CN111349578B - 乳酸菌固体菌剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域,具体涉及乳酸菌固体菌剂的制备方法。该方法包括:将乳酸菌菌体与冷冻载体混合,并将得到的混合物进行冷冻干燥;所述冷冻载体选自可溶性淀粉、无水亚硫酸钠、珍珠盐和葡萄糖中的至少一种。本发明通过将发酵后得到的乳酸菌菌体与冷冻载体(可溶性淀粉、无水亚硫酸钠、珍珠盐和葡萄糖中的至少一种)混合后再进行冷冻干燥,由此制备得到的乳酸菌固体菌剂能够在4‑15℃的条件下长时间保存,且活菌数基本不下降或下降不明显。在使用本发明优选的乳酸菌发酵培养基进行乳酸菌菌种的制备时,还能够有效提高最终得到的乳酸菌的菌体密度,同时进一步抑制4‑15℃保存过程中乳酸菌的活菌数下降,延长保存周期。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,具体涉及乳酸菌固体菌剂的制备方法。
背景技术
随着发酵饲料行业的应用及需求,发酵饲料产量的提升势在必得,发酵菌种一般以乳酸菌为主。乳酸菌可以抑制肠道中腐败菌的生长,促进肠道中双歧杆菌的增殖,可改善肠道环境而有利于健康;并且乳酸菌在肠道中可以制造机体所需的维生素VK、VB6、VB12、RIBOFLAVIN、叶酸等,同时可以抑制破坏维生素B1酵素,使肠道内维生素B族保持稳定。乳酸菌在消化道中还可以与内源酶共同发挥作用,提高饲料消化率。此外,乳酸菌在动物肠道内生长繁殖,还能产生多种营养物质如维生素、氨基酸、有机酸、促生长因子等,参与动物机体的新陈代谢,为动物机体提供营养物质。
但乳酸菌的液态种子液制备工艺复杂、保存周期短;固体菌剂应用于发酵饲料领域比较便捷,保存周期长,活菌数质量稳定且便于运输和储藏。目前,现有技术主要是将乳酸菌菌体与玉米粉混合后进行冷冻干燥,得到固体菌剂,之后进行4-15℃保存。但在保存的过程中,乳酸菌活菌数下降比较明显,因为开发一种能够在长时间保存的情况下,乳酸菌活菌数基本不下降的方法势在必行。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题,提供一种乳酸菌固体菌剂的制备方法,该方法制备的固体菌剂能够在4-15℃的条件下可长时间保存,且活菌数下降不明显。
为了实现上述目的,本发明提供一种乳酸菌固体菌剂的制备方法,该方法包括:将乳酸菌菌体与冷冻载体混合,并将得到的混合物进行冷冻干燥;所述冷冻载体选自可溶性淀粉、无水亚硫酸钠、珍珠盐和葡萄糖中的至少一种。
优选地,所述乳酸菌菌体在乳酸菌培养基中进行培养获得,该乳酸菌培养基含有葡萄糖、酵母浸粉、碳酸钙、淀粉、硫酸镁、醋酸钠、柠檬酸铵、磷酸氢二钾、硫酸锰、吐温、玉米浆和糖蜜,其中,所述葡萄糖的含量为25-60g/L,所述酵母浸粉的含量为10-50g/L,所述硫酸镁的含量为0.1-0.3g/L,所述碳酸钙的含量为5-40g/L,所述淀粉的含量为5-50g/L,所述玉米浆的含量为1-10g/L,所述糖蜜的含量为1-10g/L。
优选的,所述乳酸菌培养基不含有牛肉粉和蛋白胨。
优选的,所述葡萄糖、酵母浸粉、硫酸镁、碳酸钙、淀粉、玉米浆和糖蜜的含量比为1:0.5-1:0.001-0.01:0.1-1:0.1-1:0.05-0.5:0.05-0.5。
本发明通过将发酵后得到的乳酸菌菌体与冷冻载体(可溶性淀粉、无水亚硫酸钠、珍珠盐和葡萄糖中的至少一种)混合后再进行冷冻干燥,由此制备得到的乳酸菌固体菌剂能够在4-15℃的条件下长时间保存,且活菌数基本不下降或下降不明显。在使用本发明优选的乳酸菌发酵培养基进行乳酸菌菌种的制备时,还能够有效提高最终得到的乳酸菌的菌体密度,同时进一步抑制4-15℃保存过程中乳酸菌的活菌数下降,延长保存周期。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明的发明人在研究的过程中发现,将发酵后得到的乳酸菌进行冷冻干燥之前,将其与选自可溶性淀粉、无水亚硫酸钠、珍珠盐和葡萄糖中的至少一种冷冻载体混合,由此制备得到的乳酸菌固体菌剂能够在4-15℃的条件下长时间保存,且活菌数基本不下降或下降不明显,由此完成了本发明。
基于如上的发现,本发明提供了一种乳酸菌固体菌剂的制备方法,该方法包括:将乳酸菌菌体与冷冻载体混合,并将得到的混合物进行冷冻干燥;所述冷冻载体选自可溶性淀粉、无水亚硫酸钠、珍珠盐和葡萄糖中的至少一种。
尽管只要将所述乳酸菌菌体与如上所述的冷冻载体混合后进行冷冻干燥即可实现本发明的目的,也即,乳酸菌固体菌剂的长时间保存,且活菌数基本不下降,但进一步优选的,相对于1重量份的乳酸菌菌体,所述冷冻载体的用量为1-10重量份,更优选为3-8重量份,在该优选的情况下,在保存过程中活菌数的下降能够得到进一步抑制,从而进一步延长保存周期。
根据本发明,所述乳酸菌菌体的获得可以参照本领域常规的方法,例如,将乳酸菌菌种接种至发酵培养基中进行发酵,并将发酵得到的发酵液进行固液分离,弃去上清后剩余的菌泥即可获得所述乳酸菌菌体。
根据本发明,所述冷冻干燥的方法可以参照本领域常规的方法,优选的,所述冷冻干燥的条件包括:温度为-60℃至-35℃,时间为30-120min。
根据本发明,为了进一步提高所述乳酸菌菌体的菌体密度和菌体量以及进一步延长所制备的乳酸菌固体菌剂的保存周期,所述发酵培养基含有葡萄糖、酵母浸粉、碳酸钙、淀粉、硫酸镁、醋酸钠、柠檬酸铵、磷酸氢二钾、硫酸锰、吐温、玉米浆和糖蜜,其中,所述葡萄糖的含量为25-60g/L,所述酵母浸粉的含量为10-50g/L,所述硫酸镁的含量为0.1-0.3g/L,所述碳酸钙的含量为5-40g/L,所述淀粉的含量为5-50g/L,所述玉米浆的含量为1-10g/L,所述糖蜜的含量为1-10g/L。
本发明乳酸菌培养基可以像现有技术一样含有牛肉粉和蛋白胨,但是对于本申请的乳酸菌培养基的配方来说,不添加牛肉粉和蛋白胨可以进一步促进菌体生长,实现高密度发酵。因此,根据本发明一种优选的实施方式,本发明的乳酸菌培养基不含有牛肉粉和蛋白胨。
根据本发明的乳酸菌培养基,本发明的发明人发现葡萄糖的含量应当相较于市售的乳酸菌培养基即MRS肉汤培养基中葡萄糖的含量提高,提高到25-60g/L的范围即可以有效地提高发酵效率,延长乳酸菌固体菌剂的保存时间。在优选的情况下,所述葡萄糖的含量为30-55g/L,更优选为35-50g/L。
根据本发明的乳酸菌培养基,本发明的发明人发现,当将酵母浸粉的含量大大提高到10-50g/L的范围内时(市售的MRS肉汤的酵母粉含量只有5g/L),配合本发明的培养基中其他的成分,非常有利于菌体富集,并且可以有效地实现高密度发酵并延长乳酸菌固体菌剂的保存时间。在优选的情况下,所述酵母浸粉的含量为20-40g/L,更优选为25-35g/L。
根据本发明的乳酸菌培养基,本发明的发明人意外地发现,向乳酸菌培养基中加入碳酸钙,并将碳酸钙的用量控制在5-40g/L时,并配合本发明的乳酸菌培养基中的其它成分,可以有效地提高发酵效率,实现高密度发酵并延长乳酸菌固体菌剂的保存时间。在优选的情况下,所述碳酸钙的含量为10-30g/L,更优选为15-25g/L。
根据本发明的乳酸菌培养基,本发明的发明人意外地发现,向乳酸菌培养基中加入淀粉,并将淀粉的用量控制在5-50g/L时,并配合本发明的乳酸菌培养基中的其它成分,可以有效地延长乳酸菌固体菌剂的保存时间,提高发酵效率。在优选的情况下,所述淀粉的含量为10-30g/L,更优选为15-25g/L。
根据本发明的乳酸菌培养基,本发明的发明人意外地发现,向乳酸菌培养基中加入玉米浆,并将玉米浆的用量控制在1-10g/L时,并配合本发明的乳酸菌培养基中的其它成分,可以有效地延长乳酸菌固体菌剂的保存时间,提高发酵效率。在优选的情况下,所述玉米浆的含量为3-7g/L,更优选为4-6g/L。
根据本发明的乳酸菌培养基,本发明的发明人意外地发现,向乳酸菌培养基中加入糖蜜,并将糖蜜的用量控制在1-10g/L时,并配合本发明的乳酸菌培养基中的其它成分,可以有效地延长乳酸菌固体菌剂的保存时间,提高发酵效率。在优选的情况下,所述糖蜜的含量为3-6g/L,更优选为4-5g/L。
根据本发明的乳酸菌培养基,本发明的发明人发现,将市售的MRS肉汤中硫酸镁的含量略微地提高,并配合本发明的乳酸菌培养基中的其它成分,可以有效地提高发酵效率并延长保存时间。优选的,所述硫酸镁的含量为0.15-0.25g/L,更优选为0.18-0.22g/L。
根据本发明的乳酸菌培养基,所述葡萄糖、酵母浸粉、硫酸镁、碳酸钙、淀粉、玉米浆和糖蜜的含量满足上述范围时便可以实现本发明的目的,在更为优选的情况下,还应当控制它们之间的配比,例如,所述葡萄糖、酵母浸粉、硫酸镁、碳酸钙、淀粉、玉米浆和糖蜜的含量比为1:0.5-1:0.001-0.01:0.1-1:0.1-1:0.05-0.5:0.05-0.5,优选为1:0.7-0.8:0.003-0.008:0.4-0.6:0.4-0.6:0.1-0.2:0.08-0.15。
根据本发明的乳酸菌培养基,醋酸钠、柠檬酸铵、磷酸氢二钾、硫酸锰和吐温80的含量可以按照本领域常规的乳酸菌培养基中的含量进行选择,例如可以参考市售MRS肉汤中醋酸钠、柠檬酸铵、磷酸氢二钾、硫酸锰和吐温80的含量。例如,在本发明的乳酸菌培养基中,所述醋酸钠的含量为3-7g/L,所述柠檬酸铵的含量为1-3g/L,所述磷酸氢二钾的含量为1-3g/L,所述硫酸锰的含量为0.03-0.07g/L,以及所述吐温为吐温80,所述吐温80的含量为0.5-1.5ml/L;优选地,所述醋酸钠的含量为4-6g/L,所述柠檬酸铵的含量为1.5-2.5g/L,所述磷酸氢二钾的含量为1.5-2.5g/L,所述硫酸锰的含量为0.04-0.06g/L,以及所述吐温80的含量为0.8-1.2ml/L。
乳酸菌发酵的具体方法和参数的控制都可以按照本领域常规的方式进行。在将乳酸菌接种至本发明提供的乳酸菌培养基进行扩培之前,还可以将乳酸菌菌种在常规的MRS培养基中进行摇瓶培养,其中,所述摇瓶培养培养的级数可以为1-3级,本领域技术人员可以根据实际情况进行具体的选择。
所述扩培可以在扩培罐中进行,在扩培罐中发酵的条件优选为:接种量为0.15-0.25体积%,温度为34-37.8℃,搅拌速度为80-120rpm,培养时间为12-14小时。
通过使用本发明的乳酸菌培养基,在乳酸菌发酵时,可以有效地促进菌体生长,实现高密度发酵,达到1012cfu/mL级别的菌落数;并且由此制备的乳酸菌固体菌剂在保存过程中活菌数下降能够得到进一步降低,延长保存时间。
根据本发明,所述乳酸菌优选为乳酸菌,更优选为植物乳酸菌。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中:
(1)种子液:使用来自于中粮营养健康学院菌种保藏中心的植物乳酸菌(编号为BC00171,以下记为乳酸菌BC)制备若干完全相同的冻存管备用;
(2)市售MRS肉汤:购自北京陆桥技术有限责任公司,牌号CM187。
(3)OD值使用分光光度计(上海精密科学仪器有限公司,牌号070708040154)进行测量。
实施例1-9和对比例1-2
(1)按照表1所示的配方配制乳酸菌培养基放入扩培罐中,并调节pH值至6.0-6.4。
(2)将预先制备的冻存管(为了保证结果的准确性而设置的平行实验)提前0.5h自然解冻,然后分别依次接入一级摇瓶、二级摇瓶和扩培罐,按照以下的条件进行发酵:
一级摇瓶:培养基为市售MRS肉汤,成分如表1所示;接种量为0.2体积%,在34±2℃下静置培养,待OD值长至6-7,pH为4.0,结束一级摇瓶培养;
二级摇瓶:培养基为市售MRS肉汤,成分如表1所示;接种一级摇瓶的培养产物,接种量为0.2体积%,在35±2℃下50rpm培养,待OD值长至16-18,pH为5.0,结束二级摇瓶培养;
扩培罐:培养基为如表1所示配方的乳酸菌培养基;接种二级摇瓶的培养产物,接种量为0.2体积%,在35±2℃下,以100rpm的速度培养,待OD值长至16-18,pH为5.0,结束扩培罐培养;培养基的体积占扩培罐容量的80%,所用扩培罐的容量为5m3,测定扩培液的活菌数,结果见表2。
(3)将步骤(2)扩培后的发酵液进行固液分离,得到菌泥,向得到的菌泥中加入表1中对应的冷冻载体,然后在-40℃进行冷冻干燥,得到植物乳杆菌固体菌剂,真空无菌包装后置于15℃的条件下进行保存,并在1个月、3个月、6个月和12月检测植物乳杆菌固体的活菌数,结果见表2。
表1
注:20/40是指一级摇瓶的葡萄糖浓度为20g/L,二级摇瓶的葡萄糖浓度为40g/L。
表2
通过表2的结果可以看出,相较于对比例,采用本发明的方法制备得到的乳酸菌固体制剂在15℃的条件下能够长时间保存,并且在使用优选的培养基培养菌体时,保存时间更长,且经过12个月保存后,固体制剂的活菌数基本不下降。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合,这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容,均属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种乳酸菌固体菌剂的制备方法在延长菌剂保存时间中的应用,其特征在于,该方法包括:将乳酸菌菌体与冷冻载体混合,并将得到的混合物进行冷冻干燥;所述冷冻载体选自可溶性淀粉、无水亚硫酸钠和珍珠盐中的一种;
其中,所述乳酸菌为植物乳酸菌,所述乳酸菌菌体为将在乳酸菌培养基中进行培养获得的乳酸菌发酵液进行固液分离后获得的菌泥,该乳酸菌培养基含有葡萄糖、酵母浸粉、碳酸钙、淀粉、硫酸镁、醋酸钠、柠檬酸铵、磷酸氢二钾、硫酸锰、吐温、玉米浆和糖蜜,所述乳酸菌培养基不含有牛肉粉和蛋白胨,其中,所述葡萄糖的含量为35-50g/L,所述酵母浸粉的含量为25-35g/L,所述碳酸钙的含量为15-25g/L,所述淀粉的含量为15-25g/L,所述硫酸镁的含量为0.18-0.22g/L,所述玉米浆的含量为4-6g/L,所述糖蜜的含量为4-5g/L,所述醋酸钠的含量为3-7g/L,所述柠檬酸铵的含量为1-3g/L,所述磷酸氢二钾的含量为1-3g/L,所述硫酸锰的含量为0.03-0.07g/L,以及所述吐温为吐温80,所述吐温80的含量为0.5-1.5ml/L;
相对于1重量份的乳酸菌菌体,所述冷冻载体的用量为3-5重量份。
2.根据权利要求1所述的制备应用,其中,所述冷冻干燥的条件包括:温度为-60℃至-35℃,时间为30-120min。
3.根据权利要求1所述的制备应用,其中,所述葡萄糖、酵母浸粉、硫酸镁、碳酸钙、淀粉、玉米浆和糖蜜的含量比为1∶0.5-1∶0.001-0.01∶0.1-1∶0.1-1∶0.05-0.5∶0.05-0.5。
4.根据权利要求3所述的制备应用,其中,所述葡萄糖、酵母浸粉、硫酸镁、碳酸钙、淀粉、玉米浆和糖蜜的含量比为1∶0.7-0.8∶0.003-0.008∶0.4-0.6∶0.4-0.6∶0.1-0.2∶0.08-0.15。
5.根据权利要求1所述的制备应用,其中,所述醋酸钠的含量为4-6g/L,所述柠檬酸铵的含量为1.5-2.5g/L,所述磷酸氢二钾的含量为1.5-2.5g/L,所述硫酸锰的含量为0.04-0.06g/L,以及所述吐温80的含量为0.8-1.2ml/L。
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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CB02 | Change of applicant information | ||
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Address after: No. 99, Kaiyuan Avenue, Bengbu, Anhui 233010 Applicant after: COFCO Biotechnology Co.,Ltd. Address before: No. 1, central grain Avenue, Bengbu, Anhui Province, Anhui Applicant before: COFCO BIOCHEMICAL (ANHUI) Co.,Ltd. |
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GR01 | Patent grant | ||
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