CN116606784A - 一种罗伊氏乳杆菌新型抗冻保护剂在真空冷冻干燥过程中的应用 - Google Patents
一种罗伊氏乳杆菌新型抗冻保护剂在真空冷冻干燥过程中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种罗伊氏乳杆菌抗冻保护剂在真空冷冻干燥过程中的应用，属于微生物技术领域。本发明发现山羊奶可以显著提高罗伊氏乳杆菌在冻干过程中的存活率。使用山羊奶对罗伊氏乳杆菌进行真空冷冻干燥时，可以使罗伊氏乳杆菌的存活率达到62.78±3.23%。本发明同时提供了一种新型罗伊氏乳杆菌抗冻保护剂组合物，包括山羊奶、水苏糖，可以显著提高罗伊氏乳杆菌在冻干过程中的存活率，使用该种保护剂对罗伊氏乳杆菌进行真空冷冻干燥时，可以使罗伊氏乳杆菌的存活率达到100%。相对以往的保护剂而言，该种保护剂相对简单，且成分健康。同时，山羊奶的添加也丰富了冻干菌粉的功能性和营养性，为罗伊氏乳杆菌的开发和利用提供基础。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种罗伊氏乳杆菌抗冻保护剂在真空冷冻干燥过程中的应用。
背景技术
益生菌（probiotics）是指适当剂量摄入后，对宿主有益生功能的活菌，可以是一种微生物或是组成明确的混合微生物，定植在宿主体内，可以增强免疫、平衡肠道菌群、促进消化、防老抗衰、降低血脂和护肝等促进其机体健康的一类有益微生物。而罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）作为益生菌的一种，由于其可以发挥多种益生功能而被应用在多个领域中。
罗伊氏乳杆菌作为人体内固有乳酸杆菌之一。目前，罗伊氏乳杆菌已通过动物食用结果证明其不具有安全性方面的不良反应，并且已被国家允许作为可用于保健食品的益生菌菌种。目前，市面上最常见的罗伊氏乳杆菌产品为罗伊氏乳杆菌冻干菌粉，罗伊氏乳杆菌在经过增殖培养、浓缩分离后，与适量的保护剂进行混合制成菌悬液，再经干燥处理可制成罗伊氏乳杆菌发酵剂。常用的干燥方法有喷雾干燥、烘干、真空冷冻干燥等，在以上的保藏方法中，真空冷冻干燥被认为是保藏效果最好、保藏时间最长的有效方法之一。虽然真空冷冻干燥有很多优点，但是在冻干过程中还是会对罗伊氏乳杆菌有着不同程度的损伤，包括机械损伤、溶质损伤、DNA损伤、蛋白质变性失活等。因此选择合适的冻干保护剂对于提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率具有重要的意义。
目前，针对罗伊氏乳杆菌的冻干保护剂已经有大量研究大多是复合保护剂，效果不太理想且成本高。例如，专利CN101974463A公开了使用含有脱脂奶粉、蔗糖、甘油、山梨醇才对罗伊氏乳杆菌冻干时，其冻干存活率仅有70％，保护效果较低。而专利CN202010553173.1公开一种罗伊氏乳杆菌的冻干保护剂，该专利使用水苏糖、酪蛋白酸钠、甘氨酸和硫酸钠冻干罗伊氏乳杆菌时，其冻干存活率高达98%，但是其中含有的酪蛋白酸钠、硫酸钠一般作为食品添加剂使用，因此对其罗伊氏冻干粉产品的应用有一定的限制性。
因此，亟需找到一种新型的、成分健康简单且成本低的抗冻保护剂，提高乳杆菌在冻干过程中的冻干存活率且显著提高罗伊氏乳杆菌冻干菌粉的活菌数是极为重要的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供山羊奶在制备罗伊氏乳杆菌冷冻干燥保护剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种含有山羊奶的罗伊氏乳杆菌冷冻干燥保护剂。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
山羊奶在制备罗伊氏乳杆菌冷冻干燥保护剂中的应用。
含有山羊奶的罗伊氏乳杆菌冷冻干燥保护剂。
进一步地，所述的冷冻干燥保护剂的组成为山羊奶、水苏糖。
进一步地，所述的水苏糖的添加量按其在体系中的终浓度为1～20 wt%，优选10～15 wt%，最优选12.5 wt%计算。
上述冷冻干燥保护剂在罗伊氏乳杆菌冷冻干燥中的应用。
进一步地，所述的应用为在提高罗伊氏乳杆菌冷冻干燥活菌数中的应用。
进一步地，所述的应用为：制备菌泥，将菌泥与山羊奶按质量比体积1g：3～7 mL，优选1g：5mL充分混合；或者将菌泥与山羊奶按质量体积比1g：3～7 mL，优选1g：5mL加入山羊奶，同时加入所需量的水苏糖；-80～-20℃速冻3～8 h后，冷冻干燥，冷冻干燥参数为温度-70～-30℃，真空度0.5～10 Pa，时间24～48 h。
更进一步地，所述的应用为：制备菌泥，将菌泥与山羊奶按质量比体积1g：5 mL充分混合；或者将菌泥与山羊奶按质量体积比1g：5mL加入山羊奶，同时加入添加量按其在体系中的终浓度为12.5 wt%计算的水苏糖；-80℃速冻4h后，冷冻干燥，冷冻干燥参数为温度-65℃，真空度0.65 Pa，时间27 h。
进一步地，所述的菌泥的制备方法为：挑取单菌落接种到MRS液体培养基中，活化2～5代，按2～6%的接种量，接种到三角瓶中静置或者摇床培养9～15h，4000～8000 rpm/min离心10～30min收集菌泥，于灭菌的0.85%生理盐水或者磷酸缓冲盐中洗涤1～3次。
更进一步地，所述的菌泥的制备方法为：挑取单菌落接种到MRS液体培养基中，活化3代，按2%的接种量，接种到三角瓶中静置培养12h，6000 rpm/min离心20 min收集菌泥，于灭菌的0.85%生理盐水洗涤2次。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供了一种新型罗伊氏乳杆菌抗冻保护剂，该新型保护剂为山羊奶。山羊奶可以显著提高罗伊氏乳杆菌在冻干过程中的存活率，使用山羊奶对罗伊氏乳杆菌进行真空冷冻干燥时，可以使罗伊氏乳杆菌的存活率达到62.78±3.23%。
本发明同时提供了一种新型罗伊氏乳杆菌抗冻保护剂组合物，该新型保护剂的成分包括山羊奶、水苏糖。该种保护剂可以显著提高罗伊氏乳杆菌在冻干过程中的存活率，使用该种保护剂对罗伊氏乳杆菌进行真空冷冻干燥时，可以使罗伊氏乳杆菌的存活率达到100%。同时，相对以往的保护剂而言，该种保护剂相对简单，且成分健康。同时，山羊奶的添加也丰富了冻干菌粉的功能性和营养性，为罗伊氏乳杆菌的开发和利用提供基础。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中采用的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）HBM11-69，已在文章“许本宏, 林俊芳, 郭丽琼,等. 罗伊氏乳杆菌果聚糖蔗糖酶基因的克隆与表达[J]. 中国食品学报, 2017, 17(2):6.”中公开。
下述对比例中采用的鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus.rhamnosus）6013，鼠李糖乳杆菌6013由中国微生物菌种保藏中心（CICC）提供。
（1）培养基的配制：
MRS固体培养基（g/L）：牛肉膏 10，蛋白胨 10，酵母浸粉 5，葡萄糖 20，无水乙酸钠 5，柠檬酸氢二铵 2，七水硫酸镁 0.2，磷酸氢二钾 2，一水合硫酸锰 0.054，吐温-80 1。充分混匀后，将培养基分装至三角瓶中，每100 mL液体加1.5g琼脂粉。
MRS液体培养基（g/L）：牛肉膏 10，蛋白胨 10，酵母浸粉 5，葡萄糖 20，无水乙酸钠 5，柠檬酸氢二铵 2，七水硫酸镁 0.2，磷酸氢二钾 2，一水合硫酸锰 0.054，吐温-80 1。
所有培养基均于121 ℃灭菌15 min。
0.85%的生理盐水（g/L）：氯化钠 8.5，121℃灭菌30 min。
蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、七水硫酸镁、磷酸氢二钾、一水合硫酸锰、吐温、氯化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；
（2）下述实施例所提及的水苏糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、甘氨酸、脱脂乳粉均来自上海麦克林生化科技有限公司。水牛奶、山奶羊分别为水牛、山羊产的新鲜的奶，均按照GB19301-2010（食品安全国家标准生乳）标准验收。
罗伊氏乳杆菌活菌数的检测方法：采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
实施例1：罗伊氏乳杆菌冻干菌粉的制备
（1）取山羊奶，105℃灭菌10 min。
（2）罗伊氏乳杆菌的培养
菌株活化：在MRS固体培养基平板上，将保存的罗伊氏乳杆菌菌液划线分离，于37℃培养32h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在MRS液体培养基37℃静置培养24h；按2%的接种量进行传代，反复传代3代，得到活化的菌液。
（3）活化后的罗伊氏乳杆菌菌液按2%的接种量接种于MRS液体培养基中，于37℃静置培养12 h至对数期末期稳定期前期，6000 rpm/min离心20min收集菌泥，用0.85%的生理盐水洗涤2次。按菌泥：山羊奶质量比体积1：5加入灭菌的山奶羊，再充分涡旋混匀得到菌悬液。用移液枪吸取1mL充分混匀的菌悬液于9mL的灭菌0.85%的生理盐水中进行10倍梯度稀释，取100µL涂板，每个梯度做三个平行，于37℃恒温培养箱中培养48 h。将剩下的菌悬液置于-80℃速冻4h后，放入真空冷冻干燥机冻干，冻干参数为-65℃，真空度为0.65 Pa条件下冻干27 h。冻干结束后，取出菌粉加入与冻干前等体积的生理盐水进行复水，涡旋混匀后进行梯度稀释，取100µL涂板计活菌数，设置三个平行，得出冻干存活率。存活率（%）=（冻干后活菌数/冻干前活菌数）×100%。
实施例2
与实施例1相比，区别在于，按菌泥：山羊奶质量比体积1：5加入灭菌的山奶羊，同时加入终浓度为5wt%的水苏糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
实施例3
与实施例1相比，区别在于，按菌泥：山羊奶质量比体积1：5加入灭菌的山奶羊，同时加入终浓度为7.5wt%的水苏糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
实施例4
与实施例1相比，区别在于，按菌泥：山羊奶质量比体积1：5加入灭菌的山奶羊，同时加入终浓度为10wt%的水苏糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
实施例5
与实施例1相比，区别在于，按菌泥：山羊奶质量比体积1：5加入灭菌的山奶羊，同时加入终浓度为12.5wt%的水苏糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例1
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为水牛奶，按菌泥：水牛奶质量比体积1：5加入灭菌的水牛奶，再充分涡旋混匀得到菌悬液。其余步骤与实施例1相同。
对比例2
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为10%脱脂乳，按菌泥：10%脱脂乳质量比体积1：5加入灭菌的脱脂乳，再充分涡旋混匀得到菌悬液。其余步骤与实施例1相同。
对比例3
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为0.85%的生理盐水，按菌泥：生理盐水质量比体积1：5加入生理盐水，再充分涡旋混匀得到菌悬液。其余步骤与实施例1相同。
对比例4
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为20%的甘氨酸水溶液，按菌泥：甘氨酸水溶液质量比体积1：5加入甘氨酸水溶液，再充分涡旋混匀得到菌悬液。其余步骤与实施例1相同。
对比例5
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为山羊奶和低聚果糖，按菌泥：山羊奶质量比体积1：5加入灭菌的山奶羊，同时加入终浓度为5wt%的低聚果糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例6
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为山羊奶和低聚果糖，按菌泥：山羊奶质量比体积1：5加入灭菌的山奶羊，同时加入终浓度为10wt%的低聚果糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例7
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为山羊奶和低聚果糖，按菌泥：山羊奶质量比体积1：5加入灭菌的山奶羊，同时加入终浓度为15wt%的低聚果糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例8
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为山羊奶和低聚异麦芽糖，按菌泥：山羊奶质量比体积1：5加入灭菌的山奶羊，同时加入终浓度为5wt%的低聚异麦芽糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例9
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为山羊奶和低聚异麦芽糖，按菌泥：山羊奶质量比体积1：5加入灭菌的山奶羊，同时加入终浓度为10wt%的低聚异麦芽糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例10
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为山羊奶和低聚异麦芽糖，按菌泥：山羊奶质量比体积1：5加入灭菌的山奶羊，同时加入终浓度为15wt%的低聚异麦芽糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例11
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为水苏糖，按菌泥：水苏糖质量比体积1：5加入终浓度为5wt%的水苏糖，充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例12
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为水苏糖，按菌泥：水苏糖质量比体积1：5加入终浓度为7.5wt%的水苏糖，充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例13
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为水苏糖，按菌泥：水苏糖质量比体积1：5加入终浓度为10wt%的水苏糖，充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例14
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为水苏糖，按菌泥：水苏糖质量比体积1：5加入终浓度为12.5wt%的水苏糖，充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例15
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为水牛奶和水苏糖，按菌泥：水牛奶质量比体积1：5加入灭菌的水牛奶，同时加入终浓度为5wt%的水苏糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例16
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为水牛奶和水苏糖，按菌泥：水牛奶质量比体积1：5加入灭菌的水牛奶，同时加入终浓度为7.5wt%的水苏糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例17
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为水牛奶和水苏糖，按菌泥：水牛奶质量比体积1：5加入灭菌的水牛奶，同时加入终浓度为10wt%的水苏糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例18
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为水牛奶和水苏糖，按菌泥：水牛奶质量比体积1：5加入灭菌的水牛奶，同时加入终浓度为12.5wt%的水苏糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例19
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为10%的脱脂乳和水苏糖，按菌泥：10%的脱脂乳质量比体积1：5加入灭菌的10%的脱脂乳，同时加入终浓度为5wt%的水苏糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例20
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为10%的脱脂乳和水苏糖，按菌泥：10%的脱脂乳质量比体积1：5加入灭菌的10%的脱脂乳，同时加入终浓度为7.5wt%的水苏糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例21
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为10%的脱脂乳和水苏糖，按菌泥：10%的脱脂乳质量比体积1：5加入灭菌的10%的脱脂乳，同时加入终浓度为10wt%的水苏糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例22
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为10%的脱脂乳和水苏糖，按菌泥：10%的脱脂乳质量比体积1：5加入灭菌的10%的脱脂乳，同时加入终浓度为12.5wt%的水苏糖，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例23
与实施例1相比，区别在于，冻干保护剂成分为山羊奶、水苏糖、硫酸钠，按菌泥：保护剂质量比体积1：5加入灭菌的山羊奶、同时加入终浓度为12.5wt%的水苏糖和终浓度为3wt%的硫酸钠，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
对比例24
与实施例1相比，区别在于，将罗伊氏乳杆菌HBM11-69替换为鼠李糖乳杆菌6013，冻干保护剂成分为山羊奶、水苏糖，按菌泥：保护剂质量比体积1：5加入灭菌的山羊奶、同时加入终浓度为12.5wt%的水苏糖终浓度为3wt%的硫酸钠，再充分涡旋混匀得到菌悬液，其余步骤与实施例1相同。
上述不同种冻干保护剂及冻干存活率如表1所示。
表1.不同种冻干保护剂及冻干存活率
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.山羊奶在制备罗伊氏乳杆菌冷冻干燥保护剂中的应用。
2.含有山羊奶的罗伊氏乳杆菌冷冻干燥保护剂。
3.根据权利要求2所述的含有山羊奶的罗伊氏乳杆菌冷冻干燥保护剂，其特征在于：所述的冷冻干燥保护剂的组成为山羊奶、水苏糖。
4.根据权利要求3所述的含有山羊奶的罗伊氏乳杆菌冷冻干燥保护剂，其特征在于：所述的水苏糖的添加量按其在体系中的终浓度为1～20 wt%计算。
5.根据权利要求3所述的含有山羊奶的罗伊氏乳杆菌冷冻干燥保护剂，其特征在于：所述的水苏糖的添加量按其在体系中的终浓度为12.5 wt%计算。
6.权利要求2-5任一项中所述的冷冻干燥保护剂在罗伊氏乳杆菌冷冻干燥中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述的应用为在提高罗伊氏乳杆菌冷冻干燥活菌数中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述的应用为：制备菌泥，将菌泥与山羊奶按质量比体积1g：3～7 mL充分混合；或者将菌泥与山羊奶按质量体积比1g：3～7 mL加入山羊奶，同时加入所需量的水苏糖；-80～-20℃速冻3～8 h后，冷冻干燥，冷冻干燥参数为温度-70～-30℃，真空度0.5～10 Pa，时间24～48 h。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述的应用为：制备菌泥，将菌泥与山羊奶按质量比体积1g：5 mL充分混合；或者将菌泥与山羊奶按质量体积比1g：5 mL加入山羊奶，同时加入所需量的水苏糖；-80℃速冻4h后，冷冻干燥，冷冻干燥参数为温度-65℃，真空度0.65 Pa，时间27 h。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：
所述的菌泥的制备方法为：挑取单菌落接种到MRS液体培养基中，活化2～5代，按2～6%的接种量，接种到三角瓶中静置或者摇床培养9～15h，4000～8000 rpm/min离心10～30min收集菌泥，于灭菌的0.85%生理盐水或者磷酸缓冲盐中洗涤1～3次。
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