CN116286471A - 赤松茸提取物在提高罗伊氏乳杆菌高密度培养活菌数中的应用 - Google Patents

赤松茸提取物在提高罗伊氏乳杆菌高密度培养活菌数中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种赤松茸提取物在提高罗伊氏乳杆菌高密度培养活菌数中的应用。本发明首先通过对培养基组分以及培养条件进行优化，在此基础上添加赤松茸提取物，使得该菌的高密度培养中的活菌数达1.48×1010CFU/mL，极大地提升了该菌株的活菌数，从而有利于该菌应用于奶制品、功能性食品及保健品等益生菌产品中，为益生菌产品的研发奠定基础。

Description

赤松茸提取物在提高罗伊氏乳杆菌高密度培养活菌数中的 应用
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及赤松茸提取物在提高罗伊氏乳杆菌高密度培养活菌数中的应用。
背景技术
益生菌是一类(在摄入时)能够促进宿主肠道内微生物菌群达到生态平衡，对宿主健康产生有益作用的活性微生物。罗伊氏乳杆菌作为人体肠道中重要的微生物，是一类安全性较高、与人类健康有密切关系、并有诸多益生特性的重要益生菌，具有降胆固醇、改善和调节肠道菌群、提升机体免疫力、抑制致病菌和腐败菌(罗伊氏菌素)等功能，其作为膳食补充剂促进人体健康已获得世界的广泛认可，其在奶制品、肉制品及功能性食品中的应用也日益普遍。
当今社会人们的健康意识逐渐增强，益生菌凭借优良的益生性能受到越来越多的关注，并广泛的运用于医学、食品、保健品行业中，益生菌及其制品已成为人们争相研究的热点。而益生菌在体内的数量达到一定水平时，才能产生一定的益生效应。这就需要添加至奶制品、功能性食品及保健品中的益生菌达到相应的数量。为了展现出其价值，需要将其大量生产转化成产品。将益生菌进行高密度培养，是其能应用到生产实际的关键。高密度培养可以缩小培养体系，简化生产工艺，减少设备投资，降低生产成本，缩短生长周期，从而提高生产效率。实现益生菌株的高密度培养，就需对其生长的培养基和培养条件进行优化，使其生长速率得到最大的激发，提升其菌株的活菌数。因此益生菌高密度培养，是益生菌产品研发过程中一项很重要的基础研究工作，为益生产品的研发奠定基础。
一些研究人员针对高密度培养进行了研究，例如专利CN109666599A公开了一种罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基及发酵方法，该发明提供了一种能够同时改善发酵风味、提高发酵的活菌数的罗伊氏乳杆菌发酵培养基，活菌数达到1.17×1010(CFU/mL)。专利CN108048363A公开了一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法，该发明可以获得兼具完全有机硒和高活菌数的发酵液，但是其发酵培养控制条件是在厌氧状态下进行的，大大提高了工业生产的成本。
赤松茸(Stropharia rugosoannulata)又名大球盖菇、皱环球盖菇、酒红球盖菇，其味道鲜美，不仅富含糖类、蛋白质、矿物质、氨基酸和维生素，还含有甾醇、黄酮、酚类、凝集素等生物活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤等功效，具有广阔的市场前景和应用空间。目前对赤松茸的研究主要集中在种植栽培以及其生物活性成分(多糖、蛋白质等)，而对赤松茸对益生菌的增殖作用方面的研究未有文献报道。
发明内容
本发明的目的之一在于克服现有技术的缺点与不足，提供赤松茸提取物在提高罗伊氏乳杆菌高密度培养活菌数中的应用。
本发明的目的之二在于，通过对培养基组分的优化，提供一种高密度培养高活菌数罗伊氏乳杆菌的培养基。
本发明的目的之三在于，通过对培养条件的优化，提供一种高密度培养高活菌数罗伊氏乳杆菌的培养方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
赤松茸提取物在提高罗伊氏乳杆菌高密度培养活菌数中的应用。
优选地，所述的赤松茸提取物通过如下方法制备得到：取赤松茸子实体粉末，加入乙醇，混匀，于80℃水浴，取出后离心并收集上清液；减压蒸馏浓缩，得到赤松茸提取物；进一步优选地，取赤松茸子实体粉末，加入75％乙醇，混匀，于80℃水浴1h，取出后离心并收集上清液；减压蒸馏至原体积的1/5，向浓缩液中缓慢加入4倍体积的无水乙醇，静置过夜；离心取上清，再次减压蒸馏浓缩至1/5，浓缩液干燥，得到赤松茸提取物。
所述的赤松茸子实体粉末与乙醇的料液比为1g:60mL。
所述的离心的条件为4℃，10000×g，10min。
优选地，在所述的应用中，赤松茸提取物在培养体系中的浓度为0～300mg/L；进一步优选地，赤松茸提取物在培养体系中的浓度为45～135mg/L；最优选地，赤松茸提取物在培养体系中的浓度为90mg/L。
一种高密度培养高活菌数罗伊氏乳杆菌的培养基，包括以下浓度的组分：碳源10g/L～100g/L，氮源20g/L～120g/L，磷酸氢二钾1g/L～5g/L，柠檬酸氢二铵1g/L～6g/L，无水乙酸钠1g/L～10g/L，MnSO4·5H2O0.03 g/L～0.15g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L～1.0g/L，吐温-801mL～5mL，L-半胱氨酸盐酸盐600mg/L以内，甘油50mM以内，赤松茸提取物0～300mg/L。
优选地，所述的碳源选自麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、山梨醇中的任意一种或多种组合；所述的氮源选自酵母浸粉、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨中的一种或多种组合。
更优选地，所述的碳源为蔗糖或麦芽糖；所述的氮源为酵母浸粉和大豆蛋白胨组合。
优选地，所述的培养基包括以下浓度的组分：蔗糖30g/L～100g/L，质量比1:2～2:1的酵母浸粉和大豆蛋白胨组合30g/L～150g/L，磷酸氢二钾1g/L～4g/L，柠檬酸氢二铵2g/L～6g/L，无水乙酸钠2g/L～8g/L，MnSO4·5H2O 0.1g/L～0.15g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L～1.0g/L，吐温1mL～5mL，L-半胱氨酸盐酸盐100mg/L～600mg/L，甘油40mM～50mM，赤松茸提取物45～135mg/L。
最优选地，所述的培养基包括以下浓度的组分：包括以下浓度的组分：蔗糖96.62g/L，酵母浸粉69.29g/L，大豆蛋白胨50g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵7g/L，无水乙酸钠5g/L，MnSO4·5H2O 0.09g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，吐温-80 1mL，L-半胱氨酸盐酸盐400mg/L，甘油40mM，赤松茸提取物90mg/L。
一种高密度培养高活菌数罗伊氏乳杆菌的培养方法，包括以下步骤：
(1)将罗伊氏乳杆菌单菌落接种至MRS液体培养基中进行活化培养得种子发酵液；
(2)将步骤(1)所得种子发酵液接种至上述高密度培养高活菌数罗伊氏乳杆菌的培养基，恒温培养。
优选地，步骤(1)中所述的MRS液体培养基的包括以下浓度的组分：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，酵母浸粉4g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，无水乙酸钠5g/L，MnSO4·5H2O 0.054g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，吐温-80 1mL。
优选地，步骤(1)中所述的MRS液体培养基通过如下方法制备得到：将各组分按照所需浓度混合，加蒸馏水定容至1000mL，调节pH为6.2～6.5，121℃灭菌15～20min，冷却，备用。
优选地，步骤(1)中所述的活化培养的条件为35～38℃下恒温静置培养20～24h；进一步优选为37℃下恒温静置培养24h。
优选地，步骤(2)中所述的高密度培养高活菌数罗伊氏乳杆菌的培养基通过如下方法制备得到：将各组分按照所需浓度混合，加蒸馏水定容至1000mL，调节pH为6～7，进一步优选为6.5，121℃灭菌15～20min，冷却，备用。培养基的初始pH对罗伊氏乳杆菌的生长具有重要的影响，过酸或过碱的环境均不利于菌体的生长。优选地，培养基的初始pH为6.5时，罗伊氏乳杆菌的生长最好。
优选地，步骤(2)中所述的接种量为2％～10％(v/v)；进一步优选为4％(v/v)。不同的初始接种量对罗伊氏乳杆菌的生长有一定影响，当初始接种量太大时，会导致菌体大量生长，而培养基中的营养物质不能满足大量菌体同时生长，致使菌体密度发生下降。优选地，初始接种量为4％(v/v)，在该接种量下，罗伊氏乳杆菌的生长最好。
优选地，步骤(2)中所述的恒温培养的条件为35～38℃下50～150r/min恒温培养20～24h；进一步优选为37℃下100r/min恒温培养24h。培养温度对罗伊氏乳杆菌的生长具有重要的影响，温度过高或过低都不利于菌体的生长，可能是因为高温或低温会使植物乳杆菌的胞内酶失活或者胞内酶活性降低，从而影响菌体生长。优选地，培养温度为37℃时，罗伊氏乳杆菌的生长最好。罗伊氏乳杆菌大部分都是兼性厌氧菌，一般采取静置发酵，但是一定的转速可以使菌体与培养基中的营养成分混合均匀，从而有助于菌体的生长。优选地，转速为100rpm时，罗伊氏乳杆菌的生长最好。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
与现有的技术相比，本发明提供了一种高密度培养高活菌数罗伊氏乳杆菌的培养基和培养方法，改变了罗伊氏乳杆菌传统厌氧发酵方式的同时，解决了罗伊氏乳杆菌在有氧发酵时活菌数低的问题。
本发明操作更简单，耗时更短，大大降低了生产成本，简化了工艺流程，有利于罗伊氏乳杆菌的大规模工业化发酵生产，具有巨大的商业化应用价值。
本发明提供的培养基及培养方法，可以获得高密度(高总菌数)、高活菌数、高活性的罗伊氏乳杆菌菌液，与MRS液体培养基相比，其活菌数提高了7倍，活菌数达到1.48×1010(CFU/mL)，有利于罗伊氏乳杆菌商业化大规模生产，为该菌株用于制备以益生菌为主要成分的奶制品、功能性食品、保健食品、动物饲料等产品提供了技术基础。
附图说明
图1是实施例2、3、4和5不同培养条件对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图；其中，(a)为不同初始pH对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图，(b)为不同培养温度对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图，(c)为不同接种量对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图，(d)为不同转速对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图；
图2是实施例6和7碳源及添加量对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图；其中，(a)为不同种类碳源对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图，(b)为不同浓度蔗糖对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图；
图3是实施例8到11氮源及添加量对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图；其中，(a)为不同种类氮源对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图；(b)不同复合氮源对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图；(c)为不同的复合氮源浓度对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图；(b)氮源不同复配比对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图；
图4是实施例12和13缓冲盐对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图；其中，(a)为不同浓度柠檬酸氢二铵对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图；(b)为不同浓度柠檬酸氢二铵、不同浓度乙酸钠对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图；
图5是实施例14、15、16和17生长因子对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图；其中，(a)为不同浓度MgSO4对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图，(b)为不同浓度MnSO4对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图，(c)为不同浓度L-半胱氨酸盐酸盐、不同浓度甘油对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图，(d)为不同浓度甘油对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的比对图；
图6是实施例19Box-Behnken试验响应曲面交互作用影响图；
图7是实施例20不同浓度赤松茸提取物添加量对罗伊氏乳杆菌菌体密度和活菌数影响的比对图；其中，(a)为不同赤松茸提取物添加量对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响的对比图，(b)为不同赤松茸提取物添加量对罗伊氏乳杆菌活菌数影响的对比图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本申请使用的菌株为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)HBM11-69，已在文章“许本宏,林俊芳,郭丽琼,等.罗伊氏乳杆菌果聚糖蔗糖酶基因的克隆与表达[J].中国食品学报,2017,17(2):6.”中公开。
实施例1：罗伊氏乳杆菌高密度发酵的培养方法
(1)培养基配制
MRS液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，酵母浸粉4g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，无水乙酸钠5g/L，MnSO4·5H2O 0.054g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，吐温-80 1mL，加蒸馏水定容至1000mL，调节pH为6.3，121℃灭菌20min，冷却至室温备用。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基中加入1.5％琼脂，121℃灭菌20min。
罗伊氏乳杆菌高密度培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，酵母浸粉4g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，无水乙酸钠5g/L，MnSO4·5H2O 0.054g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，吐温-80 1mL，L-半胱氨酸盐酸盐0mg/L，甘油0mM。
(2)菌种活化
从-80℃冰箱中取出用25％甘油冻存的罗伊氏乳杆菌，用接种环挑取少量菌液划线于MRS固体培养基上，放置于37℃恒温培养箱中恒温静置培养24h后挑取单菌落，接种于MRS液体培养基中，连续活化2次后，取培养至对数生长期的菌液作为种子培养液。
(3)接种培养
将(1)制备的种子培养液，按照2％(v/v)接种量接种至罗伊氏乳杆菌高密度培养基中，培养温度为37℃，接种培养的转速为100r/min，恒温培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)。
实施例2：培养基初始pH优化
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(1)中罗伊氏乳杆菌高密度培养基初始pH不同，本实施例是将罗伊氏乳杆菌高密度培养基初始pH分别调节至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，对培养基初始pH进行优化。
发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)，确定最佳培养基初始pH。由图1中(a)可知，初始pH为6.5时，发酵液的菌体密度(OD600 nm)值最高。
实施例3：培养温度优化
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(3)中培养温度不同，本实施例是将其分别放置于不同温度(25℃、30℃、37℃、42℃、45℃)的摇床中培养，对培养温度进行优化。
发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)，确定最佳培养温度。由图1中(b)可知，培养温度为37℃时，发酵液的菌体密度(OD600 nm)值最高。
实施例4：接种量优化
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(3)中接种量不同，本实施例是按照不同接种量(2％、4％、6％、8％、10％)接种至实施例1液体培养基中，对接种量进行优化。
发酵培养20～24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)，确定最佳接种量。由图1中(c)可知，接种量为4％时，发酵液的菌体密度(OD600 nm)值最高。
实施例5：转速优化
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(3)中接种培养的转速不同，本实施例是将罗伊氏乳杆菌放置于不同转速(0rpm、50rpm、100rpm、150rpm、200rpm)恒温摇床中培养，对转速进行优化。
发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)，确定最佳转速。由图1中(d)可知，转速为100rpm时，发酵液的菌体密度(OD600 nm)值最高，
实施例6：不同碳源种类优化
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(1)中罗伊氏乳杆菌高密度培养基配制不同，将实施例1罗伊氏乳杆菌高密度培养基中的葡萄糖分别替换为麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、山梨醇，其添加量均为20g/L。
发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)，确定最佳碳源种类。由图2中(a)可知，蔗糖作为碳源时，发酵液的菌体密度(OD600 nm)值最高，对罗伊氏乳杆菌生长有显著促进作用，说明蔗糖能够更好地被其利用。
实施例7：碳源添加量的优化
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(1)中罗伊氏乳杆菌高密度培养基配制不同，将实施例1培养基中的葡萄糖分别替换为添加不同浓度的蔗糖，其添加量分别为20g/L、40g/L、60g/L、80g/L、100g/L。
发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)，确定最佳碳源添加量。由图2中(b)可知，随着蔗糖添加量的增加，罗伊氏乳杆菌菌体密度呈先上升后平稳的趋势，蔗糖添加量为80g/L时，菌体密度最高，继续增大蔗糖添加量，菌体密度并没有明显变化，并有下降的趋势。因此，优选地，选择蔗糖最适添加量为80g/L。
实施例8：不同氮源种类优化
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(1)中罗伊氏乳杆菌高密度培养基配制不同，将实施例1罗伊氏乳杆菌高密度培养基中的氮源(蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉)替换为酵母浸粉、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨，其添加量均为19g/L。
发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)，确定最佳单一氮源。由图3中(a)可知，不同的氮源对于罗伊氏乳杆菌体密度的影响具有显著性差异(P<0.05)。当培养基中氮源为酵母浸粉、大豆蛋白胨时，菌体密度最高，其次是酪蛋白胨，不适宜在胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉浸膏中生长。因此，优选地，选择酵母浸粉为最佳单一氮源。
实施例9：复合氮源优化
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(1)中罗伊氏乳杆菌高密度培养基配制不同，将实施例1罗伊氏乳杆菌高密度培养基中的氮源(蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉)替换为酵母浸粉和牛肉浸膏、酵母浸粉和大豆蛋白胨、酵母浸粉和蛋白胨、酵母浸粉和胰蛋白胨、酵母浸粉和酪蛋白胨，将最佳单一氮源与其他四种氮源复配，其中复配比按质量比1：1，其氮源总添加量均为19g/L。
发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)，确定最佳复合氮源。由图2中(b)可知，酵母浸粉与大豆蛋白胨复配时，菌体密度最高，使用混合氮源发酵，菌体密度高于使用单一氮源。因此，优选地，选择酵母浸粉和大豆蛋白胨(质量比1:1)为最佳复合氮源。
实施例10：复合氮源添加量优化
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(1)中罗伊氏乳杆菌高密度培养基配制不同，将实施例1罗伊氏乳杆菌高密度培养基中的氮源(蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉)分别替换为不同浓度的复合氮源，即酵母浸粉和大豆蛋白胨，其添加量分别为20g/L、40g/L、60g/L、80g/L、100g/L、120g/L，其中复配比按质量比1：1。
发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)，确定最佳复合氮源浓度。由图3中(c)可知，当复合氮源添加量为100g/L，罗伊氏乳杆菌发酵液的菌体密度最大，继续增大添加量，菌体密度反而下降，说明并不能利用过多的氮源。
实施例11：氮源复配比
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(1)中罗伊氏乳杆菌高密度培养基配制不同，将实施例1罗伊氏乳杆菌高密度培养基中的氮源(蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉)替换为不同质量比的氮源(酵母浸粉和大豆蛋白胨)，即1：2、1：1、2：1，其总添加量为100g/L。
发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)，确定复合氮源最佳复配比。由图3中(d)可知，复合氮源质量比为1：1时，菌体密度显著高于其他两组，菌体密度最大，说明当酵母浸粉和大豆蛋白胨质量比为1：1时，最适合罗伊氏乳杆菌生长。
实施例12：柠檬酸氢二铵添加量优化
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(1)中罗伊氏乳杆菌高密度培养基配制不同，将实施例1罗伊氏乳杆菌高密度培养基中的柠檬酸氢二铵分别替换为添加不同浓度的柠檬酸氢二铵，其添加量分别为2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L。
发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)，确定柠檬酸氢二铵最佳添加量。由图4中(a)可知，当柠檬酸氢二铵的浓度为4g/L时，菌体密度最大，继续增大浓度，菌体密度不再继续上升，并由下降的趋势。
实施例13：乙酸钠添加量优化
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(1)中罗伊氏乳杆菌高密度培养基配制不同，将实施例1罗伊氏乳杆菌高密度培养基中的乙酸钠分别替换为添加不同浓度的乙酸钠，其添加量分别为2.5g/L、5g/L、7.5g/L、10g/L。
发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)，确定乙酸钠最佳添加量。由图4中(b)可知，不同浓度乙酸钠对罗伊氏乳杆菌菌体密度的影响无显著性差异，说明乙酸钠作为缓冲盐其浓度对菌体密度的影响较小。
实施例14：MgSO4添加量优化
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(1)中罗伊氏乳杆菌高密度培养基配制不同，将实施例1罗伊氏乳杆菌高密度培养基中的MgSO4分别替换为添加不同浓度的MgSO4，其添加量分别为0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L。
发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)，确定MgSO4最佳添加量。由图5中(a)可知，当MgSO4的浓度为0.8g/L时，菌体密度最大，此时罗伊氏乳杆菌生长状况较好，最适宜该菌生长。继续增大其浓度，菌体密度不再继续上升，并呈下降的趋势。
实施例15：MnSO4添加量优化
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(1)中罗伊氏乳杆菌高密度培养基配制不同，将实施例1罗伊氏乳杆菌高密度培养基中的MnSO4分别替换为添加不同浓度的MnSO4，其添加量分别为0.03g/L、0.06g/L、0.09g/L、0.12g/L、0.15g/L。
发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)，确定MnSO4最佳添加量。由图5中(b)可知，当MnSO4的浓度为0.12g/L时，菌体密度最大，继续增大浓度，菌体密度不再继续上升，并呈下降的趋势，说明当MnSO4的浓度为0.12g/L时，最适宜该菌生长。由图5中(b)可知，不同浓度MnSO4对罗伊氏乳杆菌菌体密度的影响无显著性差异，说明MnSO4作为微量元素其浓度对菌体密度的影响较小。考虑到Mn2+是构成酶的激活剂或生物活性物质的成分，对罗伊氏乳杆菌生长代谢具有重要作用，因此，选择添加0.09g/L的MnSO4。
实施例16：L-半胱氨酸盐酸盐添加量优化
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(1)中罗伊氏乳杆菌高密度培养基配制不同，将实施例1罗伊氏乳杆菌高密度培养基中的L-半胱氨酸盐酸盐分别替换为添加不同浓度的L-半胱氨酸盐酸盐，其添加量分别为0mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、500mg/L。
发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)，确定L-半胱氨酸盐酸盐最佳添加量。由图5中(c)可知，当L-半胱氨酸盐酸盐的浓度为400mg/L时，菌体密度最大，此时罗伊氏乳杆菌生长状况较好，最适宜该菌生长。由图5中(c)可知，当L-半胱氨酸盐酸盐浓度为100～400mg/L以及600mg/L时，其对罗伊氏乳杆菌菌体密度的影响无显著性差异，说明L-半胱氨酸盐酸盐作为缓冲盐其浓度对菌体密度的影响较小。考虑到L-半胱氨酸盐酸盐具有缓解氧胁迫的作用，因此，选择添加400mg/L的L-半胱氨酸盐酸盐。
实施例17：甘油添加量优化
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(1)中罗伊氏乳杆菌高密度培养基配制不同，将实施例1罗伊氏乳杆菌高密度培养基中的甘油分别替换为添加不同浓度的甘油，其添加量分别为0mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM。
发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)，确定甘油最佳添加量。由图5中(d)可知，当甘油的浓度为40mM时，菌体密度最大，此时罗伊氏乳杆菌生长状况较好，最适宜该菌生长，继续增大甘油浓度，菌体密度不再继续增大。
实施例18：培养基配方(Plackett-Burman试验)优化
为了获得能够显著影响促进罗伊氏乳杆菌生长的因素，在单因素实验结果的基础上，采用Plackett-Burman实验设计方法，将以下培养基成分：蔗糖(A)、酵母浸粉(B)、大豆蛋白胨(C)、MgSO4·7H2O(D)、MnSO4·5H2O(E)、磷酸氢二钾(F)、无水乙酸钠(G)、柠檬酸氢二铵(H)等8个因素作为考察对象进行筛选。每个因素取低于最佳浓度(－1)和高于最佳浓度(+1)两个水平，八个因素共设置12个实验组。每个实验组重复3次，记录菌体密度平均值，最后选出对菌株菌体密度贡献最大的三个因素进行响应面分析。
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(1)中罗伊氏乳杆菌高密度培养基配制不同。本实施例目的是采用Plackett-Burman试验设计方法，选出能够显著影响促进罗伊氏乳杆菌生长的三个因素。
将以下培养基成分：蔗糖(A)、酵母浸粉(B)、大豆蛋白胨(C)、MgSO4·7H2O(D)、MnSO4·5H2O(E)、磷酸氢二钾(F)、无水乙酸钠(G)、柠檬酸氢二铵(H)等8个因素作为考察对象进行筛选。本实施例8个因素试验水平与设计如表1、表2，其余成分与实施例1完全相同。
表1Plackett-Burman试验因素水平表
Figure BDA0004048068050000101
表2Plackett-Burman试验设计与结果
Figure BDA0004048068050000102
Figure BDA0004048068050000111
表3Plackett-Burman试验方差分析表
Figure BDA0004048068050000112
注：“*”表示在p＜0.05水平上，结果显著，“**”表示在p＜0.01水平上，结果极显著。
运用Design Expert软件对实验数据进行回归分析，结果如表3所示，该回归模型P值为0.0005，极显著，相关系数R2为0.9981，说明相关性较好。结果表明，蔗糖、酵母浸粉、大豆蛋白胨、MnSO4·5H2O、无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵，对于罗伊氏乳杆菌的生长促进作用具有显著影响，再结合单因素试验的结果，选择蔗糖、酵母浸粉、柠檬酸氢二铵这三种因素为研究对象，进行响应面(Box-Behnken)优化试验。
实施例19：培养基配方(响应面试验)优化
具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(1)中罗伊氏乳杆菌高密度培养基配制不同。本实施例目的是采用响应面(Box-Behnken)试验设计方法，选取对菌体密度影响显著的3个因素蔗糖浓度(A)、酵母浸粉浓度(B)、柠檬酸氢二铵浓度(C)为考察因素，以菌体密度(OD600 nm)值为响应值，进行3因素3水平的响应面优化试验，试验因素与水平如表4，试验设计及结果如表5。
表4响应面试验因素与水平
Figure BDA0004048068050000113
表5Box-Behnken试验设计及结果
Figure BDA0004048068050000121
表6Box-Behnken设计方差分析表
Figure BDA0004048068050000122
注：“*”表示在p＜0.05水平上，结果显著，“**”表示在p＜0.01水平上，结果极显著。运用Design Expert软件对实验数据进行分析。以罗伊氏乳杆菌菌体密度作为响应值，对结果进行多元回归分析，建立回归方程：
Y＝9.43+0.48A+0.14B+0.034C+0.15AB-0.049AC+0.13BC-0.68A2-0.25B2-0.043C2正确
由回归方程可知，二次项系数估计值均为负值，说明该模型具有最大值。同时，由方差分析表6可知，响应面模型P值为0.0010(p<0.01)，极显著，失拟项P值为0.2358(p>0.05)，不显著，模型确定系数R2为0.9479，校正系数adjR2为0.8808，说明响应值Y与模型的拟合程度较好，因此该回归模型可用于分析和预测三个因素的最优配方。由系数显著性检验可知，蔗糖(A)对罗伊氏乳杆菌菌体密度影响极显著(p<0.001)，而酵母浸粉(B)、柠檬酸氢二铵(C)对其菌体密度的影响不显著。同时，二次项A2也有显著影响，二次项B2、C2均不显著，三个因素之间的交互作用也均不显著，其响应曲面图见图6。
综上所述，选取软件设计中优化结果最好的一组进行方程极值计算后，得出Box-Behnken试验设计的最优结果为蔗糖96.62g/L，酵母浸粉69.29g/L，柠檬酸氢二铵7g/L，在此优化条件下的菌体密度预测值为9.59。
为了验证模型的可靠性，按上述最佳培养基配方进行发酵试验，设置平行组，得到菌体密度平均值为9.55±0.06，与预测值相近，说明模型可靠，而且活菌数达到1.147×1010CFU/mL，是其在同等培养环境下MRS液体培养基中所得活菌数(1.87×109CFU/mL)的5倍。该结果说明，上述所得的回归方程在实际运用中可行性很高，也表明了响应面法在培养基优化应用中的高效性。
实施例20：赤松茸提取物添加量优化
(1)培养基配置
赤松茸提取物的制备：取10g赤松茸子实体粉末，按照料液比(1g:60mL)加入70％的乙醇，混匀，于80℃水浴1h，取出后离心(4℃，10000×g，10min)并收集上清液；用旋转蒸发仪减压蒸馏至原体积的1/5，向浓缩液中缓慢加入4倍体积的无水乙醇，静置过夜；离心取上清(4℃，10000×g，10min)，再次用旋转蒸发仪浓缩至20％，所有浓缩液用真空冷冻干燥机干燥，得到赤松茸提取物。
罗伊氏乳杆菌高密度培养基的制备：蔗糖96.62g/L，酵母浸粉69.29g/L，大豆蛋白胨50g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵7g/L，无水乙酸钠5g/L，MnSO4·5H2O 0.09g/L，MgSO4·7H2O0.8 g/L，吐温-80 1mL，L-半胱氨酸盐酸盐400mg/L，甘油40mM，赤松茸提取物添加量分别为0mg/L、45mg/L、90mg/L、135mg/L、180mg/L、225mg/L、270mg/L，加蒸馏水定容至1000mL。调节pH为6.5，121℃灭菌15～20min，冷却至室温备用。
(2)菌种活化
从﹣80℃冰箱中取出用25％甘油冻存的罗伊氏乳杆菌，用接种环挑取少量菌液划线于MRS固体培养基上，放置于37℃恒温培养箱中培养24h后挑取单菌落，接种于MRS液体培养基中，连续活化2次后，取培养至对数生长期的菌液作为种子培养液。
(3)接种培养
将(2)制备的种子培养液，按照4％(v/v)接种量接种至上述添加不同浓度EGT-CES的罗伊氏乳杆菌高密度培养基中，放置于37℃、100r/min恒温摇床中培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD600 nm)。
结果如图7所示，随着赤松茸提取物浓度的增加，罗伊氏乳杆菌的活菌数呈先上升后下降的趋势，当添加量为90mg/L时，活菌数最高，达到1.41×1010CFU/mL1.48×1010CFU/mL，过多的EGT-CES添加量不利于其生长。当EGT-CES为225mg/L时，菌体密度最高，而与90mg/L、135mg/L、180mg/L的添加量相比，菌体密度无显著性差异，考虑到经济因素和活菌数的结果，选择90mg/L为最优添加量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.赤松茸提取物在提高罗伊氏乳杆菌高密度培养活菌数中的应用。
2.根据权利要求1所述的赤松茸提取物在提高罗伊氏乳杆菌高密度培养活菌数中的应用，其特征在于：
所述的赤松茸提取物通过如下方法制备得到：取赤松茸子实体粉末，加入乙醇，混匀，于80℃水浴，取出后离心并收集上清液；减压蒸馏浓缩，得到赤松茸提取物。
3.根据权利要求1所述的赤松茸提取物在提高罗伊氏乳杆菌高密度培养活菌数中的应用，其特征在于：
所述的赤松茸提取物通过如下方法制备得到：取赤松茸子实体粉末，加入75％乙醇，混匀，于80℃水浴1h，取出后离心并收集上清液；减压蒸馏至原体积的1/5，向浓缩液中缓慢加入4倍体积的无水乙醇，静置过夜；离心取上清，再次减压蒸馏浓缩至1/5，浓缩液干燥，得到赤松茸提取物；
所述的赤松茸子实体粉末与乙醇的料液比为1g:60mL；
所述的离心的条件为4℃，10000×g，10min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的赤松茸提取物在提高罗伊氏乳杆菌高密度培养活菌数中的应用，其特征在于：
在所述的应用中，赤松茸提取物在培养体系中的浓度为0～300mg/L；进一步地，赤松茸提取物在培养体系中的浓度为90～180mg/L；更进一步地，赤松茸提取物在培养体系中的浓度为90mg/L。
5.一种高密度培养高活菌数罗伊氏乳杆菌的培养基，其特征在于：包括以下浓度的组分：碳源10g/L～100g/L，氮源20g/L～120g/L，磷酸氢二钾1g/L～5g/L，柠檬酸氢二铵1g/L～6g/L，无水乙酸钠1g/L～10g/L，MnSO4·5H2O0.03 g/L～0.15g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L～1.0g/L，吐温-80 1mL～5mL，L-半胱氨酸盐酸盐600mg/L以内，甘油50mM以内，赤松茸提取物0～300mg/L。
6.根据权利要求5所述的高密度培养高活菌数罗伊氏乳杆菌的培养基，其特征在于：
所述的培养基包括以下浓度的组分：蔗糖30g/L～100g/L，质量比1:2～2:1的酵母浸粉和大豆蛋白胨组合30g/L～150g/L，磷酸氢二钾1g/L～4g/L，柠檬酸氢二铵2g/L～6g/L，无水乙酸钠2g/L～8g/L，MnSO4·5H2O 0.1g/L～0.15g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L～1.0g/L，吐温1mL～5mL，L-半胱氨酸盐酸盐100mg/L～600mg/L，甘油40mM～50mM，赤松茸提取物45～135mg/L。
7.根据权利要求6所述的高密度培养高活菌数罗伊氏乳杆菌的培养基，其特征在于：
所述的培养基包括以下浓度的组分：包括以下浓度的组分：蔗糖96.62g/L，酵母浸粉69.29g/L，大豆蛋白胨50g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵7g/L，无水乙酸钠5g/L，MnSO4·5H2O 0.09g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，吐温-80 1mL，L-半胱氨酸盐酸盐400mg/L，甘油40mM，赤松茸提取物90mg/L。
8.一种高密度培养高活菌数罗伊氏乳杆菌的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将罗伊氏乳杆菌单菌落接种至MRS液体培养基中进行活化培养得种子发酵液；
(2)将步骤(1)所得种子发酵液接种至权利要求5-6任一项中所述的高密度培养高活菌数罗伊氏乳杆菌的培养基，恒温培养。
9.根据权利要求8所述的高密度培养高活菌数罗伊氏乳杆菌的培养方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的MRS液体培养基的包括以下浓度的组分：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，酵母浸粉4g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，无水乙酸钠5g/L，MnSO4·5H2O 0.054g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，吐温-80 1mL；
步骤(1)中所述的MRS液体培养基通过如下方法制备得到：将各组分按照所需浓度混合，加蒸馏水定容至1000mL，调节pH为6.2～6.5，121℃灭菌15～20min，冷却，备用；
步骤(1)中所述的活化培养的条件为35～38℃下恒温静置培养20～24h；
步骤(2)中所述的高密度培养高活菌数罗伊氏乳杆菌的培养基通过如下方法制备得到：将各组分按照所需浓度混合，加蒸馏水定容至1000mL，调节pH为6～7，121℃灭菌15～20min，冷却，备用；
步骤(2)中所述的接种的接种量为2％～10％v/v；
步骤(2)中所述的恒温培养的条件为35～38℃下50～150r/min恒温培养20～24h。
10.根据权利要求9所述的高密度培养高活菌数罗伊氏乳杆菌的培养方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的活化培养的条件为37℃下恒温静置培养20～24h；
步骤(2)中所述的高密度培养高活菌数罗伊氏乳杆菌的培养基通过如下方法制备得到：将各组分按照所需浓度混合，加蒸馏水定容至1000mL，调节pH为6.5，121℃灭菌15～20min，冷却，备用；
步骤(2)中所述的接种的接种量为4％v/v；
步骤(2)中所述的恒温培养的条件为37℃下100r/min恒温培养24h。
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