CN112175834B - 植物乳酸菌在枯草芽孢杆菌固体菌剂保存中的应用及延长枯草芽孢杆菌的保存期的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，具体涉及植物乳酸菌在枯草芽孢杆菌固体菌剂保存中的应用及延长枯草芽孢杆菌的保存期的方法。方法包括：将植物乳酸菌菌体与枯草芽孢杆菌菌体进行混合，得到混合菌体；将所述混合菌体与冷冻载体混合，并将得到的混合物进行冷冻干燥；所述冷冻载体选自可溶性淀粉、无水亚硫酸钠、珍珠盐和葡萄糖中的至少一种。本发明通过在枯草芽孢杆菌与植物乳酸菌混合制备成固体菌剂，能够有效抑制保存过程中枯草芽孢杆菌的活菌数下降，延长保存周期。

Description

植物乳酸菌在枯草芽孢杆菌固体菌剂保存中的应用及延长枯 草芽孢杆菌的保存期的方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及植物乳酸菌在枯草芽孢杆菌固体菌剂保存中的应用，以及一种延长枯草芽孢杆菌的保存期的方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌是在自然界广泛存在的一种好氧的产芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌在孢子状态下(在成熟期以孢子状态存在)稳定性极好，有耐氧化、耐挤压、耐高温、耐积水、耐酸和耐胆盐等特性，并能分泌多种酶类物质和生长未知因子。有资料表明，枯草芽孢杆菌能长期耐60℃高温，在贮存和加工条件下枯草芽孢杆菌也有很高的耐受能力；在pH值2.2-7.0范围内枯草芽孢杆菌有较高的存活率，在酸性胃环境中能保持活性。它具有很强的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等活性，代谢旺盛，对人畜无害，不污染环境，在畜牧业饲料行业应用广泛。枯草芽孢杆菌是饲用微生态制剂的常用菌种之一。枯草芽孢杆菌通过定植到目标动物肠道中，经生物夺氧作用，颉颃致病微生物，并产生多种消化酶及营养物质，产生有益代谢产物。所以枯草芽孢杆菌不仅可以改善原料风味，更重要的是它可调节消化道健康，增强动物体的免疫功能，最终预防疾病的发生，达到促进目标动物生长和提高饲料转化率的目的，因而枯草芽孢杆菌被越来越多地研制成饲用微生态制剂。
但枯草芽孢杆菌的液态种子液制备工艺复杂、保存周期短；固体菌剂应用于发酵饲料领域比较便捷，保存周期长，活菌数质量较为稳定且便于运输和储藏。目前，现有技术主要是将枯草芽孢杆菌菌体与玉米粉混合后进行冷冻干燥，得到固体菌剂，之后进行4-15℃保存。但在保存的过程中，枯草芽孢杆菌活菌数仍存在一定程度的下降，因为开发一种能够在长时间保存的情况下，枯草芽孢杆菌活菌数缓慢下降的方法势在必行。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供植物乳酸菌在枯草芽孢杆菌固体菌剂保存中的应用以及一种延长枯草芽孢杆菌的保存期的方法，本发明将植物乳酸菌应用在枯草芽孢杆菌固体菌剂的保存中，能够有效地稳定其活菌数。
为了实现上述目的，本发明一方面提供了植物乳酸菌在枯草芽孢杆菌固体菌剂保存中的应用。
本发明第二方面提供了一种延长枯草芽孢杆菌的保存期的方法，该方法包括：将植物乳酸菌菌体与枯草芽孢杆菌菌体进行混合，得到混合菌体；
将所述混合菌体与冷冻载体混合，并将得到的混合物进行冷冻干燥；所述冷冻载体选自可溶性淀粉、无水亚硫酸钠、珍珠盐和葡萄糖中的至少一种。
优选的，所述枯草芽孢杆菌体为将枯草芽孢杆发酵液进行固液分离后获得的枯草芽孢杆菌菌泥，所述枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法包括：将枯草芽孢杆菌接种在枯草芽孢杆菌发酵培养基中进行培养，得到所述枯草芽孢杆菌发酵液；其中，所述枯草芽孢杆菌发酵培养基含有豆粕、玉米粉、淀粉酶、酵母浸粉、葡萄糖和硫酸锰。
优选地，所述植物乳酸菌菌体为将植物乳酸菌发酵液进行固液分离后获得的植物乳酸菌菌泥，所述植物乳酸菌的发酵液的制备方法包括：将植物乳酸菌接种在植物乳酸菌发酵培养基中进行培养，得到所述植物乳酸菌发酵液；其中，所述植物乳酸菌发酵培养基含有酵母浸粉、醋酸钠、柠檬酸三铵、磷酸氢二钾、葡萄糖、吐温80、硫酸锰、硫酸镁、无水葡萄糖和碳酸钙。
本发明通过在枯草芽孢杆菌与植物乳酸菌混合制备成固体菌剂，能够有效抑制保存过程中枯草芽孢杆菌的活菌数下降，延长保存周期。具体的，将发酵后得到的枯草芽孢杆菌和植物乳酸菌的混合菌体与冷冻载体(优选可溶性淀粉、无水亚硫酸钠、珍珠盐和葡萄糖中的至少一种)混合后再进行冷冻干燥，由此制备得到的枯草芽孢杆菌固体菌剂能够在4-15℃的条件下长时间保存。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了植物乳酸菌在枯草芽孢杆菌固体菌剂保存中的应用。
本发明的发明人在研究中发现，将植物乳酸菌应用在枯草芽孢杆菌的固体菌剂的保存中，能够有效地减缓枯草芽孢杆菌固体菌剂保存过程中活菌数的下降，从而延长其保存期。
因此，优选的，所述应用为植物乳酸菌在延长枯草芽孢杆菌的固体菌剂的保存期中的应用。
基于如上的发现，第二方面，本发明提供了一种延长枯草芽孢杆菌的保存期的方法，该方法包括：将植物乳酸菌菌体与枯草芽孢杆菌菌体进行混合，得到混合菌体；
将所述混合菌体与冷冻载体混合，并将得到的混合物进行冷冻干燥；所述冷冻载体选自可溶性淀粉、无水亚硫酸钠、珍珠盐和葡萄糖中的至少一种。
尽管只要将植物乳酸菌应用在枯草芽孢杆菌固体菌剂的保存中，相比于不使用植物乳酸菌的枯草芽孢杆菌固体菌剂，就能够在一定程度上减缓其活菌数的下降，但本发明的发明人在研究中发现，将植物乳酸菌菌体与枯草芽孢杆菌菌体进行混合，得到混合菌体后，先与选自可溶性淀粉、无水亚硫酸钠、珍珠盐和葡萄糖中的至少一种的冷冻载体混合后，再进行冷冻干燥，由此制备得到的枯草芽孢杆菌固体菌剂的保存时间能够进一步延长。
根据本发明，优选的，所述混合菌体以混合菌泥的形式与所述冷冻载体混合，所述混合菌泥可以通过将枯草芽孢杆菌的发酵液和植物乳酸菌的发酵液混合后进行固液分离得到，也可以分别将枯草芽孢杆菌的发酵液和植物乳酸菌的发酵液固液分离后获得单独菌泥，然后再混合所得单独菌泥获得所述混合菌泥。根据本发明一种具体的实施方式，所述植物乳酸菌菌体为将植物乳酸菌发酵液进行固液分离后获得的植物乳酸菌菌泥；所述枯草芽孢杆菌体为将枯草芽孢杆发酵液进行固液分离后获得的枯草芽孢杆菌菌泥，所述混合菌体为植物乳酸菌菌泥和枯草芽孢杆菌菌泥的混合菌泥。
其中，所述固液分离的方法可以采用本领域常规的技术手段，例如，可以为离心或过滤的方法。
根据本发明，所述枯草芽孢杆菌的发酵液的获得可以参照本领域常规的方法，例如，将枯草芽孢杆菌菌种接种至发酵培养基中进行发酵，获得所述枯草芽孢杆菌的发酵液。
根据本发明，所述枯草芽孢杆菌可以为本领域常用的各种枯草芽孢杆菌，可以通过商购获得，例如，可以为获自安徽农业大学生命科学学院，编号为951NA4的枯草芽孢杆菌。
根据本发明，用于所述枯草芽孢杆菌培养的培养基可以为常规用于其培养的液体培养基。例如，用于发酵所述枯草芽孢杆菌的培养基可以含有0.3-1.0重量％的酵母粉、0.3-0.8重量％的玉米浆、0.3-0.8重量％的糖蜜、1.5-2.5重量％的玉米粉、1-3重量％的豆粕和0.008-0.05重量％的硫酸锰，pH自然。
但本发明的发明人发现，当使用含有豆粕、玉米粉、淀粉酶、酵母浸粉、葡萄糖和硫酸锰的枯草芽孢杆菌发酵培养基对枯草芽孢杆菌进行培养时，植物乳酸菌对枯草芽孢杆菌活菌数的稳定更为有效。这可能是由于培养基中的某些组分或者是枯草芽孢杆菌使用这些组分发酵后的产物能够和植物乳酸菌发生相互作用，相互作用后的产物能够反作用于枯草芽孢杆菌，从而使得枯草芽孢杆菌在保存期间的活菌数下降更为缓慢。
其中，对于所述枯草芽孢杆菌发酵培养基中含有的如上组分的含量可以在较宽的范围内进行选择，优选的，相对于100重量份的所述枯草芽孢杆菌发酵培养基，所述豆粕的含量为1-2.5重量份，所述玉米粉的含量为3-4重量份，所述淀粉酶的含量为0.01-0.03重量份，所述酵母浸粉的含量为0.5-1重量份，所述葡萄糖的含量为0.3-0.7重量份，所述硫酸锰的含量为0.01-0.03重量份。
其中，所述淀粉酶可以为耐高温淀粉酶，例如，可以耐受90℃以上温度的淀粉酶。所述淀粉酶可以在枯草芽孢杆菌发酵的过程中对培养基中含有的豆粕和玉米粉等淀粉类物质进行进一步的酶解，从而保证糖源可以稳定的提供给枯草芽孢杆菌，使得发酵性能进一步提高。
所述枯草芽孢杆菌发酵培养基还含有水，含量可根据需要进行选择，例如，可以为92-96重量％。所述枯草芽孢杆菌发酵培养基含有上述成分(豆粕、玉米粉、淀粉酶、酵母浸粉、葡萄糖和硫酸锰)或由以上成分(豆粕、玉米粉、淀粉酶、酵母浸粉、葡萄糖和硫酸锰)和水组成。其中，豆粕、玉米粉、淀粉酶、酵母浸粉、葡萄糖和硫酸锰均为常规的用来配制微生物的培养基的物质，可以通过商购获得。
对所述枯草芽孢杆菌进行液体培养时，对枯草芽孢杆菌的接种量没有特别的要求，然而，在本发明的优选实施方式中，相对于每100毫升的培养基，所述枯草芽孢杆菌的接种量为0.1-1毫升。
本发明中，对液体培养的条件没有特别的要求，可以为常规的培养枯草芽孢杆菌的条件。例如，在有氧的条件下进行培养，温度可以为35-39℃，可以通过搅拌提供氧气，搅拌速率可以为110-130rpm。
本发明中，在采用如上枯草芽孢杆菌发酵培养基对枯草芽孢杆菌进行液体培养之前，还可以对枯草芽孢杆菌进行活化，活化可以按照常规的活化方式进行。例如，可以采用含蛋白胨、酵母粉、氯化钠和葡萄糖的培养基进行活化，活化可以采用一级活化的方式，也可以采用二级活化的方式。在此不再详述。
根据本发明，所述植物乳酸菌优选为植物乳杆菌，所述植物乳杆菌可以为本领域常用的各种植物乳杆菌，可以通过商购获得，例如，可以为来自于中粮营养健康学院菌种保藏中心的植物乳杆菌(编号为BC00171)。
根据本发明，所述植物乳酸菌的发酵液的获得可以参照本领域常规的方法，例如，将植物乳酸菌菌种接种至发酵培养基中进行发酵，获得植物乳酸菌的发酵液。
根据本发明，用于所述植物乳酸菌发酵的培养基为常规用于其培养的液体培养基。例如，用于发酵所述植物乳酸菌的培养基可以为MRS肉汤培养基。
但本发明的发明人发现，当使用含有酵母浸粉、醋酸钠、柠檬酸三铵、磷酸氢二钾、葡萄糖、吐温80、硫酸锰、硫酸镁、无水葡萄糖和碳酸钙的植物乳酸菌发酵培养基对植物乳酸菌进行培养时，发酵后得到的植物乳酸菌对枯草芽孢杆菌的活菌数的稳定效果更佳。这可能是由于培养基中的某些组分或者是植物乳酸菌使用这些组分发酵后的产物能够和枯草芽孢杆菌发生相互作用，为枯草芽孢杆菌提供进一步的营养，或者抑制枯草芽孢杆菌的代谢活动，使其能够长时间存活。
其中，对于所述植物乳酸菌发酵培养基中含有的如上组分的含量可以在较宽的范围内进行选择，优选的，相对于100重量份的所述植物乳酸菌发酵培养基，所述酵母浸粉的含量为1-5重量份，所述醋酸钠的含量为0.2-0.7重量份，所述柠檬酸三铵的含量为0.1-0.3重量份，所述磷酸氢二钾的含量为0.1-0.3重量份，所述葡萄糖的含量为0.3-0.8重量份，所述吐温80的含量为0.05-0.15重量份，所述硫酸锰的含量为0.004-0.006重量份，所述硫酸镁的含量为0.01-0.03重量份，所述无水所述葡萄糖的含量为2-6重量份，所述碳酸钙的含量为2-3重量份。
所述植物乳酸菌发酵培养基还含有水，含量可根据需要进行选择，例如，可以为92-96重量％。所述植物乳酸菌发酵培养基含有上述成分(酵母浸粉、醋酸钠、柠檬酸三铵、磷酸氢二钾、葡萄糖、吐温80、硫酸锰、硫酸镁、无水葡萄糖和碳酸钙)或由以上成分(酵母浸粉、醋酸钠、柠檬酸三铵、磷酸氢二钾、葡萄糖、吐温80、硫酸锰、硫酸镁、无水葡萄糖和碳酸钙)和水组成。其中，酵母浸粉、醋酸钠、柠檬酸三铵、磷酸氢二钾、葡萄糖、吐温80、硫酸锰、硫酸镁、无水葡萄糖和碳酸钙均为常规的用来配制微生物的培养基的物质，可以通过商购获得。
对所述植物乳酸菌进行液体培养时，对植物乳酸菌的接种量没有特别的要求，然而，在本发明的优选实施方式中，相对于每100毫升的培养基，所述植物乳酸菌的接种量为0.1-1毫升。
本发明中，对液体培养的条件没有特别的要求，可以为常规的培养植物乳酸菌的条件。例如，在厌氧或兼性厌氧的条件下进行培养，温度可以为33-37℃。
本发明中，在采用如上植物乳酸菌发酵培养基对植物乳酸菌进行液体培养之前，还可以对植物乳酸菌进行活化，活化可以按照常规的活化方式进行。例如，可以在MRS肉汤培养基中进行活化，活化可以采用一级活化的方式，也可以采用二级活化的方式。在此不再详述。
根据本发明，所述冷冻载体的用量可以在较宽的范围内进行选择，优选的，相对于1重量份的所述混合菌体(以菌泥计)，所述冷冻载体的用量为3-5重量份，例如，3重量份、3.2重量份、3.4重量份、3.6重量份、3.8重量份、4重量份、4.2重量份、4.4重量份、4.6重量份、4.8重量份、5重量份。
根据本发明，只要将枯草芽孢杆菌和植物乳酸菌共同制备成固体菌剂即可在保存的过程中稳定枯草芽孢杆菌的活菌数，而对于植物乳酸菌的用量没有特别的限制。但优选的，当相对于100重量份的枯草芽孢杆菌，所述植物乳酸菌的用量为80-120重量份，例如，80重量份、90重量份、100重量份、110重量份、120重量份，能够进一步稳定枯草芽孢杆菌的活菌数，从而延长其保存期。
其中，植物乳酸菌相对于枯草芽孢杆菌的用量是指在相同形式下的用量，例如，可以为植物乳酸菌的发酵液相对于枯草芽孢杆菌的发酵液的用量，也可以为植物乳酸菌的菌泥相对于枯草芽孢杆菌的菌泥的用量。
根据本发明，所述冷冻干燥的方法可以参照本领域常规的方法，例如，可以在本领域常规使用的冷冻干燥机中进行冷冻干燥。优选的，所述冷冻干燥的条件包括：温度为-60℃至-35℃，时间为30-120min。
此外，当以本发明的固体菌剂接种进行饲用微生态制剂的制备时，由于植物乳酸菌和枯草芽孢杆菌的培养条件不同(植物乳酸菌为大部分为厌氧或兼性厌氧菌，而枯草芽孢杆菌为好氧菌)，可以通过培养条件的选择很容易的对混合发酵液中的微生物进行选择性培养。此外，也可以通过培养基的组成进行选择性的培养。还可以通过培养条件和培养基的选择使得两种微生物可以共同生长，从而丰富制备的饲用微生态制剂的有益菌群。
以下结合具体实施例对本文进行详细描述。本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂和设备等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
枯草芽孢杆菌获自安徽农业大学生命科学学院，编号为951NA4。
植物乳杆菌来自于中粮营养健康学院菌种保藏中心，编号为BC00171。
市售MRS肉汤：购自北京陆桥技术有限责任公司，牌号CM187。
单独枯草芽孢杆菌固体菌剂中活菌数的测定方法：在规定的时间内取一定量的固体菌剂，使用无菌生理盐水稀释至合适的倍数后涂布在NA平板上，37℃左右下倒置培养12小时，对菌落数进行计数(菌落为水滴状)，并计算得到相应固体菌剂中枯草芽孢杆菌的活菌数。
单独植物乳杆菌固体菌剂中活菌数的测定方法：在规定的时间内取一定量的固体菌剂，使用无菌生理盐水稀释至合适的倍数后涂布在MRS平板上，37℃左右下倒置培养24小时，对菌落数进行计数(菌落为乳白色)，并计算得到相应固体菌剂中植物乳杆菌的活菌数。
混合固体菌剂中枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的活菌数的测定：在规定的时间内取一定量的固体菌剂，使用无菌生理盐水稀释至合适的倍数，涂布NA平板用于枯草芽孢杆菌的活菌数测定(菌落为水滴状)，涂布MRS平板用于植物乳杆菌的活菌数测定(菌落为乳白色)，37℃左右下倒置培养24小时，对菌落数进行计数(菌落为乳白色)，并计算得到相应固体菌剂中的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的活菌数。
制备例1
本制备例用于说明枯草芽孢杆菌种子的活化
将保存在超低温冰箱中枯草芽孢杆菌提前0.5h自然解冻。之后以0.1体积％的接种量接种到含有0.5重量％酵母粉、1重量％蛋白胨、0.5重量％葡萄糖和1重量％氯化钠的灭菌种子培养基中进行种子的活化培养。培养条件为30±2℃培养，转速100rppm，待OD值长至2.6，pH为6.0左右，一级种子摇瓶结束，活菌数109cfu/ml。
制备例2
本制备例用于说明植物乳酸菌种子的活化
将保存在超低温冰箱中植物乳杆菌提前0.5h自然解冻。之后以0.2体积％的接种量接种到灭菌的MRS肉汤培养基中进行种子的活化培养。静置35±2℃培养。待OD值长至6-7，pH为4.0左右，一级种子摇瓶结束，活菌数1010cfu/ml。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的延长枯草芽孢杆菌固体菌剂保存期的方法
(1)枯草芽孢杆菌的发酵培养
培养基：豆粕1.8重量％，玉米粉3.4重量％，高温淀粉酶0.2重量‰，酵母浸粉0.8重量％，葡萄糖0.5重量％，硫酸锰0.2重量‰，pH自然，121℃灭菌30min备用。
将制备例1制备的枯草芽孢杆菌的活化种子液以0.1体积％的接种量接种在上述培养基中，37±2℃培养，转速120rppm，待OD值长至9.5左右，pH为7.2左右，发酵摇瓶结束，活菌数1010cfu/ml。
(2)植物乳杆菌的发酵培养
培养基：酵母浸粉3重量％，醋酸钠0.5重量％，柠檬酸三铵0.2重量％，磷酸氢二钾0.2重量％，葡萄糖0.5重量％，吐温80 0.1体积％，硫酸锰0.05重量‰，硫酸镁0.2重量‰，无水葡萄糖4重量％，碳酸钙2.5重量％，pH自然，121℃灭菌30min备用。
将制备例2制备的植物乳杆菌的活化种子液以0.2体积％的接种量接种在上述培养基中，静置35±2℃培养。待OD值长至6-7，pH为7.0左右，发酵摇瓶结束，活菌数1012cfu/ml。
(3)枯草芽孢杆菌的储存
将步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌的发酵液和植物乳杆菌的发酵液分别离心进行固液分离，得到枯草芽孢杆菌的菌泥和植物乳杆菌的菌泥，将枯草芽孢杆菌的菌泥和植物乳杆菌的菌泥按照100:100的重量比进行混合，得到混合菌泥，相对于1重量份的混合菌泥，加入4重量份的可溶性淀粉，然后在-60℃进行冷冻干燥12小时，得到植物乳杆菌固体菌剂，真空无菌包装后置于15℃的条件下进行保存，并在1个月、3个月、6个月和12月检测固体菌剂中枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌固体的活菌数，同时制备单独的枯草芽孢杆菌固体菌剂和单独的植物乳杆菌固体菌剂作为对照，结果如表1所示。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的延长枯草芽孢杆菌固体菌剂保存期的方法
培养基：豆粕1重量％，玉米粉4重量％，高温淀粉酶0.1重量‰，酵母浸粉1重量％，葡萄糖0.3重量％，硫酸锰0.3重量‰，pH自然，121℃灭菌30min备用。
将制备例1制备的枯草芽孢杆菌的活化种子液以0.1体积％的接种量接种在上述培养基中，37±2℃培养，转速120rppm，待OD值长至9.5左右，pH为7.2左右，发酵摇瓶结束，活菌数1010cfu/ml。
(2)植物乳杆菌的发酵培养
培养基：酵母浸粉1重量％，醋酸钠0.2重量％，柠檬酸三铵0.3重量％，磷酸氢二钾0.3重量％，葡萄糖0.8重量％，吐温80 0.05体积％，硫酸锰0.04重量‰，硫酸镁0.3重量‰，无水葡萄糖2重量％，碳酸钙2重量％，pH自然，121℃灭菌30min备用。
将制备例2制备的植物乳杆菌的活化种子液以0.2体积％的接种量接种在上述培养基中，静置35±2℃培养。待OD值长至6-7，pH为7.0左右，发酵摇瓶结束，活菌数1012cfu/ml。
(3)枯草芽孢杆菌的储存
将步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌的发酵液和植物乳杆菌的发酵液分别进行固液分离，得到枯草芽孢杆菌的菌泥和植物乳杆菌的菌泥，将枯草芽孢杆菌的菌泥和植物乳杆菌的菌泥按照100:80的重量比进行混合，得到混合菌泥，相对于1重量份的混合菌泥，加入3重量份的珍珠盐，然后在-60℃进行冷冻干燥12小时，得到植物乳杆菌固体菌剂，真空无菌包装后置于15℃的条件下进行保存，并在1个月、3个月、6个月和12月检测固体菌剂中枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌固体的活菌数，同时制备单独的枯草芽孢杆菌固体菌剂和单独的植物乳杆菌固体菌剂作为对照，结果如表1所示。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的延长枯草芽孢杆菌固体菌剂保存期的方法
培养基：豆粕2.5重量％，玉米粉3重量％，高温淀粉酶0.3重量‰，酵母浸粉0.5重量％，葡萄糖0.7重量％，硫酸锰0.1重量‰，pH自然，121℃灭菌30min备用。
将制备例1制备的枯草芽孢杆菌的活化种子液以0.1体积％的接种量接种在上述培养基中，37±2℃培养，转速120rppm，待OD值长至9.5左右，pH为7.2左右，发酵摇瓶结束，活菌数1010cfu/ml。
(2)植物乳杆菌的发酵培养
培养基：酵母浸粉5重量％，醋酸钠0.7重量％，柠檬酸三铵0.1重量％，磷酸氢二钾0.1重量％，葡萄糖0.3重量％，吐温80 0.15体积％，硫酸锰0.06重量‰，硫酸镁0.1重量‰，无水葡萄糖6重量％，碳酸钙3重量％，pH自然，121℃灭菌30min备用。
将制备例2制备的植物乳杆菌的活化种子液以0.2体积％的接种量接种在上述培养基中，静置35±2℃培养。待OD值长至6-7，pH为7.0左右，发酵摇瓶结束，活菌数1012cfu/ml。
(3)枯草芽孢杆菌的储存
将步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌的发酵液和植物乳杆菌的发酵液分别进行固液分离，得到枯草芽孢杆菌的菌泥和植物乳杆菌的菌泥，将枯草芽孢杆菌的菌泥和植物乳杆菌的菌泥按照100:120的重量比进行混合，得到混合菌泥，相对于1重量份的混合菌泥，加入5重量份的无水亚硫酸钠和葡萄糖(重量比1:1)，然后在-60℃进行冷冻干燥12小时，得到植物乳杆菌固体菌剂，真空无菌包装后置于15℃的条件下进行保存，并在1个月、3个月、6个月和12月检测固体菌剂中枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌固体的活菌数，同时制备单独的枯草芽孢杆菌固体菌剂和单独的植物乳杆菌固体菌剂作为对照，结果如表1所示。
实施例4
本实施例用于说明本发明提供的延长枯草芽孢杆菌固体菌剂保存期的方法
按照实施例1的方法进行枯草芽孢杆菌固体菌剂的制备，不同的是，枯草芽孢杆菌的发酵培养基由1.0重量％的酵母粉、0.8重量％的玉米浆、0.8重量％的糖蜜、2.5重量％的玉米粉、2重量％的豆粕、0.03重量％的硫酸锰和余量的水组成，pH自然，结果如表1所示。
实施例5
本实施例用于说明本发明提供的延长枯草芽孢杆菌固体菌剂保存期的方法
按照实施例1的方法进行枯草芽孢杆菌固体菌剂的制备，不同的是，植物乳杆菌的发酵培养在MRS肉汤培养基中进行，结果如表1所示。
实施例6
本实施例用于说明本发明提供的延长枯草芽孢杆菌固体菌剂保存期的方法
按照实施例1的方法进行枯草芽孢杆菌固体菌剂的制备，不同的是，将可溶性淀粉替换为等量的玉米粉，结果如表1所示。
对比例1
本对比例用于说明参比的枯草芽孢杆菌固体菌剂的制备方法
按照实施例1的方法进行枯草芽孢杆菌的发酵，不同的是，将用于植物乳杆菌的发酵培养基与用于枯草芽孢杆菌的发酵培养基1:1合并后，接种枯草芽孢杆菌进行发酵培养，将培养后的发酵液在与实施例1相同的条件下进行枯草芽孢杆杆菌固体菌剂的制备，也即，结合植物乳杆菌的培养基和枯草芽孢杆菌的培养基，对枯草芽孢杆菌进行培养，而不再将植物乳杆菌用于枯草芽孢杆菌固体菌剂的制备中，结果如表1所示。
对比例2
本对比例用于说明参比的枯草芽孢杆菌固体菌剂的制备方法
将实施例1步骤(1)制备得到的枯草芽孢杆菌的发酵液不与植物乳杆菌的发酵液混合，而是按照实施例1的条件单独制备成枯草芽孢杆菌固体菌剂，结果如表1所示。
对比例3
本对比例用于说明参比的枯草芽孢杆菌固体菌剂的制备方法
按照实施例1的方法进行枯草芽孢杆菌的发酵，不同的是，将植物乳杆菌替换为嗜酸乳酸菌，保藏号为CGMCC1.1854，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002120698320000161
将实施例和对比例相比可以看出，在枯草芽孢杆菌固体菌剂制备的过程中加入植物乳酸菌，能够有效地稳定枯草芽孢杆菌的活菌数。将实施例1与实施例4-5相比可以看出，使用特定的植物乳杆菌发酵培养基和枯草芽孢杆菌的发酵培养基能够进一步稳定枯草芽孢杆菌的活菌数。将实施例1与实施例6相比可以看出，在冷冻干燥时使用本发明优选的冷冻载体能够进一步稳定枯草芽孢杆菌的活菌数。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.植物乳杆菌在枯草芽孢杆菌固体菌剂保存中的应用；
其中，所述植物乳杆菌能够减缓枯草芽孢杆菌固体菌剂保存过程中活菌数的下降，从而延长所述枯草芽孢杆菌的保存期。
2.一种减缓枯草芽孢杆菌固体菌剂保存过程中活菌数的下降的方法，其特征在于，该方法包括：将植物乳杆菌菌体与枯草芽孢杆菌菌体进行混合，得到混合菌体；
将所述混合菌体与冷冻载体混合，并将得到的混合物进行冷冻干燥；所述冷冻载体选自无水亚硫酸钠和葡萄糖的组合、可溶性淀粉和珍珠盐中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述植物乳杆菌菌体为将植物乳杆菌发酵液进行固液分离后获得的植物乳杆菌菌泥；和/或
所述枯草芽孢杆菌体为将枯草芽孢杆发酵液进行固液分离后获得的枯草芽孢杆菌菌泥。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法包括：将枯草芽孢杆菌接种在枯草芽孢杆菌发酵培养基中进行培养，得到所述枯草芽孢杆菌发酵液；
其中，所述枯草芽孢杆菌发酵培养基含有豆粕、玉米粉、淀粉酶、酵母浸粉、葡萄糖和硫酸锰。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，相对于100重量份的所述枯草芽孢杆菌发酵培养基，所述豆粕的含量为1-2.5重量份，所述玉米粉的含量为3-4重量份，所述淀粉酶的含量为0.01-0.03重量份，所述酵母浸粉的含量为0.5-1重量份，所述葡萄糖的含量为0.3-0.7重量份，所述硫酸锰的含量为0.01-0.03重量份。
6.根据权利要求2-5中任意一项所述的方法，其中，相对于1重量份的所述混合菌体，所述冷冻载体的用量为3-5重量份。
7.根据权利要求2-5中任意一项所述的方法，其中，相对于100重量份的枯草芽孢杆菌，所述植物乳杆菌的用量为80-120重量份。
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