KR102130988B1

KR102130988B1 - 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 항노화 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102130988B1
Application number: KR1020190150572A
Authority: KR
Inventors: 조현대; 김봉준; 강정욱; 성미경; 김동현; 정윤주; 이성현; 권순상; 최호민; 조미래
Original assignee: 주식회사 코스메카코리아; 주식회사 두래
Priority date: 2019-11-21
Filing date: 2019-11-21
Publication date: 2020-07-09

Abstract

꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 항노화 화장료 조성물이 개시된다. 본 발명에 따른 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 항노화 화장료 조성물에 의하면, 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 등의 천연 복합 추출물을 저온숙성을 통해 당단백질 함량을 높일 수 있고, 피부재생 및 콜라겐 합성을 증가시키고 MMP-1의 활성을 억제시킴으로써 주름개선 효능을 가지며, 자가포식의 활성을 증가시키고 beta galactosidase 활성 억제를 통해 노화세포가 억제되어 항노화 효능을 가진다.

Description

꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 항노화 화장료 조성물{manufacturing method of the complex of Honey, Wax gourd, Trichosanthis, Omija, Ginseng, Mulberry tree, Pagoda tree fermented low temperature and cosmetic composition for anti-aging comprising the same}

본 발명은 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 항노화 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 저온숙성을 통해 당단백질 함량을 높이고, 피부재생 및 콜라겐 합성을 증가시키고 MMP-1의 활성을 억제시킴으로써 주름개선 효능을 가지며, 자가포식의 활성 증가와 beta galactosidase 활성 억제를 통해 노화세포가 억제됨으로써 항노화 효능을 가진 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 항노화 화장료 조성물에 관한 것이다.

아름다움을 추구하는 여성의 본능은 어제오늘의 일이 아니지만, 최근 들어 자신을 더욱 예뻐 보이게 하기 위한 체형 관리나 미용 또는 화장품에 대한 관심이 더욱 높아지는 추세에 있다.

그리고 여성뿐만 아니라 남성들도 피부관리를 위해 화장품에 관심을 두게 됨에 따라 화장품 시장은 계속해서 확대되고 있으며, 다양한 종류의 화장품이 시장에 출시되고 있다.

일반적으로 화장품은 크게 기초 화장품, 메이크업 베이스와 색조 화장품 등으로 나눌 수 있고, 고형, 액상 또는 겔상의 화장료로 제조되며, 이들을 보관하는 화장품 용기도 다양한 형태로 적용되고 있다.

최근에는 보습, 미백, 주름개선, 자외선 차단, 여드름 완화, 아토피 완화, 항염증이나 각질용해 등 다양한 기능을 수행할 수 있는 기능성 화장품도 널리 소비되고 있다.

이러한 기능성 화장품 중 항노화 화장품은 피부세포의 노화를 억제하고 주름을 개선하여 피부 상태를 보다 젊게 유지시키는 기능을 수행하는 것이다.

피부 노화의 주 원인으로 작용하는 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)의 종류로는 생체 내에서 발생하는 superoxide anion radical(O2·2^-), hydroxyl radical(·OH)과 hydrogen peroxide(H₂O₂) 등이 포함되며 이들의 산화적 대사 부산물이 중요한 원인이 된다.

이들 ROS는 세포막 지방질을 과산화시키고 세포막투과성의 변화를 초래하여 DNA 손상을 유발시킴으로써 노화 현상이 나타난다. 또한, 자외선, 공해, 흡연 및 세균 등에 의해 여러 가지 신호체계가 활성화됨으로써 염증반응이 일어나고 피부 구성성분이 손상되면서 피부 노화가 진행된다.

자외선에 의해 손상 받은 피부는 콜라겐의 양이 감소하는데, 이는 피부 내에서 MMPs(matrix metallo proteinase)의 발현이 증가하기 때문이며, 이러한 MMPs는 피부 광노화 발생에 중요한 역할을 한다. MMPs는 피부의 세포들(keratinocytes, fibroblasts)로부터 분비되어 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane, BM)을 구성하는 대부분의 단백질 성분을 분해함으로써 피부 탄력을 유지하는 결합조직을 파괴하여 주름과 탄력저하 및 피부 처짐의 원인이 되는 것으로 알려져있다.

여러 피부 노화를 극복하는 인체 내 시스템 중 하나인 Autophagy(자가포식)는 오래되거나 불필요한 세포질 내 물질들을 세포 스스로 분해하여 세포 영양분을 재사용하는 세포 스스로의 정화작용을 말하며, 이를 통해 세포 생존, 성장, 분화 및 항상성 유지에 필요한 각종 아미노산, 핵산, 지방산 등을 공급하는 역할을 한다. Autophagy 활성 증가에 따라 ATG5 형질 전환을 통한 저분자화가 노화와 연관되어진다.

복합 천연물질 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 대한 선행기술은 등록특허 10-1702042호 호두 및 밤의 복합 발효추출물을 이용한 피부의 노화방지 및 주름개선용 화장료 조성물, 등록특허 10-1566320호 봉선화, 영실, 마카, 비과나무 잎 및 얌빈 뿌리 복합발효추출물을 포함하는 피부 재생, 진정 및 자극완화용 화장료조성물 등을 통한 복합 천연 추출물에 대한 기술이 개시되어 있다. 기존 복합 천연 추출물 등에도 유효한 성분을 통해 효능효과를 나타내고 있지만, 숙성 또는 발효 등을 통한 2차 가공을 통해 유효성분의 함량이 증가하거나 피부흡수율이 증가하는 등의 연구가 진행되고 있으며, 다양한 방법적 접근이 시도되고 있다.

피부에서 당단백질(Glycoprotein)은 세포 외 기질 중 하나인 콜라겐 및 엘라스틴과 공유결합 되어있는 형태로 존재하여 다량의 수분을 기질에 보유하게 함으로써, 피부의 탄력과 주름을 방지하는 역할을 한다. 특히 대부분의 식물성 당단백질은 동물성 콜라겐 보다 더 많은 양의 당을 함유하며, 저분자량이므로 피부에 잘 흡수되고 생리학적 활성의 내구성을 제공하는 매우 기능적인 물질이다. 또한, J. Lee 등의 연구를 통해 아미노산으로 이루어져 있어 인공 합성물 보다 세포 독성이 적기 때문에 다양한 천연물로부터 당단백질을 추출하여 피부에 보다 효과적이고 친화력이 좋은 다기능성 소재로써의 연구가 활발히 진행되고 있다.

한편, 용암해수란 바닷물이 화산암반층에 의해 자연 여과되어 육지의 지하로 스며든 물로써, 외부 환경에 노출되어 있지 않아 물리적 특성 변화가 적어 지속적, 안정적 개발이 가능한 제주만이 보유한 지하자원수이다. 용암해수는 마그네슘, 칼슘 등의 미네랄과 영양염류가 풍부할 뿐만 아니라 유기물 및 병원균 등이 거의 없는 청정하고 안전성을 가지는 해수이다. 용암해수에 존재하는 미생물의 효소가 원재료를 변화시켜 이로운 성분을 만들어내며, 분해 작용을 통해 작은 크기로 미립자화 되기 때문에 피부 흡수력이 좋은 아미노산, 항산화 및 항노화 성분들이 만들어진다.

최근 웰빙을 추구화는 경향에 따라 첨가물을 사용하지 않고 그대로 발효시켜 발효물을 얻은 후 이를 활용한 제품에 대한 요구가 있으며 이를 반영한 화장료 조성물을 개발하고자 한다. 이에 본 발명자들은 기존 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 복합 추출물의 보다 뛰어난 효능효과를 확인하기 위해서 용암해수를 통한 저온숙성을 통해 당단백질 함량을 증가시키는 제조방법을 적용함으로써 천연 복합 저온숙성 추출물의 유효성분 함량 변화를 관찰하여 항노화 효과의 우수함이 확인된 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 실시예들은 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 등의 천연 복합 추출물을 저온숙성을 통해 당단백질 함량을 높이고자 한다.

또한, 피부재생 및 콜라겐 합성을 증가시키고 MMP-1의 활성을 억제시킴으로써 주름개선 효능을 가진 화장료를 제공하고자 한다.

또한, 자가포식의 활성을 증가시키고 beta galactosidase 활성 억제를 통해 노화세포가 억제되어 항노화 효능을 가진 화장료를 제공하고자 한다.

본 발명의 일 측면에 의하면, 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼을 혼합한 복합물을 용암해수에 침지시키는 단계; 상기 복합물이 침지된 용암해수를 일정 기간 저온 숙성시키는 단계; 상기 숙성된 복합물과 용암해수 혼합물을 여과포로 여과하여 여과물을 얻는 단계; 상기 여과물에 정제수를 가하여 혼합하고 여과포로 여과하여 염분을 제거하는 단계; 및 상기 염분이 제거된 복합물을 포함하는 여과물을 열풍기로 건조시켜 저온숙성 복합 추출물을 수득하는 단계;를 포함하는 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법이 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법은 상기 저온숙성 복합 추출물을 미분쇄하고 복합 추출물 질량에 대하여 10배 가수하는 단계;를 더 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법은 상기 10배 가수된 복합 추출물에 구연산을 첨가하고 펩신을 투입하여 교반하면서 효소반응 하는 단계;를 더 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법은 상기 효소 처리한 복합 추출물을 필터지로 여과한 후 가열하고 재여과하는 단계;를 더 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법은 상기 재여과된 복합 추출물을 농축하고 동결건조하는 단계;를 더 포함하여 이루어질 수 있다.

상기 저온 숙성은 1℃ 내지 20℃의 온도 범위에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 전술한 방법에 의해 제조된 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물을 포함하는 항노화 화장료 조성물이 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 화장료 조성물.

상기 저온숙성 복합 추출물은 0.001중량% 내지 30중량% 함유될 수 있다.

본 발명의 실시예들은 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 등의 천연 복합 추출물을 저온숙성을 통해 당단백질 함량을 높일 수 있다.

또한, 피부재생 및 콜라겐 합성을 증가시키고 MMP-1의 활성을 억제시킴으로써 주름개선 효능을 가진 화장료를 제공할 수 있다.

또한, 자가포식의 활성을 증가시키고 beta galactosidase 활성 억제를 통해 노화세포가 억제되어 항노화 효능을 가진 화장료를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 저온숙성 복합 추출물과 비교예의 세포 독성을 비교한 그래프
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 저온숙성 복합 추출물과 비교예의 피부 재생을 비교한 그래프
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 저온숙성 복합 추출물과 비교예의 Procollagen 생성 효능을 비교한 그래프
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 저온숙성 복합 추출물과 비교예의 UV 자극에 의한 MMP-1 생성 억제 효능을 비교한 그래프
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 저온숙성 복합 추출물과 비교예의 Bafilomycin A1 의한 MMP-1 생성 억제 효능을 비교한 그래프
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 저온숙성 복합 추출물과 비교예의 Autophagy 관련 단백질의 발현 효과를 비교한 이미지
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 저온숙성 복합 추출물과 비교예의 Senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal) 활성 억제 효과를 비교한 이미지

이하, 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예들을 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록, 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 저온숙성 복합 추출물과 비교예의 세포 독성을 비교한 그래프이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 저온숙성 복합 추출물과 비교예의 피부 재생을 비교한 그래프이며, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 저온숙성 복합 추출물과 비교예의 Procollagen 생성 효능을 비교한 그래프이다. 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 저온숙성 복합 추출물과 비교예의 UV 자극에 의한 MMP-1 생성 억제 효능을 비교한 그래프이고, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 저온숙성 복합 추출물과 비교예의 Bafilomycin A1 의한 MMP-1 생성 억제 효능을 비교한 그래프이며, 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 저온숙성 복합 추출물과 비교예의 Autophagy 관련 단백질의 발현 효과를 비교한 이미지이다. 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 저온숙성 복합 추출물과 비교예의 Senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal) 활성 억제 효과를 비교한 이미지이다.

도 1 내지 도 7을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법은 크게 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼을 혼합한 복합물을 용암해수에 침지시키는 단계; 상기 복합물이 침지된 용암해수를 일정 기간 저온 숙성시키는 단계; 상기 숙성된 복합물과 용암해수 혼합물을 여과포로 여과하여 여과물을 얻는 단계; 상기 여과물에 정제수를 가하여 혼합하고 여과포로 여과하여 염분을 제거하는 단계; 및 상기 염분이 제거된 복합물을 포함하는 여과물을 열풍기로 건조시켜 저온숙성 복합 추출물을 수득하는 단계;를 포함하여 이루어질 수 있다.

실시예 : 펩신 효소처리를 통한 용암해수 저온숙성 복합물 추출물의 제조

꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼을 각각 100 ~　150g 씩을 혼합하여 복합물의 10배 중량에 해당하는 용암해수에 침지시켜 1℃ 내지 20℃의 온도를 유지하며, 7일 동안 숙성하였다. 온도가 1℃ 미만인 경우에는 낮은 온도로 인해 복합물이 얼거나 숙성 효율이 떨어지는 문제가 있고 온도가 20℃를 초과하는 경우에는 높은 온도로 인해 복합물이 부패할 우려가 있으므로 1℃ 내지 20℃ 범위에서 숙성이 이루어지는 것이 바람직하다.

상기 용암해수는 용암해수 원수에서 불순물을 제거한 후에 역삼투압법에 의하여 탈염 용암해수 제조 시에 생성되는 부산물로 염분과 이온성 미네랄을 포함하고 있다.

용암해수에 존재하는 미생물의 효소가 원재료를 변화시켜 이로운 성분을 만들어내며, 분해 작용을 통해 작은 크기로 미립자화 하기 때문에 피부 흡수력이 좋은 아미노산, 항산화 및 항노화 성분들이 만들어진다. 따라서, 본 발명에서는 당단백질의 함량을 증대하기 위한 추출법으로 7가지의 천연물질을 제주 용암해수에 침지한 후 옹기에 저온숙성 하여 천연 발효시켰다. 옹기를 통한 저온숙성은 천연재료를 저온에서 오랜 시간 숙성시키는 옛 선조들의 지혜에서 착안한 기술로써 화학성분을 통해 만들어진 것이 아닌 천연의 유용성분이 증대되는 천연 발효기술이다.

구체적으로 상기 복합물과 용암 해수 혼합물을 200 메쉬 나일론 여과포로 여과하여, 숙성된 복합물을 포함하는 여과물을 얻은 후, 복합물 분말의 10 중량에 해당하는 정제수를 가하여 혼합하고 200 메쉬 나일론 여과포로 여과하는 과정을 3회 반복하여, 숙성 복합물에 남아있는 염분을 제거하였다. 염분을 제거한 후 복합물을 포함하는 여과물을 55℃ 열풍기에서 24시간 이상 건조하여 용암해수를 통한 저온숙성 복합 추출물을 수득하였다.

상기와 같이 제조된 저온숙성 복합 추출물 미분쇄하고 숙성 복합물 질량에 대하여 10배 가수하였다. 여기에 구연산을 첨가하여 pH가 3.5가 되도록 한 후, 온도를 높여 40℃에서 펩신을 투입하여 효소반응을 5시간 이상 교반하면서 진행하여 추출하였다. 효소 처리한 숙성 복합물 추출물을 1μm 필터지로 여과한 후, 이 여과액의 효소를 실활 시키기 위해 80℃로 1시간 재 가열하여 1μm 필터지로 재 여과하였다. 이를 농축하고 동결 건조하여 효소처리된 저온숙성 복합 추출물을 수득하였다.

비교예 : 일반 복합물 추출물의 제조

꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼을 각각 100 ~　150g 씩을 혼합하여 미분쇄하고 복합물 질량에 대하여 10배 가수 하고 40℃에서 물 추출을 진행하였다. 이후 복합물 추출물을 1μm 필터지로 여과한 후 이를 농축하였다. 이후 동결 건조하여 일반 복합물 추출물을 얻었다.

실험예 1 : 아미노산 분석

상기 실시예 및 비교예에서 수득한 저온숙성 복합 추출물 및 일반추출물을 이용하여 아미노산 분석을 진행하였다. 상기 추출한 검액을 20 μL씩 취하여 HPLC 바이알에 넣고 AccQ-Tag amino acids derivatization kit의 유도체화 시액 중 borate buffer 70 μL, Flour reagent 2A 20 μL를 넣어 잘 흔들어 섞어 1 min간 실온에 방치 후 55 ℃에서 10 min 동안 반응시켜 형광 유도체화하여 검액으로 하였으며 검액과 표준액은 3회 반복 측정하여 평균값을 확인하였다.

그 결과는 하기의 표 1에 나타내었으며, 저온숙성 복합 추출물이 기존 일반추출물보다 아미노산이 약 21.1% 증가됨을 확인하였다. 수분 유지 기능이 있는 이소류신(Ile)과 활성산소를 제거하는 메티오닌(Met)함량이 급격히 증가하였으며, 그 외 펩타이드 형태로 결합되 피부 친화력이 뛰어난 다수의 아미노산들이 증가하였다.

	일반추출물 (g/100g)	저온숙성 추출물 (g/100g)	증가율 (%)
Asp	1.034	0.834	-19.392
Thr	0.133	0.300	126.428
Ser	0.181	0.415	128.934
Glu	1.488	1.258	-15.459
Pro	0.164	0.325	98.756
Gly	0.186	0.370	98.953
Ala	0.302	0.385	27.448
Val	0.157	0.349	122.176
Ile	0.099	0.299	202.481
Leu	0.163	0.538	230.653
Tyr	0.087	0.257	195.319
Phe	0.117	0.388	232.102
Lys	0.178	0.338	90.194
His	0.079	0.165	109.081
Arg	1.633	1.002	-38.666
Cys	0.137	0.147	7.277
Met	0.034	0.104	205.058
Total	6.172	7.474	21.108

실험예 2 : 세포독성 (Cell toxicity)

상기 실시예 및 비교예에서 수득한 저온숙성 복합 추출물 및 일반추출물을 이용하여 세포독성 실험을 진행하였다. 96 well plate에 HaCaT을 1.5 X 10⁴ cells/well, 인체섬유아세포를 0.6 X 10⁴ cells/well씩 분주한 후, 24시간 동안 세포가 plate에 잘 붙도록 37℃, 5% CO₂세포 배양기에 배양하였다. HaCaT에 FBS를 포함하지 않은 DMEM 배지(serum free 배지)를, 인체섬유아세포에는 supplement를 포함하지 않은 FBM 배지를 사용하여 세포를 기아상태로 만들어 준 후, 다음 날 시험물질을 농도 별로 처리하여 배양하였다. 세포에 WST-1 시약(DoGen, EZ-3000)을 처리하여 반응시키고, ELISA reader(Thermo, 51119300)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포생존율(%)=시료첨가군의 흡광도 / 대조군의 흡광도 × 100

도 1에서 나타나듯이 HaCaT 및 인체섬유아세포에서 복합물에 대한 숙성 및 효소처리 전과 숙성 및 효소처리 후 추출물 모두 최고 20㎍/㎖에서 세포독성이 나타나지 않았다. 세포독성 결과를 토대로 세포독성이 없는 농도에서 시험물질을 처리하여 효능 시험을 진행하였다.

실험예 3 : 피부 재생 (Cell proliferation)

상기 실시예 및 비교예에서 수득한 저온숙성 복합 추출물 및 일반추출물을 이용하여 피부 재생 효능을 확인하였다. 96 well plate에 HaCaT 세포를 0.7 X 10⁴ cells/well, 인체섬유아세포를 0.3 X 10⁴ cells/well씩 분주한 후, 세포 배양조건에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배지를 버리고 PBS로 세척한 다음 FBS 및 supplement를 포함하지 않은 배지를 사용하여 세포를 기아상태로 만들어 준 후, 다음 날 일정농도의 시험물질을 처리하여 세포를 24시간 배양하였다. 이 때 양성 대조군으로 FBS, supplement가 포함된 배지를 사용하였으며, 배지에 10배 희석시킨 WST-1 시약을 각 well에 100ul를 넣고 2시간동안 배양한 후 ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Cell proliferation 분석 결과를 도 2에 나타내었다. 인체섬유아세포(Normal Human Fibroblasts)에서는 용암해수 저온숙성 및 효소처리 전, 후 추출물 모두 세포 증식 효과가 없었으며 Human Keratinocytes인 HaCaT에서는 용암해수 저온숙성 및 효소처리 추출물에서 약 25.48%의 세포 증식 효과를 보였다.

실험예 4 : Procollagen 생성 효능

상기 실시예 및 비교예에서 수득한 저온숙성 복합 추출물 및 일반추출물을 이용하여 procollagen 생성 효능을 확인하였다. 96 well plate에 인체섬유아세포를 0.6 X 10⁴ cells/well씩 분주한 후, 24시간 동안 세포가 plate에 잘 붙도록 37℃, 5% CO₂세포 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, supplement를 포함하지 않은 FBM 배지를 사용하여 세포를 기아상태로 만들어 준 후, 다음 날 시료를 농도별로 처리하여 배양하였다. 이 때의 양성대조군으로 TGF-b를 사용하였으며 Procollagen (Takara, MK101) ELISA kit를 이용하여 실험 후, ELISA reader로 450nm 흡광도를 측정하였다. 최종 procollagen의 양은 일정 단백질당 procollagen 양으로 환산하여 음성대조군과 비교하였다.

실험결과, 도 3에서 보듯이 일반 추출물은 procollagen의 생성 촉진 효과가 보이지 않았으나 용암해수 저온숙성 및 효소처리 추출물에서는 약 13.56%의 procollagen 생성 촉진 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5 : UV 자극에 의한 MMP-1 생성 억제

상기 실시예 및 비교예에서 수득한 저온숙성 복합 추출물 및 일반추출물을 이용하여 MMP-1 생성 억제효과를 확인하였다. 6 well plate에 HaCaT을 2.5 X 105 cells/well씩 분주한 후, 세포 배양조건에서 24시간 배양하였다. 배지를 버리고 PBS로 세척한 다음 FBS를 포함하지 않은 DMEM 배지(serum free 배지)를 사용하여 세포를 기아상태로 만들어 준 후, 다음 날 UV를 처리하여 배양하였다. 96 well plate에 인체섬유아세포를 0.6 X 10⁴ cells/well씩 분주한 후, 세포 배양조건에서 24시간 배양하였다. Supplement를 포함하지 않은 FBM 배지를 사용하여 세포를 기아상태로 만들어 준 후, 다음 날 UV 자극을 받은 HaCaT 배양액을 시험물질과 함께 인체섬유아세포에 처리하여 배양하였다. MMP-1 (R&D System, DY901) ELISA kit를 이용하여 실험 후, ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 최종 MMP-1의 양은 일정 단백질 당 MMP-1 양으로 환산하여 음성 대조군과 비교하였다.

Procollagen 분해효소인 MMP-1의 Production 측정 결과를 도 4에 나타내었다. 일반 추출물과 용암해수 저온숙성 및 효소처리 추출물 모두 UV자극으로 인해 증가한 MMP-1 생성을 억제하였으나 용암해수 저온숙성 및 효소처리 추출물이 일반 추출물보다 약 35.14% 더 우수한 MMP-1 생성 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실험예 6 : Bafilomycin A1 의한 MMP-1 생성 억제

상기 실시예 및 비교예 에서 수득한 저온숙성 복합 추출물 및 일반추출물을 이용하여 Bafilomycin A1 의한 MMP-1 생성 억제효과를 확인하였다. 96 well plate에 인체섬유아세포를 0.6 X 10⁴ cells/well씩 분주한 후, 24시간 동안 세포가 plate에 잘 붙도록 37℃, 5% CO₂세포 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, supplement를 포함하지 않은 FBM 배지를 사용하여 세포를 기아상태로 만들어 준 후, 다음 날 Autophagy 억제제인 Bafilomycin A1과 시료를 농도별로 처리하여 배양하였다. MMP-1 (R&D System, DY901) ELISA kit를 이용하여 실험 후, ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 최종 MMP-1의 양은 일정 단백질 당 MMP-1 양으로 환산하여 음성 대조군과 비교하였다.

MMP-1 Production 측정 결과를 도 5에 나타내었다. 일반 추출물과 용암해수 저온숙성 및 효소처리 추출물 모두 autophagy 억제로 인해 증가한 MMP-1 생성을 억제하였으나 용암해수 저온숙성 및 효소처리 추출물이 일반 추출물보다 더 우수한 MMP-1 생성 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실험예 7 : Autophagy 관련 단백질의 발현

상기 실시예 및 비교예 에서 수득한 저온숙성 복합 추출물 및 일반추출물을 이용하여 autophagy 관련 단백질 발현효과를 확인하였다. 100mm plate에 인체섬유아세포를 8.0 X 10⁵ cells/well씩 분주한 후, 세포 배양조건에서 24시간 배양하였다. 배지를 버리고 PBS로 세척한 다음 supplement를 포함하지 않은 FBM 배지를 사용하여 세포를 기아상태로 만들어 주고 다음날 시험물질을 농도 별로 처리하여 배양하였다. 배양 후, 각 세포에 RIPA buffer를 처리하여 단백질을 추출해 낸 후, 단백질 농도를 측정하였다. 동량의 단백질을 함유하는 시료를 준비하여 Tris glycine gel의 각 well에 넣고 전기영동을 하였다. 전기영동이 된 gel을 nitrocellulose membrane에 transfer한 후, 5%의 skim milk로 상온에서 1시간 blocking하였다. Membrane에 1차 항체(Becline 1, ATG7, ATG5, ATG3, ATG12, ATG16, LC3-Ⅰ/Ⅱ, LAMP2, β-actin)를 4도에서 overnight 반응시켜준 후, Membrane을 TBST로 3회 세척하였다. 2차 항체를 상온에서 1시간 반응시킨 다음 TBST로 3회 세척하였다. Membrane에 ECL 용액을 처리한 후, chemidoc 기기를 이용하여 각 단백질의 발현을 확인하였다.

Western blotting 결과는 도 6에 나타내었다. Autophagy 관련 단백질인 LC3-Ⅰ/Ⅱ, ATG7, ATG3, ATG5 발현이 증가하였으며, 용암해수 저온숙성 및 효소처리 추출물이 일반 추출물보다 autophagy 활성이 우수한 것을 확인하였다.

실험예 8 : Senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal) 활성 억제

상기 실시예 및 비교예 에서 수득한 저온숙성 복합 추출물 및 일반추출물에 대해 SA-β-gal을 이용하여 노화 억제효과를 확인하였다. 6 well plate에 인체섬유아세포를 5 X 10⁴ cells/well씩 분주한 후, 24시간 동안 세포가 plate에 잘 붙도록 37℃, 5% CO₂세포 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, 시료를 농도별로 처리하여 배양하였다. 2일에서 3일 배양 후, 세포 밀도가 80% 이상 되면 새로운 plate에 분주하였다. 위의 방법을 세포가 노화될 때까지 반복하였다. SA-β-gal 염색은 senescence β-galactosidase staining kit (Cell Signaling, 9860S)를 이용하여 실험 후, 광학현미경으로 파란색으로 염색된 세포를 관찰하였다.

Senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal) 활성 억제 시험 결과는 도 7에 나타내었다. 노화된 세포는 beta-galactosidase의 발현 증가로 인해 푸른색으로 염색되며, 용암해수 저온숙성 및 효소처리 추출물의 autophagy 활성 증가로 인해 세포 노화가 억제되는 것을 관찰하였다.

전술한 방법을 통해 제조된 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물은 항노화 화장료 조성물에 유효성분으로서 함유되어 적용될 수 있다. 이때, 상기 저온숙성 복합 추출물은 전체 항노화 화장료 조성물의 중량 중 0.001중량% 내지 30중량% 정도 함유될 수 있다.

상기 저온숙성 복합 추출물이 0.001중량% 미만인 경우에는 충분한 항노화 효과를 기대할 수 없고, 30중량%를 초과하는 경우에는 제형 안정성에 문제가 있을 수 있다. 따라서 상기 저온숙성 복합 추출물의 비율은 총 중량에 대하여 0.001중량% 내지 30중량% 범위에서 결정되는 것이 바람직하다.

지금까지 설명한 본 발명의 실시예들에 의한 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 항노화 화장료 조성물에 따르면, 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 등의 천연 복합 추출물을 저온숙성을 통해 당단백질 함량을 높일 수 있고, 피부재생 및 콜라겐 합성을 증가시키고 MMP-1의 활성을 억제시킴으로써 주름개선 효능을 가지며, 자가포식의 활성을 증가시키고 beta galactosidase 활성 억제를 통해 노화세포가 억제되어 항노화 효능을 가진다.

상기에서는 본 발명의 일 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술분야의 당업자는 이하에서 서술하는 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경 실시할 수 있을 것이다. 그러므로 변형된 실시가 기본적으로 본 발명의 특허청구범위의 구성요소를 포함한다면 모두 본 발명의 기술적 범주에 포함된다고 보아야 한다.

Claims

꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼을 혼합한 복합물을 용암해수에 침지시키는 단계;
상기 복합물이 침지된 용암해수를 일정 기간 저온 숙성시키는 단계;
상기 숙성된 복합물과 용암해수 혼합물을 여과포로 여과하여 여과물을 얻는 단계;
상기 여과물에 정제수를 가하여 혼합하고 여과포로 여과하여 염분을 제거하는 단계;
상기 염분이 제거된 복합물을 포함하는 여과물을 열풍기로 건조시켜 저온숙성 복합 추출물을 수득하는 단계; 및
상기 저온숙성 복합 추출물을 미분쇄하고 복합 추출물 질량에 대하여 일정 배수 가수하는 단계;를 포함하는 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 일정 배수 가수된 복합 추출물에 구연산을 첨가하고 펩신을 투입하여 교반하면서 효소반응 하는 단계;를 더 포함하는 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법.
제3항에 있어서,
상기 효소 처리한 복합 추출물을 필터지로 여과한 후 가열하고 재여과하는 단계;를 더 포함하는 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 재여과된 복합 추출물을 농축하고 동결건조하는 단계;를 더 포함하는 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 저온 숙성은 1℃ 내지 20℃의 온도 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물의 제조방법.
제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 의해 제조된 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물을 포함하는 항노화 화장료 조성물.
제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 의해 제조된 꿀, 회화나무, 동아씨, 오미자, 괄루근, 상백피 및 인삼 저온숙성 복합 추출물을 포함하는 자가포식 활성화용 화장료 조성물.
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