CN111621444A - 一株提高酿造酱油风味品质的克氏库克菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株提高酿造酱油风味品质的克氏库克菌及其应用，涉及食品微生物技术应用领域。该菌株已经在2019年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该菌株从传统高盐稀态酱油酱渣中分离得到，具有良好的耐盐与生长活力，有利于提升酱油中的3‑甲硫基丙醛、1‑辛烯‑3‑醇、苯乙醛、乙酸乙酯等多种香气物质的产生，适合应用于传统食品发酵过程。以本发明所提供的菌株参与的酱油酱香浓郁，口感醇厚，有助于酱油品质得到进一步提升。
Description
技术领域
本发明适用于食品微生物技术应用领域，尤其涉及一株提高酿造酱油风味品质的克氏库克菌及其应用。
背景技术
酱油发展历史悠久，距今已有几千年的历史，且在东亚地区，如中国、日本、韩国、泰国等地广受欢迎，是亚洲市场消费最为广泛的调味品之一。高盐稀态酱油的香气复杂丰富，其中包含了酯香、花果香、焦糖香、烤土豆香等多种香气成分。这些风味效果是当下酱油品质评价的关键性标准之一。酱油的发酵风味受到发酵过程中多种生物化学反应的影响，其中微生物的代谢影响占到了主体影响之一。
当下大量学者研究了酱油发酵过程中核心菌群的对酱油品质的影响，如Seul GiLee等得到一株枯草芽孢杆菌，能在韩国豆制品中增进感官特性，并抑制有害菌蜡状芽孢杆菌的增殖(Lee S G,Chang H C.Assessment of Bacillus subtilis SN7 as a starterculture for Cheonggukjang,[J].Food Control,2016:2-31.)。也有人就嗜盐四联球菌在熏肉等多种发酵食品中起到的效果进行探究起到关键作用(Hu M,Yu J,Yu J,etal.Isolation and Screening of StaphylococcusXylosus P2 fromChinese Bacon:ANovel Starter Culture in FermentedMeat Products[J].International Journal ofFood,2018:1-7.)。对相关文献进行了解后，我们发现这些研究尚停留在鲁氏酵母、嗜盐四联球菌、枯草芽孢杆菌等常用菌株上面，尚未对酱油发酵过程中参与的其他细菌进项相关特性的探索和研究。如克氏库克菌，目前就没有被应用于酱油发酵方面，但在其他发酵食品中，冯镇等(冯镇；石景春.一种腐乳专用生产发酵剂及其制备方法[P].中国专利：CN102827771A,2012-12-19)就曾以克氏库克菌作为菌株发酵剂原料应用在腐乳的生产中。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供了一株提高酿造酱油风味品质的克氏库克菌。
本发明的意义是通过了解克氏库克菌的特性，通过选择合适的菌株添加量、添加时间和培养温度，靶向提升酱油中活性香气物质的含量，以实现现阶段酱油风味与品质的提升。
本发明通过比较酱油发酵体系中的各类微生物的风味影响情况，从中得到一株能提升酱油酿造风味的发酵细菌。
本发明是基于当前市售酱油为了调配口感，需要额外添加食用香精的现状，从酱渣出发，找到能提升酱油品质风味的的新菌株。筛选所得克氏库克菌于2019年11月26日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所。
本发明提供的克氏库克菌，其命名为Kocuria kristinae，保藏编号为CGMCCNo.19009，于2019年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所。
本发明提供的克氏库克菌(Kocuria kristinae)属于革兰氏阳性菌，大小为0.5-3.5μm，呈球状，无鞭毛。
本发明提供的克氏库克菌(Kocuria kristinae)分离自工厂发酵酱油酱渣，所述分离包括：梯度稀释筛选，厌氧筛选，纯培养纯化，16s rDNA鉴定及功能性筛选。
本发明提供的克氏库克菌(Kocuria kristinae)，其16s rDNA核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
本发明提供的克氏库克菌能够应用在提高酿造酱油风味品质中。
本发明提供的克氏库克菌在提高酿造酱油风味品质中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)泡豆与蒸煮：挑选颗粒感饱满的大豆，将大豆加入清水中，进行浸泡处理，然后将黄豆取出并升温进行蒸煮处理，得到熟豆；
(2)混料与拌曲：(2)将步骤(1)所述熟豆冷却至32-45℃，加入面粉和曲精后混合均匀，得到大曲，把大曲进行固态发酵，得到成曲；
(3)酱醪的发酵与目标菌的接入：将步骤(2)所述成曲与盐水混合均匀，得到酱醪，并进行第一段自然发酵；然后接种所述克氏库克菌，随后加入球拟酵母，进行第二次自然发酵处理，得到生酱油；
(4)过滤和灭菌：将步骤(3)所述生酱油进行灭菌处理，过滤取滤液，得到风味品质提高后的酱油(澄清液体)。
进一步地，步骤(1)所述大豆与水的质量比为1:2.2-2.5；所述浸泡处理的时间为6-10h。
进一步地，步骤(1)所述蒸煮处理的蒸煮压力为0.1-0.12MPa，蒸煮处理的温度为121-125℃，蒸煮处理的时间为10-15min。
进一步地，步骤(2)所述面粉与步骤(1)所述大豆的质量比为1:4；按照干重计，步骤(2)所述曲精的接种量为大豆与面粉两者总质量的0.04％-0.50％。所述曲精采用活性良好的米曲霉。
进一步地，步骤(2)所述固态发酵包括：先在28-30℃下培养16-24h，再在26-28℃下培养16-26h；其中，在固态发酵开始后14-18h时完成一次翻曲，然后在第一次翻曲后的4-7h时完成第二次翻曲。
进一步地，步骤(3)所述盐水的质量百分比浓度为18wt％-22wt％；步骤(2)所述大曲与步骤(3)所述盐水的质量比为1:1.8-1:2.5；步骤(3)所述初步发酵处理的温度为15-20℃。
优选地，步骤(3)所述第一段自然发酵的时间为15-30天。
优选地，步骤(3)所述酱醪的第一段自然发酵和第二段自然发酵的温度，以室温的日晒夜露为最适温度。
进一步地，步骤(3)所述克氏库克菌的接种量为104-106CFU/mL；所述球拟酵母的接种量为104-106CFU/mL；所述第二段自然发酵的温度为15-20℃，二次发酵处理的时间为50-90d。
优选地，步骤(3)所述第二段自然发酵，从初步发酵开始计，发酵至90d为止。
进一步地，步骤(4)所述灭菌处理的温度为80-100℃，所述灭菌处理的时间为0.3-0.8h。
本发明利用克氏库克菌酿造的酱油，可通过顶空固相微萃取法分析酱油中的挥发性物质情况，重点分析其中的风味活性物质，以测定其中的风味物质。所述顶空固相微萃取法包括：取样品放入顶空进样瓶中，调节到270g/L盐浓度并选用萃取头CAR/PDMS完成香气萃取工作。
本发明利用克氏库克菌酿造的酱油，可通过感官评价小组确定酱油的风味变化情况，采用定量感官描述法(QDA)进行。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明提供的克氏库克菌适用于酿造高盐稀态酱油，其能显著提升酱油中的3-甲硫基丙醛、1-辛烯-3-醇、苯乙醛及乙酸乙酯等物质，能增强酱油的烤土豆香、蘑菇香和花香果香等气味，使得整体风味更协调，更持久。
附图说明
图1为克氏库克菌的镜检观察结果图；
图2为实施例1用克氏库克菌菌株发酵的酱油的色谱图；
具体实施方式
1.菌株的分离筛选
以传统发酵的新鲜酱渣为原料，酱渣来自于合作酱油厂家，从酱渣中分离得到克氏库克菌，克氏库克菌的分离纯化使用MRS固体培养基。使用无菌水进行一定倍数稀释后涂布到培养基上，37℃下培养48h，挑取有代表性的菌株分离纯化，进行形态学观察后储存到甘油管中保存。
2.菌株的鉴定
2.1菌株的形态特征
克氏库克菌为革兰氏阳性菌，菌体呈球状(见图1)，37℃下培养24h后形成平滑、轻度隆起、边缘整洁湿润的白色不透明小菌落(见表1)。在MRS液体培养基中培养9-12h，进入对数生长期。
表1
2.2菌株的生理特征
该菌株具有良好耐盐性，在加盐体系中生长量变化不显著。同时能有效利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、半乳糖和可溶性淀粉等碳源，以及蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨等氮源。蛋白酶活较弱，而产酸能力较强。
2.3分子生物学鉴定
对实验室分离得到的克氏库克菌进行16s rDNA测序，对测序结果进行比对后确定为克氏库克菌(Kocuria kristinae)，菌株的16s rDNA序列，如SEQ ID NO.1所示。
该克氏库克菌于2019年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.19009。
以下实施例和对照例酿造的酱油，可通过顶空固相微萃取法分析酱油中的挥发性物质情况，以测定其中的风味物质。所述顶空固相微萃取法包括：取样品放入顶空进样瓶中，以NaCl调节到270g/L盐浓度并选用萃取头CAR/PDMS完成香气萃取工作。
实施例1
所述克氏库克菌在提高酿造酱油风味品质中的应用，包括如下步骤：
(1)泡豆与蒸煮：挑选颗粒感饱满的大豆，所述大豆与水的质量比为1:2.5，用清水浸泡6h，待浸泡充分后，得到浸泡后的混合液，在高温高压下完成蒸煮，得到熟豆。调控蒸煮时间在15min，蒸煮的温度为121℃。
(2)混料与拌曲：将步骤(1)得到的熟豆冷却到40℃，拌入面粉曲精混合原料，面粉与步骤(1)所述大豆的质量比是1:4，所使用的曲精采用活性良好的米曲霉，曲精的接种量控制在干大豆与面粉总重的0.05％，三者混合均匀，得到大曲。
(3)大曲的培养：将大曲放于培养箱中固态培养45h，前22h温度设置为30℃，后23h设置为28℃，同时在固态培养开始后的第16h、22h时进行翻曲操作，得到成曲。
(4)酱醪的发酵与目标菌的接入：将步骤(3)所得的成曲，按步骤(3)所述大曲与盐水按体积比为1:2.5的比例加入浓度为18wt％的盐水，混合均匀，得到酱醪；将所述的酱醪常温发酵到5d时接入104CFU/mL克氏库克菌，并在随后加入104CFU/mL球拟酵母，继续常温发酵到90d，过滤得到生酱油。
(5)过滤和灭菌：将步骤(4)得到的生酱油在80℃条件下灭菌0.8h，过滤得到澄清液体后得到成品酱油。
(6)风味物质的测定：取样品8mL放入顶空进样瓶中，用NaCl调节到合适盐浓度270g/L，并选用萃取头完成香气萃取工作。
(7)感官评定：由8名感官评价人员(男3，女5)组成感官品评小组确定酱油的风味变化情况，评价方法参考冯云子文献(冯云子.高盐稀态酱油关键香气物质的变化规律及形成机理的研究[D].华南理工大学,2015.)中的感官评价方法。
对照例1：不接种克氏库克菌，其余条件相同，得到空白样品1。
图2为用克氏库克菌菌株发酵的酱油的色谱图；相比于对照例1，实施例1能显著提升酱油部分香气活性化合物的含量，如乙酸、3-甲硫基丙醛、乙酸乙酯、苯乙醛等，分别提升156％，195％，75％，85％。同时在感官评价上，花香果香评分更高，整体风味效果更为醇厚香甜。
实施例2
所述克氏库克菌在提高酿造酱油风味品质中的应用，包括如下步骤：
(1)泡豆与蒸煮：挑选颗粒感饱满的大豆，所述大豆与水的质量比为1:2.5，用清水浸泡8h，待浸泡充分后，得到浸泡后的混合液，在高温高压下完成蒸煮，得到熟豆。调控蒸煮时间在15min，蒸煮的温度为121℃。
(2)混料与拌曲：将步骤(1)得到的熟豆冷却到40℃，拌入面粉曲精混合原料，面粉与步骤(1)所述大豆的质量比是1:4，所使用的曲精采用活性良好的米曲霉，曲精的接种量控制在干大豆与面粉总重的0.04％，三者混合均匀，得到大曲。
(3)大曲的培养：将大曲放于培养箱中固态培养45h，前22h温度设置为30℃，后23h设置为28℃，同时在固态培养开始后的第16h、22h时进行翻曲操作，得到成曲。
(4)酱醪的发酵与目标菌的接入：将步骤(3)所得的成曲，按步骤(3)所述大曲与盐水按体积比为1:1.8的比例加入浓度为18wt％的盐水，混合均匀，得到酱醪；将所述的酱醪常温发酵到20d时接入105CFU/mL克氏库克菌，并在随后加入105CFU/mL球拟酵母，继续常温发酵到90d，过滤得到生酱油。
(5)过滤和灭菌：将步骤(4)得到的生酱油在80℃条件下灭菌0.8h，过滤得到澄清液体后得到成品酱油。
(6)风味物质的测定：取样品8mL放入顶空进样瓶中，用NaCl调节到合适盐浓度270g/L，并选用萃取头完成香气萃取工作。
(7)感官评定：由8名感官评价人员(男3，女5)组成感官品评小组确定酱油的风味变化情况，评价方法参考冯云子文献(冯云子.高盐稀态酱油关键香气物质的变化规律及形成机理的研究[D].华南理工大学,2015.)中的感官评价方法。
对照例2：不接种克氏库克菌，其余条件相同，得到空白样品2。
相比于对照例2，实施例2能显著提升酱油部分香气活性化合物的含量，如乙酸、3-甲硫基丙醛、乙酸乙酯、苯乙醛等，分别提升135％，56％，33％，52％，整体风味有所改善。
实施例3
所述克氏库克菌在提高酿造酱油风味品质中的应用，包括如下步骤：
(1)泡豆与蒸煮：挑选颗粒感饱满的大豆，所述大豆与水的质量比为1:2.2，用清水浸泡6h，待浸泡充分后，得到浸泡后的混合液，在高温高压下完成蒸煮，得到熟豆。调控蒸煮时间在10min，蒸煮的温度为121℃。
(2)混料与拌曲：将步骤(1)得到的熟豆冷却到40℃，拌入面粉曲精混合原料，面粉与步骤(1)所述大豆的质量比是1:4，所使用的曲精采用活性良好的米曲霉，曲精的接种量控制在干大豆与面粉总重的0.05％，三者混合均匀，得到大曲。
(3)大曲的培养：将大曲放于培养箱中固态培养45h，前22h温度设置为30℃，后23h设置为28℃，同时在固态培养开始后的第16h、22h时进行翻曲操作，得到成曲。
(4)酱醪的发酵与目标菌的接入：将步骤(3)所得的成曲，按步骤(3)所述大曲与盐水按体积比为1:2.0的比例加入浓度为18wt％的盐水，混合均匀，得到酱醪；将所述的酱醪常温发酵到5d时接入106CFU/mL克氏库克菌，并在随后加入106CFU/mL球拟酵母，继续常温发酵到50d，过滤得到生酱油。
(5)过滤和灭菌：将步骤(4)得到的生酱油在80℃条件下灭菌0.8h，过滤得到澄清液体后得到成品酱油。
(6)风味物质的测定：取样品8mL放入顶空进样瓶中，用NaCl调节到合适盐浓度270g/L，并选用萃取头完成香气萃取工作。
(7)感官评定：由8名感官评价人员(男3，女5)组成感官品评小组确定酱油的风味变化情况，评价方法参考冯云子文献(冯云子.高盐稀态酱油关键香气物质的变化规律及形成机理的研究[D].华南理工大学,2015.)中的感官评价方法。
对照例3：不接种克氏库克菌，其余条件相同，得到空白样品3。
相比于对照例3，实施例3能显著提升酱油部分香气活性化合物的含量，如乙酸、3-甲硫基丙醛、乙酸乙酯、苯乙醛等，分别提升466％，157％，95％，42％。其中乙酸提升量较大，酱油样品pH有所下降，风味感官虽有提升，但微偏向酸味。
实施例4
所述克氏库克菌在提高酿造酱油风味品质中的应用，包括如下步骤：
(1)泡豆与蒸煮：挑选颗粒感饱满的大豆，所述大豆与水的质量比为1:2.2，用清水浸泡6h，待浸泡充分后，得到浸泡后的混合液，在高温高压下完成蒸煮，得到熟豆。调控蒸煮时间在10min，蒸煮的温度为121℃。
(2)混料与拌曲：将步骤(1)得到的熟豆冷却到40℃，拌入面粉曲精混合原料，面粉与步骤(1)所述大豆的质量比是1:4，所使用的曲精采用活性良好的米曲霉，曲精的接种量控制在干大豆与面粉总重的0.04％，三者混合均匀，得到大曲。
(3)大曲的培养：将大曲放于培养箱中固态培养45h，前22h温度设置为30℃，后23h设置为28℃，同时在固态培养开始后的第16h、22h时进行翻曲操作，得到成曲。
(4)酱醪的发酵与目标菌的接入：将步骤(3)所得的成曲，按步骤(3)所述大曲与盐水按体积比为1:1.8的比例加入浓度为18wt％的盐水，混合均匀，得到酱醪；将所述的酱醪在15-20℃下发酵到5d时接入104CFU/mL克氏库克菌，并在随后加入104CFU/mL球拟酵母，继续常温发酵到90d，过滤得到生酱油。
(5)过滤和灭菌：将步骤(4)得到的生酱油在100℃条件下灭菌0.3h，过滤得到澄清液体后得到成品酱油。
(6)风味物质的测定：取样品8mL放入顶空进样瓶中，用NaCl调节到合适盐浓度270g/L，并选用萃取头完成香气萃取工作。
(7)感官评定：由8名感官评价人员(男3，女5)组成感官品评小组确定酱油的风味变化情况，评价方法参考冯云子文献(冯云子.高盐稀态酱油关键香气物质的变化规律及形成机理的研究[D].华南理工大学,2015.)中的感官评价方法。
对照例4：不接种克氏库克菌，其余条件相同，得到空白样品4。
相比于对照例4，实施例4能显著提升酱油部分香气活性化合物的含量，如乙酸、3-甲硫基丙醛、乙酸乙酯、苯乙醛等，分别提升123％，142％，68％，63％，整体风味有所提升，烤土豆香明显，香气更为持久。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 华南理工大学
广州现代产业技术研究院
<120> 一株提高酿造酱油风味品质的克氏库克菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1427
<212> DNA
<213> 克氏库克菌(Kocuria kristinae)
<400> 1
tggggggggt gcttacacat gcaagtcgaa cgctgaagcc tggtgcttgc accgggtgga 60
tgagtggcga acgggtgagt aatacgtgag tgacctgcct ttgactctgg gataagcctg 120
ggaaactggg tctaataccg gatgcgacta ctgcccgcat gggctggtgg tggaaagggt 180
tatgtactgg tcttagatgg gctcacggcc tatcagctgg ttggtggggt aatggcctac 240
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cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca gcagggaaga 420
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aatacgtagg gcgcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagagctcg taggcggctt 540
gtcgcgtctg ctgtgaaagc ccggggctta actccgggtg tgcagtgggt acgggcaggc 600
tagagtgcag taggggtaac tggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg 660
aggaacaccg atggcgaagg caggttactg ggctgttact gacgctgagg agcgaaagca 720
tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgttg ggcactaggt 780
gtgggggaca ttccacgttt tccgcgccgt agctaacgca ttaagtgccc cgcctgggga 840
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tgcggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttaccaagg cttgacatac accggatcgt 960
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gcacgtgatg gtggggactc ataggagact gccggggtca actcggagga aggtggggat 1140
gacgtcaaat catcatgccc cttatgtctt gggcttcacg catgctacaa tggccggtac 1200
aatgggttgc gatactgtga ggtggagcta atcccaaaaa gccggtctca gttcggattg 1260
gggtctgcaa ctcgacccca tgaagtcgga gtcgctagta atcgcagatc agcaacgctg 1320
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca agtcacgaaa gttggtaaca 1380
cccgaagccg atggcctaac ccttgtggag ggagtccttc gaaaggg 1427
Claims (10)
1.一种克氏库克菌，其特征在于，命名为Kocuria kristinae，保藏编号为CGMCCNo.19009，于2019年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所。
2.权利要求1所述的克氏库克菌在提高酿造酱油风味品质中的应用。
3.根据权利要求2所述的克氏库克菌在提高酿造酱油风味品质中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将大豆加入水中，进行浸泡处理，然后将黄豆取出，升温进行蒸煮处理，得到熟豆；
(2)将步骤(1)所述熟豆冷却至32-45℃，加入面粉和曲精后混合均匀，得到大曲，把大曲进行固态发酵，得到成曲；
(3)将步骤(2)所述成曲与盐水混合均匀，得到酱醪，并进行第一段自然发酵；然后接种所述克氏库克菌，随后加入球拟酵母，进行第二段自然发酵处理，得到生酱油；
(4)将步骤(3)所述生酱油进行灭菌处理，过滤取滤液，得到风味品质提高后的酱油。
4.根据权利要求3所述的克氏库克菌在提高酿造酱油风味品质中的应用，其特征在于，步骤(1)所述大豆与水的质量比为1:2.2-2.5；所述浸泡处理的时间为6-10h。
5.根据权利要求3所述的克氏库克菌在提高酿造酱油风味品质中的应用，其特征在于，步骤(1)所述蒸煮处理的蒸煮压力为0.1-0.12MPa，蒸煮处理的温度为121-125℃，蒸煮处理的时间为10-15min。
6.根据权利要求3所述的克氏库克菌在提高酿造酱油风味品质中的应用，其特征在于，步骤(2)所述曲精为米曲霉；步骤(2)所述面粉与步骤(1)所述大豆的质量比为1:4；按照干重计，步骤(2)所述曲精的接种量为大豆与面粉两者总质量的0.04％-0.05％。
7.根据权利要求3所述的克氏库克菌在提高酿造酱油风味品质中的应用，其特征在于，步骤(2)所述固态发酵包括：先在28-30℃下培养16-24h，再在26-28℃下培养16-26h；其中，在固态发酵开始后14-18h时完成一次翻曲，然后在第一次翻曲后的4-7h时完成第二次翻曲。
8.根据权利要求3所述的克氏库克菌在提高酿造酱油风味品质中的应用，其特征在于，步骤(3)所述盐水的质量百分比浓度为18％-22％；步骤(2)所述大曲与步骤(3)所述盐水的体积比为1:1.8-1:2.5；步骤(3)所述第一段自然发酵的温度为15-20℃，第一段自然发酵的时间为15-30d。
9.根据权利要求3所述的克氏库克菌在提高酿造酱油风味品质中的应用，其特征在于，步骤(3)所述克氏库克菌的接种量为104-106CFU/mL；所述球拟酵母的接种量为104-106CFU/mL；所述第二段自然发酵处理的温度为15-20℃，第二段自然发酵处理的时间为50-90d。
10.根据权利要求3所述的克氏库克菌在提高酿造酱油风味品质中的应用，其特征在于，步骤(4)所述灭菌处理的温度为80-100℃，所述灭菌处理的时间为0.3-0.8h。
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