CN112501068A - 一种用于肉制品的冻干发酵剂制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于肉制品的冻干发酵剂制备方法，具体包括如下步骤：将甘油管或安瓿管中保存的菌种在甘露醇高盐琼脂培养基平板上活化2代，挑取第2代细菌的单菌落，接种至100mL营养肉汤液体培养基中,培养12h至对数生长期；用增殖好的菌液收集菌体沉淀；将菌体保护剂,主要成分为红甜菜根粉,溶于加热至60‑70℃的蒸馏水中，混合均匀后去除沉淀，过滤收集滤液；以灭菌后的冻干保护剂重悬菌体沉淀，室温下静置1h；振荡含有菌体的溶液，使其混合均匀，预冷后在冷冻干燥机中冻干。本方法可减少其他种类保护剂影响肉制品风味，同时省去化学色素添加剂。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种用于肉制品的冻干发酵剂制备方法。
背景技术
真空冷冻干燥技术(简称冻干)是将冷冻和干燥技术结合的一种能有效保存细菌菌体细胞的方法。冻干过程中，细胞在冷冻和干燥的激烈作用下，将受到一定程度的损伤。保护剂在众多影响细菌冻干效果的因素中，影响最为突出。适合的保护剂是细菌冷冻干燥成功的关键，保护剂能够减轻或避免冷冻干燥对细胞的损害，最大程度保持细菌原有的生理生化性质。其不仅影响细菌在冻干过程中的存活率，还影响保藏期间细菌的稳定性。根据保护剂的性质可分多元醇类、糖类、氨基酸类、蛋白质及肽类、无机盐类和混合物(如脱脂乳)等。小分子物质通过取代水分子来保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性，而大分子物质通过“包裹”形式保护菌体。菌体的保护体系一般是由几种物质复合而成。红甜菜根粉，是红甜菜根经采摘、筛选、清洗、烘干、研磨等工艺，制成的均匀、细腻、无添加剂的天然蔬菜粉。现主要用途有添加于食品中，改善风味及色彩；提取色素，添加于化妆品中；制作代餐粉、保健食品、营养补充剂及饲料等。还没有红甜菜根粉用作冻干保护剂的报道。
肉制品发色的原理是亚硝酸盐与肉中的乳酸发生反应生成亚硝酸，亚硝酸被还原分解成一氧化氮(NO)，一氧化氮与肌红蛋白(或血红蛋白)结合生成稳定的亚硝基肌红蛋白(或亚硝基血红蛋白)，从而使肉制品呈现腌制品特有的玫红色。以葡萄球菌及微球菌为代表的凝固酶阴性球菌(CNC，Coagulase–negativecocci)是肉制品工业中常用的发酵菌种，其能够适应一定浓度氯化钠、硝酸盐存在的环境。CNC如小牛葡萄球菌(Staphylococcusvitulinus)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)和肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)等葡萄球菌，嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)、变化考克氏菌(Kocuriavarians)等微球菌，均具有硝酸盐还原作用，能够将硝酸盐还原为亚硝酸盐，促进肉质形成理想的红色。红甜菜根粉中富含的硝酸盐，能够被CNC缓慢的转化为亚硝酸盐，通过进一步的反应促进肉制品发色。
以红甜菜根粉作为CNC冻干保护体系中的主要成分，不仅有效保护了菌体，还能在发酵剂用于肉制品时替代亚硝酸盐的使用，用于生产天然无添加的色泽良好的发酵肉制品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于肉制品的冻干发酵剂制备方法，以解决上述背景技术的问题。
具体地说：发酵肉制品需要添加亚硝酸盐来使其产生鲜红的颜色，红甜菜根粉为天然蔬菜粉，可以替代化学添加用于上色，通过微生物的转化促进肉制品发色。
肉制品发酵剂冻干过程中需要适当的保护剂保护菌体以防冻伤，以红甜菜根粉作为肉制品发酵剂冷冻干燥过程中的保护剂，起到以下作用：
(1)作为主要的保护剂，能够有效保护菌体，并避免添加过多的其他种类保护剂影响肉制品风味；
(2)红甜菜根粉与菌体在肉制品中作用后能够使产品产生理想的红色而避免使用化学添加剂。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种用于肉制品的冻干发酵剂制备方法，具体包括如下步骤：
(1)菌种活化
将甘油管或安瓿管中保存的菌种在甘露醇高盐琼脂培养基平板上活化2代，挑取第2代细菌的单菌落，接种至100mL营养肉汤液体培养基中,培养12h至对数生长期；将对数生长期菌液按1％体积接种于营养肉汤液体培养基中，37℃下在摇床中培养12-15h，吸取1mL菌液，做适当梯度稀释后计算活菌数；
(2)收集菌体
增殖好的菌液在4℃条件下，6000r/min离心15min；
再用0.85％无菌生理盐水重悬沉淀后以清洗菌体，4℃、6000r/min离心15min，倾去上清液，重复3次，收集菌体沉淀；
(3)冻干保护剂制备
将菌体保护剂,主要成分为红甜菜根粉,溶于加热至60-70℃的蒸馏水中,用磁力搅拌器搅拌混合溶液20min，6000r/min离心15min，去除沉淀，上清液用高速滤纸过滤，收集滤液，滤液在85℃水浴锅中灭菌15min；
(4)菌体重悬
以灭菌后的冻干保护剂重悬菌体沉淀，保护剂溶液与菌液原体积比值为1:1-1:10，菌体沉淀与保护剂充分混匀后，室温下静置1h；
(5)菌体预冻
振荡含有菌体的溶液，使其混合均匀，无菌条件下分装至安瓿管中，于-20℃预冻6h或者-80℃预冻2h；
(6)冷冻干燥菌体
冷冻干燥机预冷至-30℃，放入预冻好装有菌体的安瓿管，-70℃真空冷冻干燥12-15h。
(7)测定冻干后活菌数
在冻干的菌粉中加入无菌生理盐水，恢复至冻干前溶液体积，适当梯度稀释后计算活菌数，与冻干前活菌数对比计算存活率。
优选地，所述甘露醇高盐琼脂培养基的组分：牛肉膏0.1％、胰蛋白胨1％、D-甘露醇1％、氯化钠7.5％、酚红0.0025％及琼脂1.5％，pH7.2-7.6。
优选地，所述营养肉汤液体培养基的组分：蛋白胨1％、牛肉膏0.3％及氯化钠0.5％，pH7.0-7.4。
优选地，所述菌种包括葡萄球菌及微球菌。
优选地，所述菌种包括但不限于小牛葡萄球菌、木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌的一种。
优选地，所述菌体保护剂的组分的质量体积百分比为：红甜菜根粉5-10％、甘露醇2-5％、海藻糖3-6.5％、谷氨酸钠2-5％。
优选地，所述冻干存活率(％)为(a1÷a0)×100，其中，a0:冻干前活菌数，单位为CFU/mL，a1:冻干后活菌数，单位为CFU/mL。
本发明的有益效果是：
(1)传统的发酵肉制品通常采用自然发酵的方法加工，存在工艺过程不可控、产品质量不统一、难以实现规模化生产的问题。用于肉制品的发酵剂一般由肉制品中的优势本土菌种经分离、纯化、增殖后制成。在肉制品中起到发酵作用的优势的菌种主要有葡萄球菌及微球菌，这些菌能够快速启动发酵，预防杂菌，稳定产品质量，是实现发酵肉制品规模化生产。
(2)冻干发酵剂具有易于保存、直接使用、无须活化的特点。传统的液体发酵剂在使用前需要将菌体活化2-3代后才具有较好的活性，在这一过程中也容易发生污染，并且需要低温冷藏保存，保存时限在一周左右，而冻干发酵剂保藏时限通常在5年以上。
(3)用红甜菜根粉作为葡萄球菌及微球菌等菌种的冻干保护剂，不仅初次探索了蔬菜粉作为冻干保护剂的可能性，在肉制品发酵过程中还充分发挥了保护剂与菌体的相互作用。红甜菜根粉含有丰富的硝酸盐，在肉制品中使用发酵剂后，具有硝酸盐还原酶活性的葡萄球菌或微球菌可以将红甜菜根粉中的硝酸盐还原，再与肉中的肌红蛋白或血红蛋白作用，起到天然发色的作用，可以替代肉制品加工中亚硝酸盐的化学添加，使用本冻干发酵剂发酵的肉制品质量稳定、具有发酵肉特有的红色。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本实施例提供了一种用于肉制品的冻干发酵剂制备方法，具体包括如下步骤：
(1)菌种活化
将甘油管或安瓿管中保存的菌种在甘露醇高盐琼脂培养基平板上活化2代，挑取第2代细菌的单菌落，接种至100mL营养肉汤液体培养基中,培养12h至对数生长期；将对数生长期菌液按1％体积接种于营养肉汤液体培养基中，37℃下在摇床中培养12-15h，吸取1mL菌液，做适当梯度稀释后计算活菌数；
(2)收集菌体
增殖好的菌液在4℃条件下，6000r/min离心15min；
再用0.85％无菌生理盐水重悬沉淀后以清洗菌体，4℃、6000r/min离心15min，倾去上清液，重复3次，收集菌体沉淀；
(3)冻干保护剂制备
将菌体保护剂,主要成分为红甜菜根粉,溶于加热至60-70℃的蒸馏水中,用磁力搅拌器搅拌混合溶液20min，6000r/min离心15min，去除沉淀，上清液用高速滤纸过滤，收集滤液，滤液在85℃水浴锅中灭菌15min；
(4)菌体重悬
以灭菌后的冻干保护剂重悬菌体沉淀，保护剂溶液与菌液原体积比值为1:1-1:10，菌体沉淀与保护剂充分混匀后，室温下静置1h；
(5)菌体预冻
振荡含有菌体的溶液，使其混合均匀，无菌条件下分装至安瓿管中，于-20℃预冻6h或者-80℃预冻2h；
(6)冷冻干燥菌体
冷冻干燥机预冷至-30℃，放入预冻好装有菌体的安瓿管，-70℃真空冷冻干燥12-15h。
(7)测定冻干后活菌数
在冻干的菌粉中加入无菌生理盐水，恢复至冻干前溶液体积，适当梯度稀释后计算活菌数，与冻干前活菌数对比计算存活率。
所述甘露醇高盐琼脂培养基的组分：牛肉膏0.1％、胰蛋白胨1％、D-甘露醇1％、氯化钠7.5％、酚红0.0025％及琼脂1.5％，pH7.2-7.6。
所述营养肉汤液体培养基的组分：蛋白胨1％、牛肉膏0.3％及氯化钠0.5％，pH7.0-7.4。
所述菌种包括葡萄球菌及微球菌，所述菌种包括但不限于小牛葡萄球菌、木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌的一种。
所述菌体保护剂的组分的质量体积百分比为：红甜菜根粉5-10％、甘露醇2-5％、海藻糖3-6.5％、谷氨酸钠2-5％。
所述冻干存活率(％)为(a1÷a0)×100，其中，a0:冻干前活菌数，单位为CFU/mL，a1:冻干后活菌数，单位为CFU/mL。
本发明原理是：传统的发酵肉制品通常采用自然发酵的方法加工，存在工艺过程不可控、产品质量不统一、难以实现规模化生产的问题。用于肉制品的发酵剂一般由肉制品中的优势本土菌种经分离、纯化、增殖后制成。在肉制品中起到发酵作用的优势的菌种主要有葡萄球菌及微球菌，这些菌能够快速启动发酵，预防杂菌，稳定产品质量，是实现发酵肉制品规模化生产可行的方法。
冻干发酵剂具有易于保存、直接使用、无须活化的特点。传统的液体发酵剂在使用前需要将菌体活化2-3代后才具有较好的活性，在这一过程中也容易发生污染，并且需要低温冷藏保存，保存时限在一周左右，而冻干发酵剂保藏时限通常在5年以上。
用红甜菜根粉作为葡萄球菌及微球菌等菌种的冻干保护剂，不仅初次探索了蔬菜粉作为冻干保护剂的可能性，在肉制品发酵过程中还充分发挥了保护剂与菌体的相互作用。
红甜菜根粉含有丰富的硝酸盐，在肉制品中使用发酵剂后，具有硝酸盐还原酶活性的葡萄球菌或微球菌可以将红甜菜根粉中的硝酸盐还原，再与肉中的肌红蛋白或血红蛋白作用，起到天然发色的作用，可以替代肉制品加工中亚硝酸盐的化学添加，使用本冻干发酵剂发酵的肉制品质量稳定、具有发酵肉特有的红色。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种用于肉制品的冻干发酵剂制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)菌种活化
将甘油管或安瓿管中保存的菌种在甘露醇高盐琼脂培养基平板上活化2代，挑取第2代细菌的单菌落，接种至100mL营养肉汤液体培养基中,培养12h至对数生长期；将对数生长期菌液按1％体积接种于营养肉汤液体培养基中，37℃下在摇床中培养12-15h，吸取1mL菌液，做适当梯度稀释后计算活菌数；
(2)收集菌体
增殖好的菌液在4℃条件下，6000r/min离心15min；
再用0.85％无菌生理盐水重悬沉淀后以清洗菌体，4℃、6000r/min离心15min，倾去上清液，重复3次，收集菌体沉淀；
(3)冻干保护剂制备
将菌体保护剂,主要成分为红甜菜根粉,溶于加热至60-70℃的蒸馏水中,用磁力搅拌器搅拌混合溶液20min，6000r/min离心15min，去除沉淀，上清液用高速滤纸过滤，收集滤液，滤液在85℃水浴锅中灭菌15min；
(4)菌体重悬
以灭菌后的冻干保护剂重悬菌体沉淀，保护剂溶液与菌液原体积比值为1:1-1:10，菌体沉淀与保护剂充分混匀后，室温下静置1h；
(5)菌体预冻
振荡含有菌体的溶液，使其混合均匀，无菌条件下分装至安瓿管中，于-20℃预冻6h或者-80℃预冻2h；
(6)冷冻干燥菌体
冷冻干燥机预冷至-30℃，放入预冻好装有菌体的安瓿管，-70℃真空冷冻干燥12-15h。
(7)测定冻干后活菌数
在冻干的菌粉中加入无菌生理盐水，恢复至冻干前溶液体积，适当梯度稀释后计算活菌数，与冻干前活菌数对比计算存活率。
2.根据权利要求1所述的一种用于肉制品的冻干发酵剂制备方法，其特征在于：所述甘露醇高盐琼脂培养基的组分：牛肉膏0.1％、胰蛋白胨1％、D-甘露醇1％、氯化钠7.5％、酚红0.0025％及琼脂1.5％，pH7.2-7.6。
3.根据权利要求1所述的一种用于肉制品的冻干发酵剂制备方法，其特征在于：所述营养肉汤液体培养基的组分：蛋白胨1％、牛肉膏0.3％及氯化钠0.5％，pH7.0-7.4。
4.根据权利要求1所述的一种用于肉制品的冻干发酵剂制备方法，其特征在于：所述菌种包括葡萄球菌及微球菌。
5.根据权利要求4所述的一种用于肉制品的冻干发酵剂制备方法，其特征在于：所述菌种包括但不限于小牛葡萄球菌、木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌的一种。
6.根据权利要求1所述的一种用于肉制品的冻干发酵剂制备方法，其特征在于：所述菌体保护剂的组分的质量体积百分比为：红甜菜根粉5-10％、甘露醇2-5％、海藻糖3-6.5％、谷氨酸钠2-5％。
7.根据权利要求1所述的一种用于肉制品的冻干发酵剂制备方法，其特征在于：所述冻干存活率(％)为(a1÷a0)×100，其中，a0:冻干前活菌数，单位为CFU/mL，a1:冻干后活菌数，单位为CFU/mL。
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