CN112655863A - 一种唾液乳杆菌发酵液在作为饲料防霉剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种唾液乳杆菌发酵液在作为饲料防霉剂中的应用，该唾液乳杆菌发酵液是由保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）的唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）发酵制得，唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）的保藏编号为CGMCC No.20700；本发明唾液乳杆菌发酵液对黄曲霉、米曲霉、黑曲霉、皮壳青霉、卷枝毛霉、拟轮枝镰孢菌、白地霉等常见饲料霉变真菌具有良好的抑菌作用；能够有效延缓饲料及其原料的霉变周期和霉变程度，可有效替代传统饲料防霉剂，促进饲料生产工业及提高畜禽肉质品质。
Description
技术领域
本发明涉及一种唾液乳杆菌发酵液在作为饲料防霉剂中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
饲料发霉、霉变及霉变真菌产生的毒素直接影响着饲料储藏加工的质量和安全，严重地危害了畜禽和人类健康。饲料发霉或被霉菌污染后，大多数霉菌为非产毒性霉菌，这类霉菌降底了饲料的适口性以及饲料的营养价值；少部分霉菌为产毒素霉菌，可引起畜禽发生急性或慢性中毒，有的霉菌毒素还具有致癌、致畸和致突变等毒性作用。
饲料发霉、霉变及霉变真菌产生的毒素对于畜禽而言，主要危害是造成营养不良与失衡、免疫功能下降、消化道与生殖系统功能损伤、饲料转化率降低等。此外，霉菌消耗营养物质的同时，也会产生大量的热量，使饲料中蛋白质、脂肪、碳水化合物和维生素发生变化，致使被霉菌污染的饲用玉米，营养成分含量和营养价值大大降低。
目前，预防饲料及饲料原料发生霉变的方式主要是以降低原料含水量，加强生产和存储方面的管理以及添加甲酸、丙酸盐类、山梨酸等单一或复合防霉剂。这些方式在实际生产中效果往往不是很理想，未能从根本上抑制或杀灭霉菌。益生菌产生的次级代谢产物，具有高效、安全、无残留、无抗药性等多重优势，畜禽食入后能够调整或维持畜禽肠道内微生态平衡，促进乳酸菌等有益菌的增殖，抑制大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌的生长，可有效增强机体的免疫功能，促进营养物质的吸收和转化，从而达到防病治病、提高饲料转化率及畜禽生产性能的效果。同时，益生菌产生的次级代谢产物在动物饲料添加剂、疾病防御等重要领域具有极高的利用价值。但，目前挖掘得到的大多数益生菌产生的次级代谢产物仅对细菌有良好的抑制效果，而对于真菌的抑制较少，特别是能够有效抑制或杀灭多种典型霉变真菌的益生菌次级代谢产物极为罕见。
发明内容
为了解决饲料易发生霉变，传统防霉剂防霉效果差、安全性低，生物活性肽难以保存、利用困难以及霉变真菌难以抑制或杀灭等问题，本发明提供了一种饲料防霉剂，该饲料防霉剂是由保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）的唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）发酵制得，唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）的保藏编号为CGMCC No.20700，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）是从云南无量山的乌骨鸡肠道中分离获得，唾液乳杆菌菌落在MRS培养基上生长良好，呈凸起、表面光滑的乳白色菌落；经革兰氏染色后镜检呈蓝紫色，为革兰氏阳性杆状菌；经16S rDNA全长序列测序通过NCBI在线Blastn工具比对后，此株菌与唾液乳杆菌的16S rDNA序列一致性为100%，确定其为唾液乳杆菌。
唾液乳杆菌发酵液制备方法如下：按3%的接种量将唾液乳杆菌种子液接种于发酵罐中，37℃恒温培养，收集培养至稳定期的发酵液，发酵液中菌体浓度超过3.0×109CFU/mL；发酵液离心除去菌体，剩余液体即可作为防霉剂使用，或将剩余液体喷雾干燥制得唾液乳杆菌发酵液粉剂。
将本发明唾液乳杆菌发酵液应用在抑制和/或杀灭真菌中，实验结果显示其对黄曲霉（Aspergillus flavus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、皮壳青霉（Penicillium crustosum）、卷枝毛霉（ Mucor circinelloides）、拟轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioide）、白地霉（Geotrichum candidum）等常见饲料霉变真菌具有良好的抑菌作用，且添加在饲料中能延缓饲用玉米的霉变周期。
本发明唾液乳杆菌发酵液作为饲料防霉剂的主要活性成分，用于抑制和/或杀灭真菌，其还可以与其他活性成分复配发挥协同抑菌作用，可以通过现有技术设备制备成各种剂型的饲料防霉剂，还可以加入一种或多种饲料防霉剂上可接受的辅料。
本发明方法的优点和技术效果如下：
1、本发明防霉剂安全、环保，使用后无残留、无抗药性；
2、本发明发酵液制备工艺简单，成本低；
3、本发明发酵液对饲料霉变真菌具有良好的抑菌作用，且添加在饲料中能延缓饲用玉米的霉变周期，适用于工业化生产及市场推广应用。
附图说明
图1为实施例1中唾液乳杆菌的菌落形态(A)和革兰氏染色镜检图(B)；
图2为实施例3中不同添加量的发酵液处理30d后的饲料玉米霉变情况；
图3为实施例3中不同添加量的发酵液处理30d后的饲料玉米霉变霉菌菌落数目；
图4为实施例5中不同添加量的唾液乳杆菌发酵液干粉处理30d后的饲料玉米霉变情况。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂等如无特殊说明均从商业途径所得到。
实施例1：菌种的分离和鉴定
（1）取体型大小均一的成年云南无量山乌骨鸡，解剖并取其肠道；采用无菌生理盐水清洗鸡肠道并刮去肠道内容物，在肠黏膜表层不同位置刮取黏液，置于液体MRS培养基中，37℃下培养12h；将菌液取100μL均匀涂布于含5% CaCO3的MRS固体培养基平板上，37℃下培养24 h；挑取生长最为旺盛且具有透明溶钙圈的单菌落继续在MRS固体培养基上进行分离纯化，将产生溶钙圈的菌落进行革兰氏染色实验，革兰氏染色阳性菌株初步定为乳酸菌见（图1）；
（2）分子鉴定：采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取乳酸菌的基因组DNA；利用扩增细菌16S rDNA的通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGATACCTTGTTACGACTT-3’），对乳酸菌的16S rDNA全长序列进行PCR扩增；PCR产物大小经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序，直至测通；将16S rDNA序列提交至美国国立生物技术信息中心网站的GenBank数据库，采用BLAST在线服务器（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行比对；根据比对得分最高，且序列一致性达到100%的已知乳酸菌种类确定目标物种名；
（3）经形态学与分子鉴定后，确认该株乳酸菌为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）。
实施例2：唾液乳杆菌发酵液制备
（1）按3％的接种量将唾液乳杆菌种子液接种于200L的发酵罐中，发酵培养基为MRS培养基，在37℃恒温培养24 h后，发酵液中菌体浓度超过3.0×109CFU/mL，将发酵液置于管式离心机中在20000转/min下处理，充分离心去除菌体，收集液体；
（2）液体喷雾干燥，其中喷雾干燥过程中入口温度为160℃，进料速率为1100mL/h，进风量为80 m3/h，出口温度为75℃；制得发酵液粉剂，粉剂含水量为10.21%。
实施例3：唾液乳杆菌发酵液对延缓饲用玉米霉变周期效果
称取未霉变的含水量为10%左右的饲用玉米2kg，并粉碎至粒径为1-5mm，按每袋100g的量将其分装到容量200g的密封自封袋中；将实施例2步骤（1）制得的发酵液按每袋10mL（10%）、20mL（20%）、30mL（30%）的添加量加入到未霉变玉米饲料中（饲料的含水量分别为16.26%、23.31%、26.25%）作为实验组，以加入同等量的ddH2O为对照组（CA）；完全密封放置于室温中，每隔5d观察霉变情况，以结块、霉斑、霉味、作为观测指标，连续观测30d，并采集30d时的表观霉变图与霉菌数，每个实验组设置三个重复实验；
霉菌数观测，以每组饲用玉米三个平行样品等量混合，分别从每袋饲用玉米袋子的上、中、下三个部位取样进行混合（保证试样的代表性），按照GB/T13092-2006检测方法进行霉菌菌落计数；霉变饲用玉米样品检测时，首先称取10.0g试样置于含有100mL ddH2O已灭菌的250mL玻璃锥形瓶中，利用振荡器充分振荡均匀，即为1/10的稀释液；再利用无菌水梯度稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8四个梯度，均匀释涂布接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）中，选择霉菌数在30-100之间的平皿进行计数，以同稀释度平皿的霉菌数乘以稀释倍数，即为每g样品中所含霉菌总数，每个浓度梯度设置三个生物学重复。
添加不同添加量的唾液乳杆菌发酵液对饲料玉米处理后，与对照组相比发生了明显的延缓饲料霉变现象（见表1），其中，三个不同添加量的唾液乳杆菌发酵液处理组前10d均未出现明显的霉变现象，无明显形成结块、霉斑及明显霉味；而对照组却均出现了不同程度的霉变现象，随着无菌水占比的增加霉变现象越明显；随着处理周期的推移，处理组中以添加10mL唾液乳杆菌发酵液的饲料玉米中最先出现霉变现象，其次为20mL和30mL，逐渐出现一定的霉变现象。同时，随着唾液乳杆菌发酵液添加量的增加霉变现象越不明显，但在30d时均呈现出一定的霉变现象；
表1
注：〇代表结块程度，*代表霉味，+代表霉斑，-代表无明显现象
分析30d时饲料玉米出现的霉变现象与霉变真菌菌落总数，从表1、图2可以看出，不同添加量的对照组霉变程度极为严重，随着无菌水占比的增加，发生的结块现象越严重，霉斑颜色也随之丰富、存在着多种霉变真菌且霉味十分刺鼻；而30d时添加不同添加量的唾液乳杆菌发酵液的处理组经肉眼观察只能看到饲用玉米表面存在着少许白色菌丝，除10mL处理组外其余均无较大面积结块，且霉味随着占比含量的上升也逐渐减少；同时，统计各霉变分组的霉变真菌总菌落数可知（图3），随着无菌水添加量的增加对照组真菌菌落总数呈现逐渐上升趋势，以30mL无菌水达到最高为2.9±0.26×109 CFU/g，而添加唾液乳杆菌发酵液的处理组随着添加比例的上升，真菌总菌落数逐渐减少，在30mL添加量的处理组中霉变真菌菌落总数最少仅为9.28±0.59×107 CFU/g，这一结果与30d时呈现的霉变现象高度吻合。
实施例4：唾液乳杆菌发酵液粉剂对霉变真菌的体外抑菌活性检测
1、取实施例2步骤（2）制得的发酵液粉剂0.5g于4mL EP管中作为实验组，取灭菌的质量浓度10%的食盐溶液于4mL EP管中作为对照；
2、在实验组和对照组样品中分别加入3mL PBS溶液（pH为7.4）；
3、用牛津杯双层平板法（牛津杯直径为8mm）检测发酵液粉剂对霉变真菌的抑菌作用
将PDA固体培养基倒入培养皿中作为下层培养基，风干后，将500μL黄曲霉、米曲霉、黑曲霉、皮壳青霉、卷枝毛霉、拟轮枝镰孢菌、白地霉的菌液与4mL半固体PDA培养基混合后倒入培养皿中作为上层培养基；风干后用已消毒的镊子将已灭菌牛津杯置于上层培养基中，并向牛津杯中加入用0.22μm滤膜过滤后的实验组溶液200μL，同时设置对照组样品作为阴性对照，之后放置于4℃冰箱静置4h，待乳酸菌素完全扩散后，于28℃下培养24~36h；观察发酵液对霉变真菌的抑菌效果，并用游标卡尺测量抑菌圈的直径，每组做3个重复实验，实验结果见下表：
表2
实验结果显示；发酵液对黄曲霉、米曲霉、黑曲霉、皮壳青霉、卷枝毛霉、拟轮枝镰孢菌、白地霉具有良好的抑菌活性。
实施例5：唾液乳杆菌发酵液粉剂对延缓饲用玉米霉变周期效果
1、称取未霉变的含水量为10%左右的饲用玉米2kg，按每袋100g的量将其分装到容量200g的密封自封袋中；
2、称量实施例2制得的发酵液粉剂5g、10g、15g、20g，并分别溶解至20mL的无菌水中，利用电子水分快速测定仪检测其含水量为23.18%，将不同浓度的溶液分别加入至上述分装好的未霉变的玉米饲料，以加入对应含水量的无菌水为对照；每组做三次重复实验；
3、密封放置于室温中，每隔5 d观察采样，以结块、霉斑、霉味、作为观测指标，连续观测30d；实验结果如下所示：
表3
注：〇代表结块程度，*代表霉味，+代表霉斑，-代表无明显现象
实验结果显示：唾液乳杆菌发酵液粉剂能够有效延缓饲料霉变的周期，不同浓度的唾液乳杆菌发酵液的处理组中前10 d均无明显霉变现象；同时，如图4所示以5g的唾液乳杆菌发酵液粉剂添加在100g玉米饲料处理组中30d后仍然没有明显的结块，且随着唾液乳杆菌发酵液粉剂含量的增加霉变现象越不明显，添加唾液乳杆菌发酵液粉剂后的饲用玉米与未添加乳酸菌素的饲用玉米相比，有明显的延缓霉变效果。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一种唾液乳杆菌发酵液在作为饲料防霉剂中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
tacggatacc ttgttacgac tt 22
Claims (3)
1.一种唾液乳杆菌发酵液在作为饲料防霉剂中的应用，其特征在于：唾液乳杆菌发酵液是由保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）发酵制备得到，唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）的保藏编号为CGMCC No.20700。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于：唾液乳杆菌发酵液能抑制和/或杀灭真菌。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于：真菌为黄曲霉（Aspergillus flavus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、皮壳青霉（Penicillium crustosum）、卷枝毛霉（ Mucor circinelloides）、拟轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioide）、白地霉（Geotrichum candidum）中的一种或多种。
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