CN110804571B - 一种复合乳酸菌制剂及在制备成饲料添加剂中的应用 - Google Patents
一种复合乳酸菌制剂及在制备成饲料添加剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一种复合乳酸菌制剂及在制备成饲料添加剂中的应用，本发明涉及到一株干酪乳杆菌F209，该菌株对模拟胃液、胆盐以及人工肠液都有较强的耐受，且该菌株产酸迅速，L‑乳酸产率高，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用，显示出较强的益生特性。利用该菌株和布拉氏酵母SH94共发酵后，产品乳酸菌活菌数≥30×10^8 CFU/g，酵母菌活菌数≥0.3×10^8 CFU/g，在4℃、20℃和30℃条件下储存3个月后乳酸菌存活率分别为92%、76%和67%；酵母菌存活率分别为72%、57%和42%。该复合菌剂应用在小龙虾和保育猪养殖上能显著提高生产性能，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种复合乳酸菌制剂及在制备成饲料添加剂中的应用。
背景技术
乳酸菌是一类能够快速发酵碳水化合物，并以乳酸为主要代谢产物的革兰氏阳性细菌，自然定植于动物体的消化道中，是动物肠道中的正常菌群。乳酸菌可以通过粘附素与肠粘膜细胞紧密结合，在肠粘膜表面定植占位；还能产生多种抑菌因子，抑制有害菌繁殖；进而改善肠道内菌群结构，提高动物机体免疫力；保持动物健康，提高生产能力。
1947年乳酸菌首次被用于饲料添加剂，Hansen等人发现使用乳酸杆菌可以显著改善保育仔猪的生理健康。随后大量的试验数据证明，乳酸杆菌对由大肠杆菌、沙门氏菌等动物肠道致病菌引起的疾病具有良好的预防效果和治疗作用。目前，乳酸菌主要是通过发酵饲料或者饮水方式应用，其中干酪乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌以及粪肠球菌等应用较为广泛。乳酸菌高温干燥(喷雾干燥、高温流化床和沸腾炉等)存活率低，干燥产品失活快，而低温冷冻干燥成本高昂限制其推广应用，如何提高乳酸菌干燥存活率和延长保存期一直是研究人员关注的热点。故市场上多是使用乳酸菌液态产品，而菌液在运输和储存过程中活力损失快，长期储存后直接使用效果不理想。
市场上的干酪乳杆菌液体产品发酵水平不高，一般不到20亿CFU/ml，一个月货架期后降到10亿CFU/ml以下，发酵水平和货架期活性都有待提高。另外乳酸菌产品大多是单一乳酸菌或者几种乳酸菌复配而成，大量的研究和实践证明芽孢杆菌、酵母和丁酸梭菌等菌种也有很好的益生效果，多菌种复配的微生态制剂在生产应用有更大的应用价值和市场前景。同时我们发现某些种酵母和乳酸菌共培养可以提高乳酸菌发酵水平并增强储存期内乳酸菌活性，有较好的推广应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株具有益生特性的乳酸菌，该菌株为干酪乳杆菌(lactob acillus casei)F209，保藏编号为CCTCC NO：M2018572。
本发明的另一个目的在于提供了一种复合乳酸菌制剂，该乳酸菌制剂包括干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)F209和布拉氏酵母SH94(CCTCC NO:M2014211)。
本发明还有一个目的在于提供了干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)F209在制备成饲料添加剂中的应用。
本发明的最后一个目的在于提供了复合乳酸菌制剂在制备成饲料添加剂中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人自泡菜中分离得到一株乳酸菌，经16S rDNA基因序列鉴定为干酪乳杆菌，该菌株已于该菌株已于2018年8月28日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Lactobacillus casei F209，保藏编号为：CCTCC NO：M2018572，地址：中国武汉武汉大学。
所述干酪乳杆菌F209(Lactobacillus caseiF209)为革兰氏阳性球菌，无芽孢。在MRS固体培养基上菌落为乳白色、表面光滑湿润、液滴状、圆形、隆起、边缘整齐，菌落直径约3mm。菌株经简单染色后在显微镜下观察，形状呈杆状，单个或成对状，大小为0.9-1.0um×4.5-6.0μm，无鞭毛。兼性厌氧，不还原硝酸盐，不液化明胶，接触酶和氧化酶皆阴性。利用葡萄糖同型乳酸发酵产L-乳酸；最适生长温度为37℃。
本发明提供的干酪乳杆菌F209(Lactobacillus caseiF209)除具有上述特征之外，还具有耐酸、耐胆盐，产酸速率快，抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等生物学特性。
一种复合乳酸菌制剂，包括干酪乳杆菌F209(CCTCC NO：M2018572)和布拉氏酵母SH94(CCTCC NO：M2014211)。
以上所述的复合乳酸菌制剂，优选的，干酪乳杆菌F209(CCTCC NO：M2018572)和布拉氏酵母SH94(CCTCC NO：M2014211)的有效菌浓度比例为：100～200：1。
一种复合乳酸菌制剂的制备方法，包括将干酪乳杆菌F209(CCTCC NO：M2018572)和布拉氏酵母SH94(CCTCC NO：M2014211)种子液接种于发酵培养基中；
所述的发酵培养基以下述方法制备得到：
1-3份小麦和3-6份玉米粉碎后加100份水，55-70℃加入0.01-1份糖化酶(20万U/g)和0.001-0.5份普鲁兰酶(20万U/g)并保温0.5-1.5h，之后加入0.5-2份酵母浸膏和0.01-1份氢氧化钠并后灭菌，以上均为重量份。
以上所述的制备方法，优选的，干酪乳杆菌F209种子液接种1-10％，布拉氏酵母SH94接种0.1-1％，30-37℃条件下静置或者低速(≤100rpm)搅拌发酵36-48h即得。
干酪乳杆菌F209或复合乳酸菌(干酪乳杆菌F209和布拉氏酵母SH94)在制备成饲料添加剂中的应用，包括可用于水产饲料添加剂和畜禽类饲料添加剂，特别优选于猪、小龙虾。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.乳酸菌和酵母菌共发酵可以明显提高乳酸菌发酵水平，获得更高活菌数发酵液，产品乳酸菌活菌数≥30×10^8CFU/g，酵母菌活菌数≥0.3×10^8CFU/g。
2.共培养后的乳酸菌在储存期内活性损失降低，保留更多有效活菌；在不额外添加菌株保护剂的情况下，可显著提升乳酸菌的存活率。
3.发酵液中同时含有乳酸菌和酵母菌代谢产物及活性菌体，增强益生效果。
4.本发明的复合乳酸菌制剂拌料饲喂小龙虾后，可显著提高小龙虾产量，提高存活率；用于仔猪则可显著降低腹泻率，降低料肉比，促进仔猪生长。
附图说明
图1为干酪乳杆菌F209平板菌落形态图。
图2为干酪乳杆菌F209简单染色镜检形态图。
图3为干酪乳杆菌F209在5L发酵罐中发酵时物质变化图。
图4为干酪乳杆菌F209的500L发酵罐中发酵时物质变化图。
图5为乳酸菌液体制剂90天储存期内存活率变化图。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
干酪乳杆菌F209菌株的筛选：
1.培养基的配制：
BCP培养基:蛋白胨5g；酵母膏3g；乳糖5g；琼脂20g；0.5％溴甲酚紫10ml；蒸馏水1000ml；pH值6.8～7.0。
MRS液体培养基：葡萄糖20g/L；蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；牛肉浸粉10g/L；柠檬酸二铵2g/L；醋酸钠5g/L；吐温80 1g/L；磷酸氢二钾2g/L。
YG液体培养基：葡萄糖20g/L；酵母浸粉5g/L。
固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5％的琼脂，所有培养基115℃灭菌20min。
2.筛选：取泡菜样品5g置于200ml MRS液体培养基中静置培养18h后，取1ml培养液梯度稀释，涂布BCP平板，37℃培养48h后挑选其中典型乳酸菌菌落形态(菌落周边变黄)的菌落进行划线分离培养，共挑选10个，将得到的单菌落转接到100ml MRS液体培养基37℃培养18h，MRS斜面保藏，同时将培养好的MRS培养基各转接1ml到100ml YE液体培养基中，37℃培养18h后取样检测葡萄糖和乳酸含量，并计算产酸速率和乳酸得率。
菌株干酪乳杆菌F209产酸速率最快(2.0g/L/h)，同时乳酸得率也最高(0.92g/g葡萄糖)，且所产乳酸L-乳酸的纯度达到98％。
菌株F209生化鉴定：用结晶紫对筛选出来的目的菌株F209进行简单染色，并通过光学显微镜进行观察。发现该菌株为革兰氏阳性球菌，无芽孢。在MRS固体培养基上菌落为乳白色、表面光滑湿润、液滴状、圆形、隆起、边缘整齐，菌落直径约3mm(图1)。生理生化鉴定菌株F209兼性厌氧，不还原硝酸盐，不液化明胶，接触酶和氧化酶皆阴性。利用葡萄糖同型乳酸发酵产L-乳酸；最适生长温度为37℃。
菌株的16s rDNA鉴定：挑取F209单菌落用通用引物进行扩增，对扩增产物进行16Sr DNA测序分析。结果表明该序列与Lactobacillus casei16S rDNA序列的相似性最高，达99％，可确定该菌株为干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌F209。该菌株已于2018年8月28日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Lactobacillus casei F209，保藏编号为：CCTCC NO：M2018572，地址：中国武汉武汉大学。
实施例2：
干酪乳杆菌F209益生性能试验：
取生长至对数后期的干酪乳杆菌F209种子液离心，用0.9％的生理盐水洗涤两次后重新悬浮，以108CFU/ml的量接种到pH 2.5的人工胃液中，于37℃水浴锅中孵育培养，每隔1h取样稀释涂YPD平板测定活菌数。
结果显示该干酪乳杆菌F209耐受pH 2.5的模拟胃液达1h时，存活率75.25％；2h时，存活率37.35％；3h时，存活率16.65％。
取生长至对数后期的干酪乳杆菌F209种子液离心，用0.9％的生理盐水洗涤两次后重新悬浮，以108CFU/mL的量接种到人工肠液中，于37℃水浴锅中孵育培养8h取样稀释涂YPD平板测定活菌数。
结果显示该干酪乳杆菌F209在人工肠液处理1、3、5、8h后存活率分别为93.55％、83.40、66.67、56.32％。
取生长至对数后期的干酪乳杆菌F209种子液离心，用0.9％的生理盐水洗涤两次后重新悬浮，以108CFU/mL的量接种到0.1％-0.5％的猪胆盐环境中，于37℃水浴锅中孵育培养6h取样稀释涂YPD平板测定活菌数。
结果显示该干酪乳杆菌F209在0.1％-0.5％的猪胆盐环境中，该干酪乳杆菌的存活率随着猪胆盐浓度升高而逐渐降低。在猪胆盐浓度0.1％时37℃孵育6h，存活率为85.67％；在猪胆盐浓度0.2％时37℃孵育6h，存活率为75.58％；在猪胆盐浓度0.3％时37℃孵育6h，存活率为57.50％；在猪胆盐浓度0.4％时37℃孵育6h，存活率为48.53％；在猪胆盐浓度0.5％时37℃孵育6h，存活率为37.56％。
用牛津杯法检验干酪乳杆菌F209对大肠杆菌K88以及金黄色葡萄球菌的抑菌性能。
结果显示该干酪乳杆菌F209的菌液以及发酵液上清对2种常见致病菌(大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌ATCC27217)有较强的抑制作用，抑菌圈直径分别为28.5±0.4mm和22.4±0.5mm，菌液和上清液抑菌圈直径无显著性差异。
实施例3：
干酪乳杆菌F209单发酵及与布拉氏酵母SH94(CCTCC NO:M2014211)共发酵：
发酵培养基制备：20g小麦和40g玉米粉碎过80目筛，加水1000ml，升温至60℃加入0.1g糖化酶(酶活20万U/g)以及0.01g普鲁兰酶(酶活2000U/g)并保温60min，之后加入10g酵母浸膏和0.5g氢氧化钠并升温至115℃灭菌20min。
种子液：YPD培养基(1％酵母浸粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖)115℃灭菌20min后冷却至室温，接入1％乳酸菌后于37℃静置培养24h得到乳酸菌种子液，接种5％酵母菌后于30℃150rpm条件下培养24h得到酵母菌种子液。
采用5L发酵罐进行实验。按上述配方配制发酵培养基3L，发酵过程控制温度35℃，50rpm搅拌，单发酵组和共发酵组都按3％(体积比)(以下同)接种量接入干酪乳杆菌F209种子液，共发酵组再按2％的接种量接入布拉氏酵母SH94种子液开始发酵，36h后结束发酵。发酵过程中每隔6h取样测定还原糖浓度、pH、酸度、乳酸菌和酵母菌数(图3)。
结果表明，36h发酵周期内单发酵组pH由7.25降至3.38；酸度为2.2％(以乳酸计)；发酵结束时干酪乳杆菌活菌数为23×108CFU/g，仍有2.2％的还原糖残留。36h发酵周期内共发酵组pH由7.25降至3.0；酸度为3.2％(以乳酸计)；发酵结束时乳酸菌活菌数为38×108CFU/g，较单发酵组提高65％，布拉氏酵母活菌数为0.33×10^8CFU/g；大部分还原糖被消耗，但仍有1％的还原糖残留。残留的还原糖可作为保存期微生物的营养，满足其微弱的维持消耗，提高存活率。
300L中试发酵：干酪乳杆菌F209菌种用YPD液体培养基活化后，转接到500ml液体培养基中，37℃静置培养24h；布拉氏酵母SH94种用YPD液体培养基活化后，转接到300ml液体培养基中，30℃150rpm培养24h。300L发酵培养基灭菌后冷却至35℃后，单发酵组和共发酵组都按3％接种量接入干酪乳杆菌F209种子液，共发酵组再按2％的接种量接入布拉氏酵母SH94种子液，100rpm并维持35℃发酵48h下罐。发酵过程中每隔6h取样测定还原糖浓度、pH、酸度、乳酸菌和酵母菌数(图4)
结果表明，48h发酵周期内单发酵组pH由7.36降至3.45；还原糖残留2.3％；酸度为2.2％(以乳酸计)；发酵结束时干酪乳杆菌活菌数为22×108CFU/g。48h发酵周期内共发酵组(复合乳酸菌组)pH由7.36降至2.88；大部分还原糖被消耗，只有约1％的还原糖残留；酸度为3.3％(以乳酸计)；发酵结束时干酪乳杆菌活菌数为37×108CFU/g，较单发酵组增加15×108CFU/g，布拉氏酵母活菌数为0.32×108CFU/g。从5L罐放大到300L罐的两组发酵产物的检测结果相近，表明该复合乳酸菌液体制剂发酵制备方式较成熟，可小规模也可大规模生产，产品质量较稳定受生产规模影响不大。
实施例4：
复合乳酸菌液体制剂的耐受实验：
1)保藏实验：
将实施例3中300L中试的发酵液灌装入500ml的塑料瓶中，盖紧瓶盖后分别放置在4℃、20℃和30℃恒温环境中储存3个月，每15天取样并稀释平板法检测活菌数以及pH变化。
(1)共发酵组干酪乳杆菌F209在储存期内存活率变化如表1所示，前一个月存活率略有上升，这是因为干酪乳杆菌F209在储存过程中还在缓慢增殖，但是之后存活率就不断下降，30天时4℃、20℃和30℃储存温度条件下的存活率分别为102％、109％和102％；60天时4℃、20℃和30℃储存温度条件下的存活率分别为94％、98％和87％；到第90天时4℃、20℃和30℃储存温度条件下的存活率分别为92％、76％和67％。
表1复合乳酸菌液体制剂储存期干酪乳杆菌F209存活率变化。
(2)布拉氏酵母SH94存活率变化如表2所示，其存活率在储存周期内几乎一直在下降，到60天以后存活率下降幅度变缓，30天时4℃、20℃和30℃储存温度条件下的存活率分别为96％、88％和78％；60天时4℃、20℃和30℃储存温度条件下的存活率分别为81％、72％和51％；到第90天时4℃、20℃和30℃储存温度条件下的存活率分别为72％、57％和42％。
表2复合乳酸菌液体制剂储存期布拉氏酵母SH94存活率变化
(3)单发酵组干酪乳杆菌F209在储存期内存活率变化如表3所示，存活率不断下降，30天时4℃、20℃和30℃储存温度条件下的存活率分别为91％、68％和59％；60天时4℃、20℃和30℃储存温度条件下的存活率分别为83％、47％和41％；到第90天时4℃、20℃和30℃储存温度条件下的存活率分别为78％、37％和28％，只有共发酵组存活率的85％、49％和42％，表明共发酵可以提高储存期内乳酸菌的存活率。从结果也可以看出储存温度越低，两种菌的存活率越高，故在活菌类产品储存时应尽可能低温。
表3复合乳酸菌液体制剂储存期布拉氏酵母SH94存活率变化
2)复合乳酸菌的耐胃酸、肠液、胆盐的情况，要比单独的干酪乳杆菌F209或者布拉氏酵母SH94要好。
表4复合乳酸菌液体制剂在模拟胃酸、肠液和胆盐环境下的存活率
实施例5：
复合乳酸菌液体制剂在虾饲料上的应用：
虾饲料拌料方法：1kg乳酸菌液体制剂(实施例3中300L罐制备的乳酸菌产品，包括共发酵和单发酵的，储存1个月后使用)稀释到20kg后分别拌入200kg全价颗粒虾饲料，对应为共发酵组和单发酵组，混匀后装入饲料袋中，扎紧口袋置于20-30℃发酵24h以上后投喂。
4月上旬挑选体长3-4cm的健康虾苗放入虾塘内，每亩虾塘放50kg。两亩作为共发酵组，两亩作为单发酵组，都投喂发酵料；三亩对照组，投喂未发酵全价颗粒料。饲养周期三个月，管理模式相同，每天虾饲料投喂量相同(干物质)。养殖结果如表5：
表5复合乳酸菌液体制剂发酵虾全价料养殖实验结果
共发酵组通过投喂复合乳酸菌发酵饲料小龙虾亩产平均可达202kg，较对照组平均亩产171kg提高17.5％；且实验组小龙虾均重可达40g，较对照组均重36g增重11％；平均存活率也由86.3％提高到89.6％。单发酵组小龙虾平均亩产192kg，小龙虾均重39.3g，较对照组分别提高12.3％和9.2％，但是较共发酵组增加幅度略低，表明饲喂乳酸菌制剂的虾拌料可以提高小龙虾增重以及存活率，增加养殖效益，共发酵的复合乳酸菌制剂养殖效果更好，效益更高。。
实施例6：
复合乳酸菌液体制剂在保育仔猪饲养中的应用：
使用方法：将乳酸菌液(实施例3中300L罐制备的乳酸菌产品，包括共发酵和单发酵的，储存1个月后使用)分别直接加入水箱中，对应为共发酵组和单发酵组，保育仔猪通过饮水摄入，按每头猪每天5ml的量添加，以不添加任何物质的饮用水为对照组。
每组在同一保育舍中，各6栏，断奶保育仔猪随机分配到18(3组共18栏)栏中，每栏18头，先饲养一周，每栏单独称重后开始实验，饲喂管理方式相同，实验周期30天，结束后称重。结果如表6：
表6断奶保育仔猪饮水添加复合乳酸菌液体制剂实验结果
共发酵组保育仔猪饮水中添加复合乳酸菌液后平均日增重较对照组提高5.3％，实验结束时平均增重0.57kg，日均采食量提高1.8％，料肉比有降低，生产能力有明显提高。单发酵组保育仔猪饮水中添加单乳酸菌液后平均日增重较对照组提高2.9％，实验期内增重0.35kg，料肉比略低于对照组，生产能力有所提高但不如共发酵组效果。单发酵组和共发酵组腹泻率都显著低于对照组，且共发酵组腹泻率更低，说明饮水中添加乳酸菌液可以有效减少腹泻发生率增强肠道健康状态维持小猪健康，提高生产性能，且复合乳酸菌液益生效果要优于单乳酸菌。
Claims (8)
1.一株分离的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，所述干酪乳杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2018572。
2.一种复合乳酸菌制剂，包括干酪乳杆菌和布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)SH94，所述干酪乳杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2018572，所述布拉氏酵母SH94的保藏编号为CCTCC NO：M2014211。
3.根据权利要求2所述的复合乳酸菌制剂，所述的干酪乳杆菌和布拉氏酵母SH94的有效菌浓度比例为：100～200：1。
4.权利要求2所述的复合乳酸菌制剂的制备方法，包括将干酪乳杆菌和布拉氏酵母SH94种子液接种于发酵培养基中；
所述的发酵培养基以下述方法制备得到：
1-3份小麦和3-6份玉米粉碎后加100份水，55-70℃加入0.01-1份糖化酶和0.001-0.5份普鲁兰酶并保温0.5-1.5h，之后加入0.5-2份酵母浸膏和0.01-1份氢氧化钠并后灭菌，以上均为重量份。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：接种时，干酪乳杆菌种子液接种1-10％，布拉氏酵母SH94接种0.1-1％，30-37℃条件下静置或者低速搅拌发酵36-48h即得；所述的低速的速率≤100rpm。
6.权利要求1所述的干酪乳杆菌在制备饲料添加剂中的应用。
7.权利要求2所述的复合乳酸菌制剂在制备饲料添加剂中的应用。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的应用，所述的饲料添加剂为水产动物饲料添加剂或哺乳动物饲料添加剂。
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