pH 7.0，121℃灭菌 20min；

5）耐盐实验培养基：同NB液体培养基，但再加入NaCl，使得NaCl的终浓度分别为8%、10%、12%、14%、16%。

6）发酵培养基：将黄豆粉、小麦粉、新鲜酱醅用缓冲液Na₂HPO₄/KH₂PO₄配置成缓冲体系，然后煮匀，搅拌后四层纱布过滤，调节pH=5～5.2，灭菌即得，其中每1L缓冲液Na₂HPO₄/KH₂PO₄中含有黄豆粉10g、小麦粉2.5g、新鲜酱醅50g。

上述培养基中所涉及的百分比，均为质量体积比。

下述实施例中所采用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1

地衣芽孢杆菌Mut-148的分离、培养及分子鉴定：

将本实验室前期从酱醅中所筛选出的野生产香芽孢杆菌XS-4（在NB琼脂培养基的菌落形态如图6所示）进行常压室温等离子体诱变（ARTP），具体操作步骤如下：

从平板挑取活化后的野生产香芽孢杆菌XS-4接于液体种子培养基中，37℃、200 r／min培养至对数生长期的中后期，取1 mL菌液测其OD值。根据OD值及菌落数的大体关系估算菌体浓度，取1 mL菌液8000 r／min离心2 min，收集沉淀并用生理盐水洗涤2～3次，将其稀释至10⁶ cfu／mL的菌悬液。

取上述菌悬液滴加到配套载片表面，滴加量为10μL，后至ARTP诱变系统中诱变，诱变参数如下：载气为氦气，输出功率120W，照射距离2mm，气体流速10(L/min^-1），照射时间分别为0s，30s，60s，90s，120s和150s。诱变后将金属载片放入装有1mL无菌水的EP管中，充分振荡混匀1 min，用PBS缓冲液将不同处理时间下的芽孢杆菌悬浮液梯度稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，制成稀释液，选择合适的稀释度用无菌涂布棒在 NB 平板上涂布，37℃下恒温培养2～3d。待菌落数目形成稳定后，根据培养基上的菌落形态和初步镜检观察，挑选不同的特征菌落进行培养，经筛选后得到本发明地衣芽孢杆菌Mut-148。

本发明地衣芽孢杆菌Mut-148经多次划线分离纯化之后，用相应的液体培养基进行增殖培养后，提取菌株基因组DNA，并使用所设计好的引物gyrA F、gyrA R对其gyrA基因进行扩增，扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃最终延伸10min。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳验证为单一条带，条带长度为1000bp左右，送出测序。

上述设计引物gyrA F和gyrA R由生工公司（上海）合成。gyrA F序列为CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3'，gyrA R序列为5-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3' 。

扩增片段测序长为965 bp，将测序得到的基因序列输入NCBI数据库进行比对，与Genebank中的Bacillus licheniformis标准菌株CP045814.1相似率达99.49%，鉴定菌株Mut-148为一株Bacillus licheniformis，即地衣芽孢杆菌。

将所述地衣芽孢杆菌Mut-148 划线于NB 琼脂培养基上，37℃倒置培养48 h后，对菌株的菌落形态进行观察。如图1所示，所述菌株Mut-148在NB培养基上生长良好，菌落为不规则状，形成具有堤状隆起的白色半透明大菌落，表面略湿润且有黏液。

对所述地衣芽孢杆菌Mut-148的菌体通过革兰氏染色方法进行光学显微镜观察，如图2所示，地衣芽孢杆菌Mut-148细胞呈离散状态的短杆状营养体为主，有芽孢。

实施例2

地衣芽孢杆菌Mut-148耐受特性探究：

1、耐盐试验：将地衣芽孢杆菌Mut-148接种至盐浓度分别为2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%的NaCl耐盐试验培养基中，37℃恒温培养24h后于600nm处测定OD值，绘制菌株对NaCl的耐受曲线。如图3所示。

2、不同温度生长情况：将地衣芽孢杆菌Mut-148接种到NB液体培养基中，分别在20℃、30℃、40℃、50℃下培养24h，600nm处测定OD值，绘制菌株对温度的耐受曲线，如图4所示。

3、不同pH生长情况：将地衣芽孢杆菌Mut-148接种到pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的NB液体培养基中，37℃培养24h，600nm处测定OD值，绘制菌株对pH的耐受曲线，如图5所示。

通过上述试验，检测到所述地衣芽孢杆菌Mut-148能够至少耐受14%NaCl盐浓度，并能够在pH 3.0-9.0和20～50℃生长。

实施例3

体外模拟体系探究地衣芽孢杆菌Mut-148在10%的高盐环境下分解蛋白质、淀粉、纤维素等大分子能力：

挑取地衣芽孢杆菌Mut-148纯培养菌株接种至100g/L盐浓度牛肉膏蛋白胨液体培养基培养，37℃培养12h，收集菌体，制备成OD值为0.8的菌悬液，取0.1mL菌悬液接种到插在100g/L盐浓度酪素培养基的牛津杯中，37℃恒温培养48h，测量水解圈直径与菌株直径。挑取优选得到的高蛋白酶活菌株，按照酪素培养基所述方法接种到插在100g/L盐浓度淀粉培养基、羧甲基纤维素钠培养基的牛津杯中，37℃恒温培养48h，将碘液喷洒在淀粉培养基上，测量淀粉水解圈直径与菌株直径，将1mg/mL刚果红溶液喷洒在羧甲基纤维素钠培养基上，染色1h后，用1mol/L NaCl溶液洗涤1h，测量纤维素水解圈直径与菌株直径，最后计算水解圈与菌株直径之比，即测定菌株的产酶能力；同时以诱变起始菌株XS-4作为对照。地衣芽孢杆菌Mut-148与对照起始菌株XS-4，在高盐环境的对蛋白质、淀粉和纤维素等大分子分解能力，结果如表1所示。与起始菌株XS-4相比，地衣芽孢杆菌Mut-148对蛋白质、淀粉和纤维素等大分子分解能力均有一定程度提升，提升率分别为20.75%、27.43%和26.96%。

说明：表1为地衣芽孢杆菌Mut-148在酪素培养基、淀粉培养基和羧甲基纤维素钠培养基上通过牛津杯法测定对蛋白质、淀粉和纤维素等大分子分解能力，结果为菌株生长直径和水解圈直径之比，其中XS-4为诱变起始菌株。结果可知，地衣芽孢杆菌Mut-148比起始菌株XS-4具有更强的大分子化合物分解能力。有利于提升酱油发酵过程中的原料利用率，提升酱油产品品质，缩短发酵时间。

实施例4

地衣芽孢杆菌Mut-148应用于模拟酱醅液体培养基发酵：

1、将培养至对数期的地衣芽孢杆菌Mut-148以4%的接种量接至发酵培养基中，在37℃下120rpm摇瓶培养8天，以10000r/min的转速离心10分钟，无菌条件下过滤收集发酵液。同时以诱变起始菌株XS-4按照同样的培养方法模拟酱醅液体培养基发酵作为对照；以未添加任何菌株的发酵培养基作为空白对照（BC）。

2、发酵培养液香气成分的HP-SPME-GC-MS分析：

所述发酵液的挥发性香气物质的检测方法为：准确吸取8mL发酵液样品于25mL顶空瓶中，加盖密封，将已完成老化的萃取头插入瓶子的顶空部分，于60℃的恒温水浴中萃取30min。样品通过HP-5MS型弹性石英毛细色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm）进行分离；程序升温条件为起始温度50℃，保持2min，以6℃每分钟升到200℃，再以10℃每分钟升至250℃，保持6min；载气为高纯氦气（1.0 mL/min）；不分流进样。质谱采用电子轰击电离源；电子能量70eV；离子源温度230℃；扫描范围50～550m/z。对采集到的质谱图利用NIST08和WILEY09谱库检索进行组分分析，并用气相色谱峰面积归一化法计算出各香气组分的相对含量，结果见表2。

说明：表2为地衣芽孢杆菌Mut-148接入发酵培养基，37℃下培养8天后通过HP-SPME-GC-MS检测发酵液中所含有的挥发性物质，其中BC为空白发酵培养基，XS-4为诱变起始菌株。

从表2可以看出，将地衣芽孢杆菌Mut-148接种至发酵培养基中于37℃下120rpm转速下摇瓶培养8天后，与未接种菌株的BC相比，能够产生大量挥发性香气物质，发酵液中包含酱油香气形成的关键物质1-辛基-3-醇、愈创木酚和5-甲基-2-苯基-2-己烯醛等；与接种起始菌株XS-4的发酵液比较，地衣芽孢杆菌Mut-148能产生酱油香气形成的关键物质1-辛基-3-醇等。由此说明本发明从先市酱油酱醅中得到的这株芽孢杆菌优势菌株Mut-148，可有效促进酱油发酵增香，对于传统酿造酱油具有重要的应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 泸州职业技术学院；四川大学

<120> 一株地衣芽孢杆菌及其促进酱油发酵增香的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 965

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）

<400> 1

AGCTGGACCA TTGTTTCCGC GGCATGAGTG TTCTCTTCCG GACGTAAGAG ACGGTCTGAA 60

GCCGGTGCAC AGAAGAATAT TGTATGCGAT GAACGACCTT GGGATGACAA GTGATAAGCC 120

GTATAAAAAA TCCGCGCGTA TTGTCGGCGA AGTTATCGGT AAGTACCACC CTCACGGTGA 180

TTCTGCTGTT TACGAAGCCA TGGTCAGAAT GGCGCAGGAT TTTAACTATC GGTACATGCT 240

CGTTCAAGGC CATGGAAACT TCGGTTCTGT TGACGGCGAC TCGGCTGCGG CCATGCGTTA 300

CACAGAAGCG AGAATGTCTA AAATATCAAT GGAAATTCTG CGCGACATCA ATAAAGACAC 360

AATCGATTAC CAGGACAACT ATGACGGTTC GGAAAAAGAG CCGGTTGTTA TGCCTGCGAG 420

ATTTCCGAAC TTGCTTGTCA ACGGAGCGGC CGGTATTGCT GTAGGTATGG CCACAAACAT 480

CCCGCCGCAT CAGCTCGGTG AAGTCATTGA CGGTGTTTTG GCGGTCAGCA AAAACCCTGA 540

TATCACGCTT CCGGAATTGA TGGAGATCAT TCCTGGACCC GACTTCCCTA CAGCAGGGCT 600

GATCTTGGGA AGAAGCGGTA TCCGAAAGGC CTATGAAACA GGCCGGGGAT CAATTACGCT 660

TCGAGCCAAA GCTCAAATCG AAGAAACATC TTCCGGCAAA CCGGTAATCA TTATTACGGA 720

AATACCGTAC CAAGTGAATA AAGCAAGGCT GATCGAAAAA ATCGCCGATC TAGTGCGCGA 780

TAAGAAAATC GACGGCATTA CGGATCTCCG CGATGAATCA GACCGAAACG GAATGCGCAT 840

CGTCATTGAA CTGAGAAGGG ATGCAAATGC CAATGTACTG TTAAATAACT TGTACAAGCA 900

GACCGCTCTT CAAACATCAT TTCGGCATTA ATCTTTTGGC GCTTGTTGAC GGCCAGCCGA 960

AATAT 965

Claims (4)

1. 一株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）Mut-148，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌于2020年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20896。

2. 如权利要求1所述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）Mut-148促进酱油发酵增香的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述酱油发酵增香中产生的香气物质至少包括1-辛基-3-醇、愈创木酚和5-甲基-2-苯基-2-己烯醛。

4. 如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）Mut-148快速发酵培养基为：将黄豆粉、小麦粉、新鲜酱醅用缓冲液Na₂HPO₄/KH₂PO₄配置成缓冲体系，然后煮匀，搅拌后四层纱布过滤，调节pH=5～5.2，灭菌即得；其中每1L缓冲液Na₂HPO₄/KH₂PO₄中含有黄豆粉10 g、小麦粉2.5 g、新鲜酱醅50g。

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