CN104726526A - 一种利用鱼皮制备用于治疗伤口愈合的活性肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用鱼皮制备用于治疗伤口愈合的活性肽的方法，包括以下主要步骤：将新鲜的鱼皮剪成碎片；剪碎后的鱼皮加入到发酵罐中，并添加营养物和水作为培养基；发酵罐中培养基灭菌冷却后接入能产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌HL-1进行液态好氧发酵；发酵结束后发酵液先进行灭酶，接着通过离心分离去除沉淀得到上清液，上清液再先后进行膜分离、真空浓缩和喷雾干燥后制备成用于治疗伤口愈合的活性肽成品。本发明方法制备的用于治疗伤口愈合的活性肽富含促进伤口愈合肽与抗菌脂肽，不但可以促进伤口愈合，而且还可以有效预防伤口的感染。本发明方法制备的活性肽产品既可以喷剂或凝胶剂型直接给药用于治疗伤口愈合，也可以口服的形式治疗伤口愈合，有着良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用鱼皮制备用于治疗伤口愈合的活性肽的方法，属于水产品加工与利用领域。
背景技术
胶原蛋白肽具有保护胃粘膜、抗溃疡、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、抗衰老、降血压、降胆固醇、增强骨强度、预防骨质疏松、预防关节炎、促进伤口愈合、促进角膜上皮细胞的修复和生长、促进皮肤胶原代谢、免疫调节等多种生理功能。近年来，胶原蛋白肽用于促进伤口愈合得到了人们的关注。专利CN201410274645.4“一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法”公开了一种鲈鱼皮胶原蛋白肽可以用于促进伤口愈合。专利CN 200910114805.8“一种小分子肽在制备促进手术后伤口愈合药物和食品中的应用”公开了胶原蛋白肽可以用于促进伤口愈合药物和食品中的应用。专利CN200910210712“海洋胶原肽在制备糖尿病伤口愈合药物、食品中的用途”公开了可以将海洋胶原蛋白肽应用于制备促进糖尿病伤口愈合的药物和食品。
目前已经公开胶原蛋白肽的制备方法有酶解法和发酵法。专利CN201410274645.4“一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法”公开了一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法。它是以鲈鱼皮为原料，经加酸预处理，然后加蛋白酶酶解；酶解产物经膜分离、旋转蒸发浓缩和冷冻干燥后得到了具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽。专利CN201110066530 “一种利用鱼皮制备胶原蛋白肽的方法”公开了一种发酵方法制备胶原蛋白肽，它是以鱼皮为原料，通过接入枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或地衣芽孢杆菌进行发酵，发酵液经过滤去除菌体，再进行灭酶、真空浓缩、喷雾干燥得到胶原蛋白肽。然而目前已经公开的制备胶原蛋白肽方法制备的胶原蛋白肽缺乏抗菌肽不能有效的预防伤口感染。
发明内容
针对目前公开技术制备的用于治疗伤口愈合的胶原蛋白肽多富含促进伤口愈合肽，而缺乏抗菌肽，不能有效防止伤口感染。本发明的目的是制备一种富含抗菌肽和促进伤口愈合肽的活性肽产品，以用于治疗伤口愈合。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种利用鱼皮制备用于治疗伤口愈合的活性肽的方法，包括如下步骤：
（1）将斜面保藏的能产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 ℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液备用；
（2）将新鲜的鱼皮剪成（0.5～1.5）cm×（0.5～1.5）cm的碎片备用；
（3）将步骤（2）制备的剪碎鱼皮加入到发酵罐中，并向发酵罐中加入水和营养物，混匀后得到发酵培养基；
（4）将步骤（3）获得的发酵罐中的培养基于115℃灭菌20min；
（5）将灭菌后的发酵罐中的培养基冷却至室温，然后接入步骤（1）所制备的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液；
（6）发酵过程的控制：发酵温度为30℃～32℃，无菌空气通入量为0.5vvm～2.5vvm，发酵罐的转速为150rpm～450rpm，发酵时间为35 h～45h；
（7）成品处理：发酵结束后，发酵液升温至90℃保温灭酶5min；灭酶后的发酵液冷却至室温后，于8000r/min离心10min，去掉沉淀，收集上清液；通过膜分离截留上清液中分子量在3500Da以下的活性肽组分；膜分离截留液再进行真空浓缩和喷雾干燥后，即可得到用于治疗伤口愈合的活性肽成品。
所述步骤（1）中接入的枯草芽胞杆菌HL-1能产生抗菌脂肽，该菌已于2015年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No．10379，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所述步骤（2）中的鱼皮为鲈鱼鱼皮、青鳞鱼鱼皮、鳄鱼鱼皮、狭鳕鱼鱼皮、鲟鱼鱼皮、马加鱼鱼皮、鳗鱼鱼皮、大黄鱼鱼皮、带鱼鱼皮、鲑鱼鱼皮、罗非鱼鱼皮、鲣鱼鱼皮、小黄鱼鱼皮、加力鱼鱼皮、石斑鱼鱼皮和鱿鱼鱼皮中的一种。所述步骤（3）中鱼皮的加入量以添加的鱼皮的质量占水总质量百分比计，为5%～10%。
所述步骤（3）中营养物为葡萄糖、医药级氯化钾、医药级氯化镁和医药级磷酸氢二钾所组成的混合物。所述步骤（3）中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占水总质量百分比计，分别为：葡萄糖0.01%～5%，医药级氯化钾0.01%～5%，医药级氯化镁0.01%～5%，医药级磷酸氢二钾0.01%～5%。
所述步骤（5）中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液的接种量以接入种子液的质量占发酵培养基总质量百分比计，为0.1%～5%。
本发明跟现有的技术相比，本发明采用能产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）进行目的性发酵，在得到促伤口愈合肽的同时还得到了抗菌脂肽。本发明制备的用于治疗伤口愈合的活性肽不但可以促进伤口的愈合，而且还能有效防止感染。另外，本发明制备的活性肽产品由于富含抗菌肽，其在保藏期间不容易被微生物所污染，有利于产品的保藏。
一种利用鱼皮制备用于治疗伤口愈合的活性肽的方法。本发明得到的活性肽产品既可以喷剂或凝胶剂型直接给药用于治疗伤口愈合，也可以口服的形式治疗伤口愈合。本发明方法制备的活性肽产品不但可以促进伤口的愈合，而且还能有效防止伤口的感染，有良好的应用前景。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面就原料的选择、发酵参数的选择结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1：将斜面保藏的能产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 ℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液备用；将新鲜的鲈鱼鱼皮剪成（0.5～1.5）cm×（0.5～1.5）cm的碎片备用。向发酵罐中加入5公斤剪碎的鲈鱼鱼皮、100公斤水、1000克葡萄糖、500g医药级氯化钾、300克医药级氯化镁和500克医药级磷酸氢二钾，混匀并作为培养基；发酵罐中培养基于115℃灭菌20min后备用；向灭菌冷却的发酵罐中接入2公斤枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液；发酵温度为32℃，无菌空气通入量为2.0vvm，发酵罐的转速为400rpm，发酵时间为35h；发酵结束后，发酵液升温至90℃进行保温灭酶5min；灭酶后的发酵液冷却后，于8000r/min离心10min，去掉沉淀，收集上清液；上清液通过膜分离截留上清液中分子量在3500Da以下的活性肽组分；将膜分离截留液再进行真空浓缩和喷雾干燥后，即制得了一种利用鱼皮制备的用于治疗伤口愈合的活性肽成品。本发明所制的活性肽成品既可以喷剂或凝胶剂型直接给药用于治疗伤口愈合，也可以口服的形式治疗伤口愈合。
实施例2：将斜面保藏的能产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 ℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液备用；将新鲜的鳄鱼鱼皮剪成（0.5～1.5）cm×（0.5～1.5）cm的碎片备用。向发酵罐中加入10公斤剪碎的鳄鱼鱼皮、100公斤水、1500克葡萄糖、600g医药级氯化钾、400克医药级氯化镁和500克医药级磷酸氢二钾，混匀并作为培养基；发酵罐中培养基于115℃灭菌20min；向灭菌冷却的发酵罐中接入2公斤枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液；发酵温度为30℃，无菌空气通入量为1.5vvm，发酵罐的转速为350rpm，发酵时间为45h；发酵结束后，发酵液升温至90℃进行保温灭酶5min；灭酶后的发酵液冷却后，于8000r/min离心10min，去掉沉淀，收集上清液；上清液通过膜分离截留上清液中分子量在3500Da以下的活性肽组分；将膜分离截留液再进行真空浓缩和喷雾干燥后，即制得了一种利用鱼皮制备的用于治疗伤口愈合的活性肽成品。本发明所制的活性肽成品既可以喷剂或凝胶剂型直接给药用于治疗伤口愈合，也可以口服的形式治疗伤口愈合。
实施例3：将斜面保藏的能产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 ℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液备用；将新鲜的鲣鱼鱼皮剪成（0.5～1.5）cm×（0.5～1.5）cm的碎片备用。向发酵罐中加入8公斤剪碎的鲣鱼鱼皮、100公斤水、1200克葡萄糖、550g医药级氯化钾、350克医药级氯化镁和500克医药级磷酸氢二钾，混匀作为培养基；发酵罐中培养基于115℃灭菌20min；向灭菌冷却的发酵罐中接入2公斤枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液；发酵温度控制在31℃，无菌空气通入量为1.8vvm，发酵罐的转速为280rpm，发酵时间为40h；发酵结束后，发酵液升温至90℃进行保温灭酶5min；灭酶后的发酵液冷却后，于8000r/min离心10min，去掉沉淀，收集上清液；上清液通过膜分离截留上清液中分子量在3500Da以下的活性肽组分；将膜分离截留液再进行真空浓缩和喷雾干燥后，即制得了一种利用鱼皮制备的用于治疗伤口愈合的活性肽成品。本发明所制的活性肽成品既可以喷剂或凝胶剂型直接给药用于治疗伤口愈合，也可以口服的形式治疗伤口愈合。
Claims (7)
1.一种利用鱼皮制备用于治疗伤口愈合的活性肽的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
（1）将斜面保藏的能产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 ℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌HL-1种子液备用；
（2）将新鲜的鱼皮剪成（0.5～1.5）cm×（0.5～1.5）cm的碎片备用；
（3）将步骤（2）制备的剪碎鱼皮加入到发酵罐中，并向发酵罐中加入水和营养物，混匀后得到发酵培养基；
（4）将步骤（3）获得的发酵罐中的培养基于115℃灭菌20min；
（5）将灭菌后的发酵罐中的培养基冷却至室温，然后接入步骤（1）所制备的枯草芽孢杆菌HL-1种子液；
（6）发酵过程的控制：发酵温度为30℃～32℃，无菌空气通入量为0.5vvm～2.5vvm，发酵罐的转速为150rpm～450rpm，发酵时间为35～45h；
（7）成品处理：发酵结束后，发酵液升温至90℃保温灭酶5min；灭酶后的发酵液冷却至室温后，于8000r/min离心10min，去掉沉淀，收集上清液；通过膜分离截留上清液中分子量在3500Da以下的活性肽组分；膜分离截留液再进行真空浓缩和喷雾干燥后，即可得到用于治疗伤口愈合的活性肽成品。
2.根据权利要求1所述的一种利用鱼皮制备用于治疗伤口愈合的活性肽的方法，其特征在于：所述步骤（1）中所用的枯草芽孢杆菌HL-1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No．10379。
3.根据权利要求1所述的一种利用鱼皮制备用于治疗伤口愈合的活性肽的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的鱼皮为鲈鱼鱼皮、青鳞鱼鱼皮、鳄鱼鱼皮、狭鳕鱼鱼皮、鲟鱼鱼皮、马加鱼鱼皮、鳗鱼鱼皮、大黄鱼鱼皮、带鱼鱼皮、鲑鱼鱼皮、罗非鱼鱼皮、鲣鱼鱼皮、小黄鱼鱼皮、加力鱼鱼皮、石斑鱼鱼皮和鱿鱼鱼皮中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种利用鱼皮制备用于治疗伤口愈合的活性肽的方法，其特征在于：所述步骤（3）中鱼皮的加入量以添加的鱼皮的质量占水总质量百分比计，为5%～10%。
5.根据权利要求1所述的一种利用鱼皮制备用于治疗伤口愈合的活性肽的方法，其特征在于：所述步骤（3）中营养物为葡萄糖、医药级氯化钾、医药级氯化镁和医药级磷酸氢二钾所组成的混合物。
6.根据权利要求1所述的一种利用鱼皮制备用于治疗伤口愈合的活性肽的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占水总质量百分比计，分别为：葡萄糖0.01%～5%，医药级氯化钾0.01%～5%，医药级氯化镁0.01%～5%，医药级磷酸氢二钾0.01%～5%。
7.根据权利要求1所述的一种利用鱼皮制备用于治疗伤口愈合的活性肽的方法，其特征在于：所述步骤（5）中枯草芽孢杆菌HL-1种子液的接种量以接入种子液的质量占发酵培养基总质量百分比计，为0.1%～5%。
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