CN117247868B - 一种嗜根考克氏菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嗜根考克氏菌及其应用，属于发酵工程技术领域。该菌种保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为：CGMCC No.27273，保藏日期为：2023年05月06日，保藏地址为：中国北京市中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为嗜根考克氏菌，命名为：QIMR‑Kr‑1。本发明提供了一种嗜盐、高蛋白酶活性、发酵增香的菌种，能够用于传统酿造调味品的发酵，并实现发酵产品质量控制。

Description

一种嗜根考克氏菌及其应用

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体地说，尤其涉及一种嗜根考克氏菌及其应用。

背景技术

鱼露、虾露是以海产品为优质氮源经长期发酵获得的食品，由于其特有的海鲜风味，常常被用作提鲜的调味品和调味汁，拥有较广的消费市场。现有的鱼露、虾露通过将海产品与大量盐混合发酵得到，经过长时间的发酵/熟化，海产品中的蛋白质一方面由其自身的自溶酶降解，一方面由在高盐环境下、多种微生物共同参与下，嗜盐菌对原料虾中的蛋白质、脂肪等进行分解发酵。但是，鱼露、虾露发酵时间长且发酵过程容易受所涉及的微生物种类及状态影响，且各种细菌的污染通常伴随令人难以接受的风味。

针对传统鱼露、虾露发酵时间长、产品质量不稳定等技术难题，亟需寻找一种快速、可控的发酵方式。高密度接种单一或混合菌种一方面能够迅速提升发酵速度，另一方面能够调节自然发酵过程中的菌落结构，为改善发酵产品质量不稳定性奠定基础。此外，接种优质的菌种能够极大程度上提升发酵产品质量，改善发酵产品风味。

发明内容

本发明的目的在于提供一种嗜根考克氏菌，另一目的是提供该嗜根考克氏菌的应用，以弥补现有技术的不足。

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种嗜根考克氏菌，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为：CGMCC No.27273，保藏日期为：2023年05月06日，保藏地址为：中国北京市中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为嗜根考克氏菌Kocuria rhizophila，命名为：QIMR-Kr-1。

进一步的，所述嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1是一株能够高产蛋白酶的嗜根考克氏菌Kocuria rhizophila；革兰氏阴性，酸性和兼性环境下均能生长，在含1-20wt％NaCl的培养基中能生长，在pH 5-10的培养基中能生长；所形成的菌落呈球状，单个或多聚排列，湿润，边缘光滑，乳白色或黄色。

所述嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1发酵能够产生增香物质。

所述嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1在发酵过程中的应用。

所述嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1在制备发酵制品中的应用。

所述嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1在制备发酵酿造调味品中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：

本发明所提供的嗜根考克氏菌有以下特点：

(1)对盐耐受能力强，能在超高盐环境下生长、代谢、繁殖；(2)可适应较低pH值的生长环境，在发酵过程中受偏酸性环境的影响较弱；(3)有较高蛋白酶、脂肪酶活性，且活性受盐浓度影响不大；(4)发酵产挥发性增香物质，产物口感醇厚的同时特征性香味物质浓郁。

传统鱼露、虾露的酿造过程一般需要几个月甚至半年的时间以达到质量及风味要求，而嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1在CN 202310420293.8一种磷虾虾露与酱油一体化生产方法所公开的虾露快速酿造的酿造方式的基础上能够进一步简化生产工艺，迅速提高发酵速率，降低生产成本，产生浓郁特征性香味物且安全可控，与传统的外加酶发酵方式相比，具有成本低、口感丰富等优点。

本发明提供了一种嗜盐、高蛋白酶活性、发酵增香的菌种，能够用于传统酿造调味品的发酵，并实现发酵产品质量控制。

附图说明

图1是嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1经革兰氏染色后的电镜图。

图2是虾露发酵过程中添加嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1在Glu含量方面的影响。

图3是虾露发酵过程中添加嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1在Asp方面的影响。

图4是盐浓度与菌种密度之间的关系。

图5是菌种脂肪酶活性与盐浓度的关系。

图6是菌种蛋白酶活性与盐浓度的关系。

图7是虾露发酵过程中添加嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1在感官评价方面的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明所述的技术方案作进一步地描述说明。

实施例1：

一种高蛋白酶活性的嗜根考克氏菌(菌株QIMR-Kr-1)的分离方法，包括以下步骤：

(1)以市场上购买经自然发酵的虾酱作为筛选样本，用PBS缓冲液进行梯度稀释

(0、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4)，然后涂布至LB平板中，于37℃培养箱倒置培养；

(2)待平板中长出菌落后，选择形态大小不一的菌落做好标记，于LB液体培养基中进行单独培养；

(3)制作不同菌株密度与OD值关系的曲线，并利用上述曲线根据OD值将菌株的密度统一至10⁸CFU/mL；

(4)将南极磷虾打浆后，添加一倍质量的水，分别加入经密度统一后的菌液同时制作对照，于37℃、220rpm/min的摇床发酵；

(5)发酵10天后，根据发酵样品的液化率、氨基酸态氮含量、风味等选择发酵速率快、鲜味强且香味最浓郁的组别，进行该菌种特性试验及鉴定。

实施例2：

嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1的特性试验

1、菌种耐盐特性验证

(1)配置盐浓度为1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％、18％、20％含盐量的LB液体培养基并灭菌；

(2)将活化的菌液以1％的接种量接种至LB液体培养基中，于37℃，220rpm/min的摇床培养48小时；

(3)通过菌液是否浑浊判定嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1是否能于该盐浓度下生长。

结果显示：嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1在盐浓度为20％的LB液体培养基中，在37℃、220rpm/min的培养条件下能够迅速生长繁殖，说明了嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1对盐的耐受范围在1％-20％，这在调味品酿造过程中具有巨大优势。

2、菌种耐酸碱特性验证

(1)以盐酸和氢氧化钠调节pH以配置pH 3、pH 5、pH 7、pH 10、pH 12的LB液体培养基并灭菌；

(2)将活化的菌液以1％的接种量接种至LB液体培养基中，于37℃，220rpm/min的摇床培养12小时；

(3)通过菌液是否浑浊判定嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1是否能于该pH下生长。

结果显示：嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1在pH5-10的LB液体培养基中，在37℃、220rpm/min的培养条件下能够生长繁殖。

3、菌种革兰氏染色验证

(1)将已活化的嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1菌液在LB平板中进行划线，挑取单克隆进行革兰氏染色；

(2)制片：在载玻片中滴一滴生理盐水，用接种环取嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1平板上的单克隆于生理盐水中进行涂片，干燥后，于酒精灯上方固定(温度不宜过热)；

(3)初染：滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)染色1min，水洗，并干燥；

(4)媒染：用碘液覆盖约1min，水洗；

(5)脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95％的乙醇脱色20s，立即水洗，并干燥；

(6)复染：用番红液复染约2min，水洗。

镜检：干燥后，用油镜观察，菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌(如图1所示，图1中染色为红色)，即说明嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1为革兰氏阴性菌。

实施例3：

嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1酶活力受盐浓度的影响实验：

(1)粗酶液的提取：

a.将种子液接种于肉汤培养基中，37℃、220r/min摇床培养48h；

b.将菌液转移至50mL的离心管中离心(10000r/min，4℃，15min)，收集上清液即为胞外

酶粗酶液；

c.离心后的沉淀溶于10mL生理盐水中，加入1mL 2％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，v/v)，置37℃水浴锅中水浴1h，使CTAB与菌体完全反应。采用超声波破碎仪进行细胞破碎(超声功率400W，时间4min，时间间隔3s)，并在10000r/min、4℃的条件下离心15min后除去细胞碎片，得到细胞抽提液为胞内酶粗酶液；

d.胞外粗酶液与胞内粗酶液混合即得待测粗酶液。

(2)脂肪酶活力的测定：

a.取1.5mL含1％曲拉通的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)和0.1mL的底物溶液(90mg对硝基苯酚棕榈酸溶于30mL异丙醇)，于37℃水浴中预热5min，加入0.1mL酶液，在37℃水浴中精确反应20min，立即加入2mL乙醇混匀，冰水浴终止反应，在410nm处

测定吸光度。未加酶液组为对照；

b.标准曲线的绘制：配置40mM对硝基苯酚溶液(异丙醇溶解)，取10mL 40mM对硝基苯酚溶液用含1％曲拉通的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)稀释至4mM；

酶活力按式(1)计算：

酶活力/(U/mL)＝(a×(A₁－A₀)+b)×10×n/20 (1)

式中：A1为样品酶液的吸光度；A0为对应酶液的空白吸光度；a、b为p-NP标准曲线公式中的系数；10为100μL酶液中的酶活计算为1mL酶活力；n为酶液的稀释倍数；20为反应时间20min。

(3)蛋白酶活力的测定：

a.蛋白酶活力测定参考SB/T 10317-1999，1mL 2％酪蛋白溶液(40℃预热)加入1mL酶液(40℃预热)，于40℃水浴，精确计时20min后立即加入2mL 0.4M三氯乙酸，充分震荡后于40℃水浴20min后离心；取1mL上清液加入5mL 0.4M碳酸钠溶液，再加入0.1mL稀释的福林溶液，充分震荡后于40℃保温发色，然后于660nm处测量吸光度值。以灭活酶液为对照；

b.标准曲线的绘制：配置1mg/mL的酪氨酸溶液(盐酸溶解)，吸取此液10mL用0.2M盐

酸定容至100mL，配置成为0.1mg/mL的酪氨酸溶液；

酶活力按式(1)计算：

酶活力/(U/mL)＝(a×(A₁－A₀)+b)×4×n/20 (1)

式中：A₁为样品酶液的吸光度；A₀为对应酶液的空白吸光度；a、b为酪氨酸标准曲线公式中的系数；4为4mL反应液中取1mL进行测定；n为酶液的稀释倍数；20为反应时间20min。结果表示：

图4为盐浓度与菌种密度之间的关系。将菌种按同样比例接种至不同盐浓度的培养基中，于最适温度下培养48h后于600nm处测吸光度值并绘制培养基盐浓度(％)与OD600nm吸光度值的关系曲线。由图可知，该菌种培养最适盐浓度为3％。当培养基盐浓度为20％时，该菌种仍能生长。

图5为该菌种脂肪酶活性与盐浓度的关系。利用发酵菌液制作粗酶提取液并在不同盐浓度的反应体系中测定脂肪酶活。在盐浓度为7％时，该粗酶提取液的脂肪酶活性最高。随着盐浓度的增加，当盐浓度达到15％时，脂肪酶活并未大量损失。

图6为该菌种蛋白酶活性与盐浓度的关系。利用发酵菌液制作粗酶提取液并在不同盐浓度的反应体系中测定蛋白酶活。在盐浓度为12％时，该粗酶提取液的蛋白酶活性最高。随着盐浓度的增加，当盐浓度达到20％时，蛋白酶活并未大量损失。

实施例5：

嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1基因组的提纯与测序

(1)嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1样品使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行基因组的提取；

(2)PCR扩增使用细菌菌种鉴定通用引物27F，序列5’→3’为AGTTTGATCMTGGCTCAG，扩增序列16S rDNA，长度1500bp左右；

(3)1％琼脂糖电泳，150V、100mA 20min电泳观察，PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，PCR产物用PCR引物直接测序；

(4)16SrDNA序列在核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp上比对；

(5)使用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中基于BLASTP算法的非冗余(NR)蛋白质数据库，Pfam(https://pfam.xfam.org/sear ch/sequence)数据库以及PDB

(http://www.rcsb.org/)数据库进行比对，选取score最高的比对结果(E-value≤

10-5；id-entity>40％；coverage>40％)进行筛选整合，得到该菌株基因组最终注释信息。

经基因组测序，嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1 16SrDNA序列见SEQ NO.1所示。

实施例6：

一种虾露的快速酿造方式，具体步骤如下：

(1)将发酵菌种QIMR-Kr-1进行活化、扩繁，通过梯度稀释、平板计数等方式确定菌液OD值与菌种密度的关系曲线；

(2)根据菌体密度与OD值的关系曲线，将菌体密度统一至10⁸CFU/mL；

(3)将磷虾洗净后，充分搅碎，称取100g分装至250mL锥形瓶中，加入100mL水，搅拌均匀后，加入20％的食用盐，充分混匀；以10⁶CFU/g的接种量将QIMR-Kr-1接种至搅碎并拌盐的磷虾中，同时设置空白实验，即其他操作相同，用等量的水代替QIMR-Kr-1菌液，每组制作两个平行；用封口膜封口后，于37℃、220rpm/min摇床发酵；

(4)发酵15天后将样品于8000rpm/min离心20min，取上清液即为最终的发酵虾露；

(5)0d、1d、3d、5d、7d、10d、15d分别于无菌环境下取样并测定氨基酸态氮、总氮、液化率及风味的变化，其中氨基酸态氮、总氮、挥发性盐基氮、含盐量测定方式分别按照《GB5009.235-2016》中比色法，《GB 5009.5-2016》中凯氏定氮法；液化率以均质发酵样品离心后，取清夜，m(清夜)/m(样品)*100 -1进行计算；

(6)测定发酵过程游离氨基酸的变化情况；

(7)将发酵产品与市场上购买的竞品随机排列，进行编号，分别取20mL于事先做好编号的纸杯中；选择12位专业的感官评价人员进行评价，每评价一个样品，及时进行感官评价打分，然后用温水进行漱口并作短暂休息。

表1虾露发酵过程中添加QIMR-Kr-1在总氮、氨基酸态氮及液化率方面对发酵产生的影响

从总氮、氨基酸态氮、液化率以及感官评价四个角度表征发酵结果，其中总氮表示的是南极磷虾来源的水不溶性蛋白质经发酵过程分解为水溶性蛋白质的情况，氨基酸态氮表示经发酵过程蛋白质转化为短肽、氨基酸的量，液化率表示南极磷虾匀浆自溶分解及发酵分解的程度，感官评价从整体风味层面展示发酵过程对虾露口感及气味的影响。GB/T42463-2023鱼露质量通则中规定鱼露氨基酸态氮(以N计)≥0.40g/100mL，GB 18186-2000酿造酱油中规定氨基酸态氮(以N计)≥0.80g/100mL即为特级酱油。

由上表可得，与传统鱼露、虾露长达几个月甚至半年的酿造时间相比，在CN202310420293.8一种磷虾虾露与酱油一体化生产方法所公开的虾露快速酿造的酿造方式的基础上进行优化，添加QIMR-Kr-1发酵仅在第7天达到特级酱油的标准，发酵第15天氨基酸态氮达到1.08g/100mL，在CN 202310420293.8一种磷虾虾露与酱油一体化生产方法所公开的短时、高品质的虾露酿造方式的基础上进一步将氨基酸态氮含量提升了将近10％，发酵提质效果显著。

图2是虾露发酵过程中添加QIMR-Kr-1在Glu含量方面的影响，Glu是呈鲜味的游离氨基酸，其含量在发酵过程中持续上升，与对照组相比，添加QIMR-Kr-1的发酵液在最终Glu积累上有明显优势。

图3是虾露发酵过程中添加QIMR-Kr-1在Asp含量方面的影响，Asp是呈鲜味的氨基酸，发酵过程中Asp含量缓慢上升，与对照组相比，添加QIMR-Kr-1的发酵液在发酵前三天Asp含量迅速积累，且在整个发酵过程中有明显优势。

图7是虾露发酵过程中添加QIMR-Kr-1在感官评价方面的影响，包括三个组别：经传统发酵方式制作的虾露产品；对照组的发酵样品；添加QIMR-Kr-1进行发酵的实验组的发酵样品。由感官评价可知，传统发酵组由于发酵时间长，在鲜味积攒的过程中，腥味和腐败气味也日渐突出；而经改良后的发酵工艺可在短期快速发酵，鲜味突出的前提下，腥味轻且几乎不出现腐败性风味。而添加QIMR-Kr-1发酵的组别，在对照组的基础上酯香味更为突出，而这一点则是传统发酵虾露中缺少的一种风味。

由上述结果可以看出，所述嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1的耐盐、耐酸碱性为其在虾露发酵过程中的快速生长、代谢，促进发酵进程奠定基础；QIMR-Kr-1发酵高产谷氨酸、天冬氨酸，且产生明显的酯香味，为虾露提鲜、增香奠定基础；高密度接种QIMR-Kr-1通过改变物料初始微生物密度及结构，进而影响发酵速率及方向，从而形成风味不同的虾露。

在上述实施例的基础上，本发明继续对其中涉及到的技术特征及该技术特征在本发明中所起到的功能、作用进行详细的描述，以帮助本领域的技术人员充分理解本发明的技术方案并且予以重现。

最后，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (4)

1.一种嗜根考克氏菌（Kocuria rhizophila），其特征在于，该菌种保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为：CGMCC No.27273，保藏日期为：2023年05月06日，保藏地址为：中国北京市中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为嗜根考克氏菌Kocuria rhizophila，命名为：QIMR-Kr-1。

2.权利要求1所述的嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1在发酵过程中的应用。

3.权利要求1所述的嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1在制备发酵制品中的应用。

4.权利要求1所述的嗜根考克氏菌QIMR-Kr-1在制备发酵酿造调味品中的应用。