CN111840204A - 一种含有植物精华的抗衰老冻干粉及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有植物精华的抗衰老冻干粉及其制备方法，以牛大力根、桑叶和洋槐花等植物源原料为主，辅以少量牡蛎提取物和海藻糖，制成一种冻干粉产品，其富含植物精华，具有优异的抗衰老效果，不良反应少。本发明将牛大力根、桑叶和洋槐花作为植物源原料，培养获得相应的植物源细胞培养物，其中含有的细胞具有极强的自我更新能力，促进细胞分化，改善微循环，加速细胞新陈代谢，从而起到抗衰老的作用。本发明将获得的牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物与人表皮干细胞混合培养，使得所得混合细胞培养物与人体皮肤具有良好的亲和性，更容易被吸收，增强植物源成分抗衰老效果，同时减少不良反应的发生。

Description

一种含有植物精华的抗衰老冻干粉及其制备方法
技术领域
本发明属于美容护肤技术领域，涉及一种含有植物精华的抗衰老冻干粉及其制备方法。
背景技术
随着人们生活水平的提高和生活节奏的加快，人们长时间熬夜并经常性使用电脑、手机等，紫外线辐射、电磁辐射以及化学性刺激等使得人们的脸部皮肤受到不同程度的伤害，加速脸部皮肤老化，出现皮肤干燥、色斑、暗疮、皱纹、皮肤敏感等问题。由于人们对生活品质的需求也较以往有很大提高，故对美容需求也越来越高。
皮肤衰老就是人们面临的常见皮肤问题之一，皮肤衰老的表现包括：皱纹、松弛、不规则性色素沉着、血管扩张、表皮角化不良、出现异常增殖、真皮弹性纤维变性以及降解产物蓄积等。皮肤衰老与细胞衰老密切相关，尤其与成纤维细胞和角质形成细胞的衰老紧密联系。成纤维细胞在衰老的过程中胶原的分泌减少，同时细胞胶原酶的诱导能力上调，引起胶原蛋白分解增强，从而促使皮肤弹性下降，皱纹出现。此外，角质形成细胞在皮肤保水、保湿、屏障以及皮肤并形成等多方面具有非常重要的调节作用。角质形成细胞衰老的过程中与皮肤修复相关的基因表达迟缓，而损伤有关基因表达增加，从而促使皮肤老化。
冻干粉是一种常见的护肤美容产品，是将需要干燥的物料溶液预先冻结成固体，然后在低温低压条件下，从冻结状态不经过液态而直接升华去除水分。冻干粉很好地保证了原来美容成分的高活性，达到超高的稳定性，与溶酶混合，又快速恢复，方便使用。高活性，保证了产品的营养成分，能够更好地被细胞吸收，从而缩短改善肌肤周期。冻干粉的成分是具有高活性的生物成分，通过冷冻技术实现粉末化，很好地保证了原来美容成分的高活性，达到超高的稳定性，与溶酶混合，又快速恢复，方便使用。高活性，保证了产品的营养成分，能够更好地被细胞吸收，从而缩短改善肌肤周期。
市场上现有的用于抗衰老的冻干粉产品抗皱效果品质欠佳，不乏空有噱头的劣质产品，另外，近年来流行的异源性添加物(如干细胞等)，导致了很多不良事件的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种含有植物精华的抗衰老冻干粉及其制备方法，抗衰老效果好，不良反应少。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种含有植物精华的抗衰老冻干粉的制备方法，以重量份计，具体步骤如下：
(1)先将1份新鲜牡蛎肉加水捣碎制成肉酱，利用蛋白酶进行酶解处理，灭酶，得到酶解产物，接着利用乳酸菌发酵得到发酵产物，冷冻干燥，超微粉碎至10μm以下，得到牡蛎提取物，备用；
(2)然后以1.2～1.8份新鲜牛大力根、3～5份新鲜桑叶、8～10份新鲜洋槐花为植物源原料分别培养获得相应的植物源细胞培养物，即牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物；
(3)再将牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物与人表皮干细胞混合培养，得到混合细胞培养物；
(4)最后将牡蛎提取物分散于5～8倍重量的质量浓度10～15％海藻糖水溶液中，边搅拌边加入步骤(3)中所得混合细胞培养物，均质处理，冷冻干燥，包装，即得所述的一种含有植物精华的抗衰老冻干粉。
优选的，步骤(1)中，肉酱的制备方法为：先将牡蛎肉切碎后加入3～5倍重量的水中，再利用组织捣碎机以14000～16000转/分钟捣碎15～20分钟，即得肉酱。
优选的，步骤(1)中，蛋白酶的用量为肉酱重量的5～8％，以重量份计，所述蛋白酶包含：菠萝酶1份，中性蛋白酶0.5～0.8份，木瓜蛋白酶0.08～0.1份。
优选的，步骤(1)中，酶解处理的工艺条件为：pH＝5.5～6，52～55℃酶解8～10小时。
优选的，步骤(1)中，以重量份计，乳酸菌发酵的具体方法为：将100份酶解产物加入发酵罐中，调整发酵罐中水分质量含量为38～42％，接入0.5～0.8份植物乳杆菌ATCC8014(购自上海艾研生物科技有限公司)和0.03～0.05份干酪乳杆菌ATCC393(购自上海复祥生物科技公司)，33～35℃厌氧发酵30～35小时，巴氏灭菌，即得发酵产物。
优选的，步骤(1)中，冷冻干燥的工艺条件为：先于-20～-25℃冷冻8～10小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至30～35℃，保温4～5小时。
优选的，步骤(2)中，植物源细胞培养物的制备方法为：先将植物源原料进行清洗和杀菌消毒，并切成1mm×1mm的小丁，单层摆在含有纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的培养基表面，培养，离心取沉淀，无菌过滤，得到植物源细胞培养物。
进一步优选的，杀菌消毒包括：体积浓度75％酒精冲洗3～5次，质量浓度15～20％次氯酸钠溶液浸泡10～15分钟，质量浓度0.1％升汞溶液冲洗2～3次，无菌去离子水清洗3～5次。
进一步优选的，所述培养基为水溶液，以重量浓度计，包含：硝酸铵100～110mg/L，硝酸钾1000～1110mg/L，氯化钙120～130mg/L，肌醇1～2mg/L，L-精氨酸100～110mg/L，α-萘乙酸2～2.5mg/L，蔗糖13～14mg/L，琼脂3～3.3mg/L；纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的在培养基中的重量含量分别为0.01～0.02％、0.005～0.008％、0.008～0.01％，培养条件为：培养温度25～29℃，pH＝6～6.5，培养时间8～10小时。
优选的，步骤(3)的具体方法如下：先将步骤(2)所得牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物、洋槐花细胞培养物均匀分散于培养基中，接着接入人表皮干细胞(购自上海钦诚生物科技有限公司)，培养，离心取上清，无菌过滤，即得所述的混合细胞培养物。
进一步优选的，培养基的用量为牛大力细胞培养物重量的30～40倍，所述培养基为水溶液，以重量浓度计，包含：硫酸镁150～160mg/L，硝酸钾800～850mg/L，氯化钙80～90mg/L，肌醇3～5mg/L，L-精氨酸130～140mg/L，α-萘乙酸3～5mg/L，蔗糖50～55mg/L，麦饭石颗粒100～120mg/L；培养条件为：培养温度25～29℃，pH＝5～5.5，通入速率0.03～0.05m3/s的过滤空气，200～300r/min条件下培养15～20天。
进一步优选的，人表皮干细胞的用量为牛大力细胞培养物重量的0.08～0.1％。
优选的，步骤(4)中，均质处理的工艺条件为：先在60～80MPa条件下高压均质4～6个循环，然后在冰浴和1500～2000r/min条件下搅拌5～10分钟。
优选的，步骤(4)中，冷冻干燥的工艺条件为：先于-20～-25℃冷冻8～10小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至30～35℃，保温8～10小时。
2、利用上述制备方法得到的一种含有植物精华的抗衰老冻干粉。
本发明的有益效果在于：
本发明以牛大力根、桑叶和洋槐花等植物源原料为主，辅以少量牡蛎提取物和海藻糖，制成一种冻干粉产品，其富含植物精华，具有优异的抗衰老效果，不良反应少。具体分析如下：
1、牛大力根可以降低微血管的通透性，起到保护作用，阻止皮肤细胞中水分逸出，同时也阻止外界环境不洁物进入，从根源上改善皮肤受环境影响导致衰老的问题。但是牛大力根中含有的生物碱具有一定刺激性，故牛大力根的用量不可过多。桑叶中含有槲皮素、酚类化合物等，可提高皮肤超氧化物歧化酶的活性，桑叶中还含有氨基酸等，有利于改善和调节皮肤组织的新陈代谢，起到抗衰老作用。洋槐花中含有芦丁、皂苷等，具有清除自由基、抗氧化的作用。这三种原料相辅相成，缺一不可。
本发明将牛大力根、桑叶和洋槐花作为植物源原料，培养获得相应的植物源细胞培养物，其中含有的细胞具有极强的自我更新能力，促进细胞分化，改善微循环，加速细胞新陈代谢，从而起到抗衰老的作用。但是植物源细胞的引入与人体皮肤细胞存物种差异，可能无效或者引发不良反应，故本发明将获得的牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物与人表皮干细胞混合培养，在混合培养过程中，相当于在植物源细胞表面修饰了人表皮干细胞，使得所得混合细胞培养物与人体皮肤具有良好的亲和性，更容易被吸收，增强植物源成分抗衰老效果，同时减少不良反应的发生。
2、本发明以新鲜牡蛎为原料，经酶解、乳酸菌发酵制成了牡蛎提取物，在酶解过程中，大分子蛋白质降解为小分子氨基酸，对皮肤具有营养作用，乳酸菌发酵产乳酸使得产物呈弱酸性，接近皮肤pH值，乳酸为天然保湿因子，可有效去除细纹和皱纹，对皮肤具有更好的抗衰老作用。另外，牡蛎中还含有有机硒和无机硒，硒是谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成部分，从而提高自由基捕获能力，提高抗衰老性能，但是无机硒是具有明确毒性的，本发明以牛大力根、桑叶、洋槐花中含有的蛋白质螯合这部分无机硒，转化为有机硒，不但避免了毒性，还进一步提高了抗衰老性能。
另外，牡蛎中还含有油脂成分，油脂成分的保留促进部分油包水状态的形成，促进皮肤对营养成分的吸收，增强抗衰老效果。
3、海藻糖是一种天然糖类，具有防止油脂分解、蛋白质变性等作用，还具有保湿性，对抗氧化性成分具有稳定作用，进一步改善了产品的抗衰老性能。
具体实施方式
下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1：
一种含有植物精华的抗衰老冻干粉的制备方法，具体步骤如下：
(1)先将1kg新鲜牡蛎肉加水捣碎制成肉酱，利用蛋白酶进行酶解处理，灭酶，得到酶解产物，接着利用乳酸菌发酵得到发酵产物，冷冻干燥，超微粉碎至10μm以下，得到牡蛎提取物，备用；
(2)然后以1.2kg新鲜牛大力根、5kg新鲜桑叶、8kg新鲜洋槐花为植物源原料分别培养获得相应的植物源细胞培养物，即牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物；
(3)再将牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物与人表皮干细胞混合培养，得到混合细胞培养物；
(4)最后将牡蛎提取物分散于8倍重量的质量浓度10％海藻糖水溶液中，边搅拌边加入步骤(3)中所得混合细胞培养物，均质处理，冷冻干燥，包装，即得所述的一种含有植物精华的抗衰老冻干粉。
步骤(1)中，肉酱的制备方法为：先将牡蛎肉切碎后加入5倍重量的水中，再利用组织捣碎机以14000转/分钟捣碎20分钟，即得肉酱。
步骤(1)中，蛋白酶的用量为肉酱重量的5％，以重量份计，所述蛋白酶包含：菠萝酶1份，中性蛋白酶0.8份，木瓜蛋白酶0.08份。
步骤(1)中，酶解处理的工艺条件为：pH＝6，52℃酶解10小时。
步骤(1)中，乳酸菌发酵的具体方法为：将100g酶解产物加入发酵罐中，调整发酵罐中水分质量含量为38％，接入0.8g植物乳杆菌ATCC8014(购自上海艾研生物科技有限公司)和0.03g干酪乳杆菌ATCC393(购自上海复祥生物科技公司)，35℃厌氧发酵30小时，巴氏灭菌，即得发酵产物。
步骤(1)中，冷冻干燥的工艺条件为：先于-25℃冷冻8小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至35℃，保温4小时。
步骤(2)中，植物源细胞培养物的制备方法为：先将植物源原料进行清洗和杀菌消毒，并切成1mm×1mm的小丁，单层摆在含有纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的培养基表面，培养，离心取沉淀，无菌过滤，得到植物源细胞培养物。
杀菌消毒包括：体积浓度75％酒精冲洗5次，质量浓度15％次氯酸钠溶液浸泡15分钟，质量浓度0.1％升汞溶液冲洗2次，无菌去离子水清洗5次。
所述培养基为水溶液，以重量浓度计，包含：硝酸铵100mg/L，硝酸钾1110mg/L，氯化钙120mg/L，肌醇2mg/L，L-精氨酸100mg/L，α-萘乙酸2.5mg/L，蔗糖13mg/L，琼脂3.3mg/L；纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的在培养基中的重量含量分别为0.01％、0.008％、0.008％，培养条件为：培养温度29℃，pH＝6，培养时间10小时。
步骤(3)的具体方法如下：先将步骤(2)所得牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物、洋槐花细胞培养物均匀分散于培养基中，接着接入人表皮干细胞(购自上海钦诚生物科技有限公司)，培养，离心取上清，无菌过滤，即得所述的混合细胞培养物。
培养基的用量为牛大力细胞培养物重量的30倍，所述培养基为水溶液，以重量浓度计，包含：硫酸镁160mg/L，硝酸钾800mg/L，氯化钙90mg/L，肌醇3mg/L，L-精氨酸140mg/L，α-萘乙酸3mg/L，蔗糖55mg/L，麦饭石颗粒100mg/L；培养条件为：培养温度29℃，pH＝5，通入速率0.05m3/s的过滤空气，200r/min条件下培养20天。
人表皮干细胞的用量为牛大力细胞培养物重量的0.08％。
步骤(4)中，均质处理的工艺条件为：先在80MPa条件下高压均质4个循环，然后在冰浴和2000r/min条件下搅拌5分钟。
步骤(4)中，冷冻干燥的工艺条件为：先于-25℃冷冻8小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至35℃，保温8小时。
实施例2：
一种含有植物精华的抗衰老冻干粉的制备方法，具体步骤如下：
(1)先将1kg新鲜牡蛎肉加水捣碎制成肉酱，利用蛋白酶进行酶解处理，灭酶，得到酶解产物，接着利用乳酸菌发酵得到发酵产物，冷冻干燥，超微粉碎至10μm以下，得到牡蛎提取物，备用；
(2)然后以1.8kg新鲜牛大力根、3kg新鲜桑叶、10kg新鲜洋槐花为植物源原料分别培养获得相应的植物源细胞培养物，即牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物；
(3)再将牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物与人表皮干细胞混合培养，得到混合细胞培养物；
(4)最后将牡蛎提取物分散于5倍重量的质量浓度15％海藻糖水溶液中，边搅拌边加入步骤(3)中所得混合细胞培养物，均质处理，冷冻干燥，包装，即得所述的一种含有植物精华的抗衰老冻干粉。
步骤(1)中，肉酱的制备方法为：先将牡蛎肉切碎后加入3倍重量的水中，再利用组织捣碎机以16000转/分钟捣碎15分钟，即得肉酱。
步骤(1)中，蛋白酶的用量为肉酱重量的8％，以重量份计，所述蛋白酶包含：菠萝酶1份，中性蛋白酶0.5份，木瓜蛋白酶0.1份。
步骤(1)中，酶解处理的工艺条件为：pH＝5.5，55℃酶解8小时。
步骤(1)中，乳酸菌发酵的具体方法为：将100g酶解产物加入发酵罐中，调整发酵罐中水分质量含量为42％，接入0.5g植物乳杆菌ATCC8014(购自上海艾研生物科技有限公司)和0.05g干酪乳杆菌ATCC393(购自上海复祥生物科技公司)，33℃厌氧发酵35小时，巴氏灭菌，即得发酵产物。
步骤(1)中，冷冻干燥的工艺条件为：先于-20℃冷冻10小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至30℃，保温5小时。
步骤(2)中，植物源细胞培养物的制备方法为：先将植物源原料进行清洗和杀菌消毒，并切成1mm×1mm的小丁，单层摆在含有纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的培养基表面，培养，离心取沉淀，无菌过滤，得到植物源细胞培养物。
杀菌消毒包括：体积浓度75％酒精冲洗3次，质量浓度20％次氯酸钠溶液浸泡10分钟，质量浓度0.1％升汞溶液冲洗3次，无菌去离子水清洗3次。
所述培养基为水溶液，以重量浓度计，包含：硝酸铵110mg/L，硝酸钾1000mg/L，氯化钙130mg/L，肌醇1mg/L，L-精氨酸110mg/L，α-萘乙酸2mg/L，蔗糖14mg/L，琼脂3mg/L；纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的在培养基中的重量含量分别为0.02％、0.005％、0.01％，培养条件为：培养温度25℃，pH＝6.5，培养时间8小时。
步骤(3)的具体方法如下：先将步骤(2)所得牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物、洋槐花细胞培养物均匀分散于培养基中，接着接入人表皮干细胞(购自上海钦诚生物科技有限公司)，培养，离心取上清，无菌过滤，即得所述的混合细胞培养物。
培养基的用量为牛大力细胞培养物重量的40倍，所述培养基为水溶液，以重量浓度计，包含：硫酸镁150mg/L，硝酸钾850mg/L，氯化钙80mg/L，肌醇5mg/L，L-精氨酸130mg/L，α-萘乙酸5mg/L，蔗糖50mg/L，麦饭石颗粒120mg/L；培养条件为：培养温度25℃，pH＝5.5，通入速率0.03m3/s的过滤空气，300r/min条件下培养15天。
人表皮干细胞的用量为牛大力细胞培养物重量的0.1％。
步骤(4)中，均质处理的工艺条件为：先在60MPa条件下高压均质6个循环，然后在冰浴和1500r/min条件下搅拌10分钟。
步骤(4)中，冷冻干燥的工艺条件为：先于-20℃冷冻10小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至30℃，保温10小时。
实施例3：
一种含有植物精华的抗衰老冻干粉的制备方法，具体步骤如下：
(1)先将1kg新鲜牡蛎肉加水捣碎制成肉酱，利用蛋白酶进行酶解处理，灭酶，得到酶解产物，接着利用乳酸菌发酵得到发酵产物，冷冻干燥，超微粉碎至10μm以下，得到牡蛎提取物，备用；
(2)然后以1.5kg新鲜牛大力根、4kg新鲜桑叶、9kg新鲜洋槐花为植物源原料分别培养获得相应的植物源细胞培养物，即牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物；
(3)再将牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物与人表皮干细胞混合培养，得到混合细胞培养物；
(4)最后将牡蛎提取物分散于6倍重量的质量浓度12％海藻糖水溶液中，边搅拌边加入步骤(3)中所得混合细胞培养物，均质处理，冷冻干燥，包装，即得所述的一种含有植物精华的抗衰老冻干粉。
步骤(1)中，肉酱的制备方法为：先将牡蛎肉切碎后加入4倍重量的水中，再利用组织捣碎机以15000转/分钟捣碎18分钟，即得肉酱。
步骤(1)中，蛋白酶的用量为肉酱重量的6％，以重量份计，所述蛋白酶包含：菠萝酶1份，中性蛋白酶0.7份，木瓜蛋白酶0.09份。
步骤(1)中，酶解处理的工艺条件为：pH＝5.8，53℃酶解9小时。
步骤(1)中，乳酸菌发酵的具体方法为：将100g酶解产物加入发酵罐中，调整发酵罐中水分质量含量为40％，接入0.7g植物乳杆菌ATCC8014(购自上海艾研生物科技有限公司)和0.04g干酪乳杆菌ATCC393(购自上海复祥生物科技公司)，34℃厌氧发酵33小时，巴氏灭菌，即得发酵产物。
步骤(1)中，冷冻干燥的工艺条件为：先于-23℃冷冻9小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至33℃，保温4.5小时。
步骤(2)中，植物源细胞培养物的制备方法为：先将植物源原料进行清洗和杀菌消毒，并切成1mm×1mm的小丁，单层摆在含有纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的培养基表面，培养，离心取沉淀，无菌过滤，得到植物源细胞培养物。
杀菌消毒包括：体积浓度75％酒精冲洗4次，质量浓度18％次氯酸钠溶液浸泡12分钟，质量浓度0.1％升汞溶液冲洗2次，无菌去离子水清洗4次。
所述培养基为水溶液，以重量浓度计，包含：硝酸铵105mg/L，硝酸钾1100mg/L，氯化钙125mg/L，肌醇1.5mg/L，L-精氨酸105mg/L，α-萘乙酸2.2mg/L，蔗糖13.5mg/L，琼脂3.2mg/L；纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的在培养基中的重量含量分别为0.015％、0.007％、0.009％，培养条件为：培养温度27℃，pH＝6.2，培养时间9小时。
步骤(3)的具体方法如下：先将步骤(2)所得牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物、洋槐花细胞培养物均匀分散于培养基中，接着接入人表皮干细胞(购自上海钦诚生物科技有限公司)，培养，离心取上清，无菌过滤，即得所述的混合细胞培养物。
培养基的用量为牛大力细胞培养物重量的35倍，所述培养基为水溶液，以重量浓度计，包含：硫酸镁155mg/L，硝酸钾820mg/L，氯化钙85mg/L，肌醇4mg/L，L-精氨酸135mg/L，α-萘乙酸4mg/L，蔗糖52mg/L，麦饭石颗粒110mg/L；培养条件为：培养温度27℃，pH＝5.2，通入速率0.04m3/s的过滤空气，250r/min条件下培养18天。
人表皮干细胞的用量为牛大力细胞培养物重量的0.09％。
步骤(4)中，均质处理的工艺条件为：先在70MPa条件下高压均质5个循环，然后在冰浴和1800r/min条件下搅拌8分钟。
步骤(4)中，冷冻干燥的工艺条件为：先于-22℃冷冻9小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至33℃，保温9小时。
对比例1
一种含有植物精华的抗衰老冻干粉的制备方法，具体步骤如下：
(1)先以1.2kg新鲜牛大力根、5kg新鲜桑叶、8kg新鲜洋槐花为植物源原料分别培养获得相应的植物源细胞培养物，即牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物；
(2)再将牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物与人表皮干细胞混合培养，得到混合细胞培养物；
(3)最后将牡蛎提取物分散于8倍重量的质量浓度10％海藻糖水溶液中，边搅拌边加入步骤(2)中所得混合细胞培养物，均质处理，冷冻干燥，包装，即得所述的一种含有植物精华的抗衰老冻干粉。
步骤(1)中，植物源细胞培养物的制备方法为：先将植物源原料进行清洗和杀菌消毒，并切成1mm×1mm的小丁，单层摆在含有纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的培养基表面，培养，离心取沉淀，无菌过滤，得到植物源细胞培养物。
杀菌消毒包括：体积浓度75％酒精冲洗5次，质量浓度15％次氯酸钠溶液浸泡15分钟，质量浓度0.1％升汞溶液冲洗2次，无菌去离子水清洗5次。
所述培养基为水溶液，以重量浓度计，包含：硝酸铵100mg/L，硝酸钾1110mg/L，氯化钙120mg/L，肌醇2mg/L，L-精氨酸100mg/L，α-萘乙酸2.5mg/L，蔗糖13mg/L，琼脂3.3mg/L；纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的在培养基中的重量含量分别为0.01％、0.008％、0.008％，培养条件为：培养温度29℃，pH＝6，培养时间10小时。
步骤(2)的具体方法如下：先将步骤(1)所得牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物、洋槐花细胞培养物均匀分散于培养基中，接着接入人表皮干细胞(购自上海钦诚生物科技有限公司)，培养，离心取上清，无菌过滤，即得所述的混合细胞培养物。
培养基的用量为牛大力细胞培养物重量的30倍，所述培养基为水溶液，以重量浓度计，包含：硫酸镁160mg/L，硝酸钾800mg/L，氯化钙90mg/L，肌醇3mg/L，L-精氨酸140mg/L，α-萘乙酸3mg/L，蔗糖55mg/L，麦饭石颗粒100mg/L；培养条件为：培养温度29℃，pH＝5，通入速率0.05m3/s的过滤空气，200r/min条件下培养20天。
人表皮干细胞的用量为牛大力细胞培养物重量的0.08％。
步骤(3)中，均质处理的工艺条件为：先在80MPa条件下高压均质4个循环，然后在冰浴和2000r/min条件下搅拌5分钟。
步骤(3)中，冷冻干燥的工艺条件为：先于-25℃冷冻8小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至35℃，保温8小时。
对比例2
一种含有植物精华的抗衰老冻干粉的制备方法，具体步骤如下：
(1)先将1kg新鲜牡蛎肉加水捣碎制成肉酱，利用蛋白酶进行酶解处理，灭酶，得到酶解产物，接着利用乳酸菌发酵得到发酵产物，冷冻干燥，超微粉碎至10μm以下，得到牡蛎提取物，备用；
(2)然后以5kg新鲜桑叶、8kg新鲜洋槐花为植物源原料分别培养获得相应的植物源细胞培养物，即桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物；
(3)再将桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物与人表皮干细胞混合培养，得到混合细胞培养物；
(4)最后将牡蛎提取物分散于8倍重量的质量浓度10％海藻糖水溶液中，边搅拌边加入步骤(3)中所得混合细胞培养物，均质处理，冷冻干燥，包装，即得所述的一种含有植物精华的抗衰老冻干粉。
步骤(1)中，肉酱的制备方法为：先将牡蛎肉切碎后加入5倍重量的水中，再利用组织捣碎机以14000转/分钟捣碎20分钟，即得肉酱。
步骤(1)中，蛋白酶的用量为肉酱重量的5％，以重量份计，所述蛋白酶包含：菠萝酶1份，中性蛋白酶0.8份，木瓜蛋白酶0.08份。
步骤(1)中，酶解处理的工艺条件为：pH＝6，52℃酶解10小时。
步骤(1)中，乳酸菌发酵的具体方法为：将100g酶解产物加入发酵罐中，调整发酵罐中水分质量含量为38％，接入0.8g植物乳杆菌ATCC8014(购自上海艾研生物科技有限公司)和0.03g干酪乳杆菌ATCC393(购自上海复祥生物科技公司)，35℃厌氧发酵30小时，巴氏灭菌，即得发酵产物。
步骤(1)中，冷冻干燥的工艺条件为：先于-25℃冷冻8小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至35℃，保温4小时。
步骤(2)中，植物源细胞培养物的制备方法为：先将植物源原料进行清洗和杀菌消毒，并切成1mm×1mm的小丁，单层摆在含有纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的培养基表面，培养，离心取沉淀，无菌过滤，得到植物源细胞培养物。
杀菌消毒包括：体积浓度75％酒精冲洗5次，质量浓度15％次氯酸钠溶液浸泡15分钟，质量浓度0.1％升汞溶液冲洗2次，无菌去离子水清洗5次。
所述培养基为水溶液，以重量浓度计，包含：硝酸铵100mg/L，硝酸钾1110mg/L，氯化钙120mg/L，肌醇2mg/L，L-精氨酸100mg/L，α-萘乙酸2.5mg/L，蔗糖13mg/L，琼脂3.3mg/L；纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的在培养基中的重量含量分别为0.01％、0.008％、0.008％，培养条件为：培养温度29℃，pH＝6，培养时间10小时。
步骤(3)的具体方法如下：先将步骤(2)所得桑叶细胞培养物、洋槐花细胞培养物均匀分散于培养基中，接着接入人表皮干细胞(购自上海钦诚生物科技有限公司)，培养，离心取上清，无菌过滤，即得所述的混合细胞培养物。
培养基的用量为桑叶细胞培养物重量的15倍，所述培养基为水溶液，以重量浓度计，包含：硫酸镁160mg/L，硝酸钾800mg/L，氯化钙90mg/L，肌醇3mg/L，L-精氨酸140mg/L，α-萘乙酸3mg/L，蔗糖55mg/L，麦饭石颗粒100mg/L；培养条件为：培养温度29℃，pH＝5，通入速率0.05m3/s的过滤空气，200r/min条件下培养20天。
人表皮干细胞的用量为桑叶细胞培养物重量的0.04％。
步骤(4)中，均质处理的工艺条件为：先在80MPa条件下高压均质4个循环，然后在冰浴和2000r/min条件下搅拌5分钟。
步骤(4)中，冷冻干燥的工艺条件为：先于-25℃冷冻8小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至35℃，保温8小时。
对比例3
一种含有植物精华的抗衰老冻干粉的制备方法，具体步骤如下：
(1)先将1kg新鲜牡蛎肉加水捣碎制成肉酱，利用蛋白酶进行酶解处理，灭酶，得到酶解产物，接着利用乳酸菌发酵得到发酵产物，冷冻干燥，超微粉碎至10μm以下，得到牡蛎提取物，备用；
(2)然后以2kg新鲜牛大力根、5kg新鲜桑叶、8kg新鲜洋槐花为植物源原料分别培养获得相应的植物源细胞培养物，即牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物；
(3)再将牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物与人表皮干细胞混合培养，得到混合细胞培养物；
(4)最后将牡蛎提取物分散于8倍重量的质量浓度10％海藻糖水溶液中，边搅拌边加入步骤(3)中所得混合细胞培养物，均质处理，冷冻干燥，包装，即得所述的一种含有植物精华的抗衰老冻干粉。
步骤(1)中，肉酱的制备方法为：先将牡蛎肉切碎后加入5倍重量的水中，再利用组织捣碎机以14000转/分钟捣碎20分钟，即得肉酱。
步骤(1)中，蛋白酶的用量为肉酱重量的5％，以重量份计，所述蛋白酶包含：菠萝酶1份，中性蛋白酶0.8份，木瓜蛋白酶0.08份。
步骤(1)中，酶解处理的工艺条件为：pH＝6，52℃酶解10小时。
步骤(1)中，乳酸菌发酵的具体方法为：将100g酶解产物加入发酵罐中，调整发酵罐中水分质量含量为38％，接入0.8g植物乳杆菌ATCC8014(购自上海艾研生物科技有限公司)和0.03g干酪乳杆菌ATCC393(购自上海复祥生物科技公司)，35℃厌氧发酵30小时，巴氏灭菌，即得发酵产物。
步骤(1)中，冷冻干燥的工艺条件为：先于-25℃冷冻8小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至35℃，保温4小时。
步骤(2)中，植物源细胞培养物的制备方法为：先将植物源原料进行清洗和杀菌消毒，并切成1mm×1mm的小丁，单层摆在含有纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的培养基表面，培养，离心取沉淀，无菌过滤，得到植物源细胞培养物。
杀菌消毒包括：体积浓度75％酒精冲洗5次，质量浓度15％次氯酸钠溶液浸泡15分钟，质量浓度0.1％升汞溶液冲洗2次，无菌去离子水清洗5次。
所述培养基为水溶液，以重量浓度计，包含：硝酸铵100mg/L，硝酸钾1110mg/L，氯化钙120mg/L，肌醇2mg/L，L-精氨酸100mg/L，α-萘乙酸2.5mg/L，蔗糖13mg/L，琼脂3.3mg/L；纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的在培养基中的重量含量分别为0.01％、0.008％、0.008％，培养条件为：培养温度29℃，pH＝6，培养时间10小时。
步骤(3)的具体方法如下：先将步骤(2)所得牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物、洋槐花细胞培养物均匀分散于培养基中，接着接入人表皮干细胞(购自上海钦诚生物科技有限公司)，培养，离心取上清，无菌过滤，即得所述的混合细胞培养物。
培养基的用量为牛大力细胞培养物重量的30倍，所述培养基为水溶液，以重量浓度计，包含：硫酸镁160mg/L，硝酸钾800mg/L，氯化钙90mg/L，肌醇3mg/L，L-精氨酸140mg/L，α-萘乙酸3mg/L，蔗糖55mg/L，麦饭石颗粒100mg/L；培养条件为：培养温度29℃，pH＝5，通入速率0.05m3/s的过滤空气，200r/min条件下培养20天。
人表皮干细胞的用量为牛大力细胞培养物重量的0.08％。
步骤(4)中，均质处理的工艺条件为：先在80MPa条件下高压均质4个循环，然后在冰浴和2000r/min条件下搅拌5分钟。
步骤(4)中，冷冻干燥的工艺条件为：先于-25℃冷冻8小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至35℃，保温8小时。
对比例4
一种含有植物精华的抗衰老冻干粉的制备方法，具体步骤如下：
(1)先将1kg新鲜牡蛎肉加水捣碎制成肉酱，利用蛋白酶进行酶解处理，灭酶，得到酶解产物，接着利用乳酸菌发酵得到发酵产物，冷冻干燥，超微粉碎至10μm以下，得到牡蛎提取物，备用；
(2)然后以1.2kg新鲜牛大力根、5kg新鲜桑叶、8kg新鲜洋槐花为植物源原料分别培养获得相应的植物源细胞培养物，即牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物，混合，得到混合细胞培养物；
(3)最后将牡蛎提取物分散于8倍重量的质量浓度10％海藻糖水溶液中，边搅拌边加入步骤(2)中所得混合细胞培养物，均质处理，冷冻干燥，包装，即得所述的一种含有植物精华的抗衰老冻干粉。
步骤(1)中，肉酱的制备方法为：先将牡蛎肉切碎后加入5倍重量的水中，再利用组织捣碎机以14000转/分钟捣碎20分钟，即得肉酱。
步骤(1)中，蛋白酶的用量为肉酱重量的5％，以重量份计，所述蛋白酶包含：菠萝酶1份，中性蛋白酶0.8份，木瓜蛋白酶0.08份。
步骤(1)中，酶解处理的工艺条件为：pH＝6，52℃酶解10小时。
步骤(1)中，乳酸菌发酵的具体方法为：将100g酶解产物加入发酵罐中，调整发酵罐中水分质量含量为38％，接入0.8g植物乳杆菌ATCC8014(购自上海艾研生物科技有限公司)和0.03g干酪乳杆菌ATCC393(购自上海复祥生物科技公司)，35℃厌氧发酵30小时，巴氏灭菌，即得发酵产物。
步骤(1)中，冷冻干燥的工艺条件为：先于-25℃冷冻8小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至35℃，保温4小时。
步骤(2)中，植物源细胞培养物的制备方法为：先将植物源原料进行清洗和杀菌消毒，并切成1mm×1mm的小丁，单层摆在含有纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的培养基表面，培养，离心取沉淀，无菌过滤，得到植物源细胞培养物。
杀菌消毒包括：体积浓度75％酒精冲洗5次，质量浓度15％次氯酸钠溶液浸泡15分钟，质量浓度0.1％升汞溶液冲洗2次，无菌去离子水清洗5次。
所述培养基为水溶液，以重量浓度计，包含：硝酸铵100mg/L，硝酸钾1110mg/L，氯化钙120mg/L，肌醇2mg/L，L-精氨酸100mg/L，α-萘乙酸2.5mg/L，蔗糖13mg/L，琼脂3.3mg/L；纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的在培养基中的重量含量分别为0.01％、0.008％、0.008％，培养条件为：培养温度29℃，pH＝6，培养时间10小时。
步骤(3)中，均质处理的工艺条件为：先在80MPa条件下高压均质4个循环，然后在冰浴和2000r/min条件下搅拌5分钟。
步骤(3)中，冷冻干燥的工艺条件为：先于-25℃冷冻8小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至35℃，保温8小时。
试验例
任选皮肤健康、无皮肤病过敏史的受试者80名，年龄35～45岁，随机分为8组，前7组分别使用实施例1～3或对比例1～4的冻干粉产品，最后一组作为对照组，用去离子水替代冻干粉产品；使用方法：将冻干粉复溶于3倍重量的去离子水中，每天早晚各均匀涂抹于脸部，连续使用两周。
利用VISIA测试仪对志愿者使用前后的脸部皮肤进行皮肤皱纹分值测试，测试前，志愿者清洁皮肤后，在21±1℃、相对湿度50％±10％环境下稳定至少30分钟。同时观察不良反应。结果见表1。
表1.冻干粉使用效果
Figure BDA0002650044270000141
由表1可知，实施例1～3所得冻干粉无不良反应，抗衰老效果好。
对比例1略去步骤(1)，对比例2略去步骤(2)中的新鲜牛大力根，产品的抗衰老效果明显变差，说明牡蛎肉与牛大力、桑叶、洋槐花等协同提高抗衰老性能；对比例3增大新鲜牛大力根的用量，对比例3略去步骤(3)，产品不良反应明显增多，说明牛大力根超量或未经人表皮干细胞混合培养会导致不良反应增多。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种含有植物精华的抗衰老冻干粉的制备方法，其特征在于，以重量份计，具体步骤如下：
(1)先将1份新鲜牡蛎肉加水捣碎制成肉酱，利用蛋白酶进行酶解处理，灭酶，得到酶解产物，接着利用乳酸菌发酵得到发酵产物，冷冻干燥，超微粉碎至10μm以下，得到牡蛎提取物，备用；
(2)然后以1.2～1.8份新鲜牛大力根、3～5份新鲜桑叶、8～10份新鲜洋槐花为植物源原料分别培养获得相应的植物源细胞培养物，即牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物；
(3)再将牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物和洋槐花细胞培养物与人表皮干细胞混合培养，得到混合细胞培养物；
(4)最后将牡蛎提取物分散于5～8倍重量的质量浓度10～15％海藻糖水溶液中，边搅拌边加入步骤(3)中所得混合细胞培养物，均质处理，冷冻干燥，包装，即得所述的一种含有植物精华的抗衰老冻干粉。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，肉酱的制备方法为：先将牡蛎肉切碎后加入3～5倍重量的水中，再利用组织捣碎机以14000～16000转/分钟捣碎15～20分钟，即得肉酱。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，蛋白酶的用量为肉酱重量的5～8％，以重量份计，所述蛋白酶包含：菠萝酶1份，中性蛋白酶0.5～0.8份，木瓜蛋白酶0.08～0.1份。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，酶解处理的工艺条件为：pH＝5.5～6，52～55℃酶解8～10小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，以重量份计，乳酸菌发酵的具体方法为：将100份酶解产物加入发酵罐中，调整发酵罐中水分质量含量为38～42％，接入0.5～0.8份植物乳杆菌ATCC8014和0.03～0.05份干酪乳杆菌ATCC393，33～35℃厌氧发酵30～35小时，巴氏灭菌，即得发酵产物。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，植物源细胞培养物的制备方法为：先将植物源原料进行清洗和杀菌消毒，并切成1mm×1mm的小丁，单层摆在含有纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的培养基表面，培养，离心取沉淀，无菌过滤，得到植物源细胞培养物。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法如下：先将步骤(2)所得牛大力细胞培养物、桑叶细胞培养物、洋槐花细胞培养物均匀分散于培养基中，接着接入人表皮干细胞，培养，离心取上清，无菌过滤，即得所述的混合细胞培养物。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，均质处理的工艺条件为：先在60～80MPa条件下高压均质4～6个循环，然后在冰浴和1500～2000r/min条件下搅拌5～10分钟。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，冷冻干燥的工艺条件为：先于-20～-25℃冷冻8～10小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至30～35℃，保温8～10小时。
10.利用权利要求1～9中任一项所述制备方法得到的一种含有植物精华的抗衰老冻干粉。
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