KR20190113169A

KR20190113169A - 피부 주름 개선, 보습, 항산화 및 염증 완화 효과가 증가된 진피, 후박, 현호색, 아선약의 에탄올 추출 조성물

Info

Publication number: KR20190113169A
Application number: KR1020180035488A
Authority: KR
Inventors: 백남현; 최민수; 정청일; 김석중; 권세미
Original assignee: 동화약품주식회사
Priority date: 2018-03-27
Filing date: 2018-03-27
Publication date: 2019-10-08
Also published as: KR102283047B1; WO2019190010A1

Abstract

본 발명은 진피, 후박, 현호색 및 아선약의 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 주름 개선, 피부 보습, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 조성물은 피부 주름 개선, 피부 보습, 항산화 및 항염증 효과가 매우 우수하므로, 기능성 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

피부 주름 개선, 보습, 항산화 및 염증 완화 효과가 증가된 진피, 후박, 현호색, 아선약의 에탄올 추출 조성물 {An ethanol extract composition of Citrus Unshiu Peel, Magnolia Bark, Corydalis and Gambir with improved skin wrinkles, moisturizing, antioxidant and anti-inflammatory effects}

본 발명은 진피, 후박, 현호색 및 아선약의 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 주름 개선, 피부 보습, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

피부 (skin)는 외부변화에 대한 감각기능, 체온조절기능, 외부 이물로부터 인체의 보호 등 환경변화에 대응하여 인체의 기능유지를 위한 항상성 유지역할을 하며, 표피층 (epidermis)과 진피층 (dermis)으로 구성된다. 표피층은 대부분 각질형성세포로 구성되고, 이외에 멜라닌세포, 랑게르한스세포, 부정형세포, 머켈세포가 존재하며, 외부 이물로부터 신체의 보호 및 면역 역할을 한다. 진피층은 유두진피와 망상진피로 나누어지고, 콜라겐 섬유와 탄력섬유 등의 기질 단백질로 구성되어 피부의 구조와 탄력성 유지하며, 부족하거나 손상될 경우 피부탄력이 없어지고 주름이 형성되어 늙은 피부처럼 보이게 된다. 과거에는 피부보호를 위해 보습위주의 화장품을 사용하였으나, 최근에는 단순 보습과 함께 피부의 가장 중요한 기능인 장벽기능의 회복에 관심이 집중되고 있으며, 많은 수의 피부 질환에 있어 피부 장벽기능의 이상이 동반되거나, 주요한 병인으로 인식되고 있다 (대한민국 등록특허 제10-1400264호).

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 신규한 기능성 화장료 조성물을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 진피, 후박, 현호색 및 아선약의 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 피부 주름 개선, 피부 보습, 항산화 및 항염증 효과가 매우 우수한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 진피, 후박, 현호색 및 아선약의 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 주름 개선, 피부 보습, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은, 진피, 후박, 현호색 및 아선약을 에탄올로 추출하는 단계를 포함하는, 피부 주름 개선, 피부 보습, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 진피, 후박, 현호색 및 아선약의 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 주름 개선, 피부 보습, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물이다.

본 발명에서, 용어 "진피 (Citrus Unshiu Peel)"는 운향과의 귤 (Citrus ushiu Markvich) 또는 동속근연식물의 성숙한 과피를 의미한다. 진피의 주성분은 정유, 헤스페리딘, 나리진, 루틴 등으로 구성되어 있다. 진피의 정유 성분은 소화기 자극, 소화촉진, 거담, 담분비촉진, 항균작용 등의 약리작용이 보고되어 있다.

본 발명에서, 용어 "후박 (Magnolia Bark)"은 목련과 식물인 후박나무 (Magnolia officinalis)의 줄기나 뿌리껍질을 말린 것을 의미한다. 신경보호 효과 및 신경영양 효과가 있다고 보고되어 있다.

본 발명에서, 용어 "현호색 (Corydalis)"은 양귀비과 다년생 식물로서 주로 덩이뿌리를 약용으로 사용한다. 현호색 뿌리 추출물은 진통, 진정, 진경작용, 말초혈관확장 및 항균 활성을 가지고 있는 것으로 보고되어 있다.

본 발명에서, 용어 "아선약 (Gambir)"은 꼭두서니과에 속하는 식물로 동인도에서 널리 자생하며, 지혈, 이뇨, 청열, 해독 및 혈변 등에 약효를 가지고 있으며, 동의보감에는 힘줄과 뼈가 부으면서 아픈 것을 치료하는데 사용하였으며 갓 생긴 것이나 오래된 것 모두를 낫게 한다고 기록되어 있다.

그러나 상기의 약재들을 모두 포함하는 조성물의 피부 주름 개선, 보습, 항산화 또는 염증완화 효과는 현재까지 보고된바 없다. 특히, 통상적으로 유효성분의 추출을 위해 사용되는 열수 추출방법은 정유성분인 지용성분의 추출양이 미비하고 열수로 인한 유효성분의 분해, 변성 등의 문제로 인해 보다 높은 효과를 발현하기 어렵다는 단점이 있다. 본 발명자들은 진피, 후박, 현호색 및 아선약의 에탄올 추출물이 이에 상응하는 구성을 가지는 열수 추출물에 비하여 피부 주름 개선, 피부 보습, 항산화 및 항염 효과가 현저히 우수함을 확인하였다.

본 발명에서, 용어 "추출물"은 진피, 후박, 현호색 및 아선약으로부터 추출하여 수득한 것을 모두 일컫는다. 특히, 본 발명의 추출물은 에탄올을 용매로 사용하여 수득한 것을 특징으로 하며 이는 열수 추출물 대비 우수한 효과를 갖는다. 본 발명에서 추출 과정에 사용되는 에탄올은, 예컨대 50 중량% 내지 95 중량% 에탄올일 수 있고, 구체적으로 70 중량% 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 추출물은 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함할 수 있고, 예컨대 상기 추출물은 연조엑스 (soft extract) 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 용어, "연조엑스"는 생약원료에 적당한 용매를 넣어 일정시간 추출해 얻은 추출액을 농축하여 물엿과 같은 조도로 만든 것을 의미한다.

본 발명에서 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 상기 에탄올 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위하여 추출물을 여과시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 면, 나일론, 규조토 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

추출액의 농축에는 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다. 농축 후 건조 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 또는 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가로 포함하거나 또는 건조 단계를 생략하고 농축액을 살균하여 연조엑스 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 70 중량%의 에탄올을 사용하여 진피, 후박, 현호색 및 아선약을 혼합, 상온침지, 추출액 분리/여과, 감압 농축 및 살균하는 공정을 통해 에탄올 추출 연조엑스를 제조하였다 (도 1).

본 발명의 화장료 조성물은 진피, 후박, 현호색 및 아선약의 에탄올 추출물을 0.1 중량% 내지 10 중량%로 포함하는 것일 수 있으나, 사용하고자 하는 목적, 적용 빈도, 사용량, 용법, 제형 등에 따라 함량은 당업자에 의해 적절히 변경될 수 있으며, 피부 주름 개선, 피부 보습, 항산화 또는 항염증 효과를 나타낼 수 있는 적절한 양으로 포함될 수 있다. 일례로, 본 발명의 일 실시예에서와 같이, 진피, 후박, 현호색 및 아선약의 에탄올 추출물을 1 중량%로 포함하는 화장품 혼합물을 제조한 뒤 (실시예 2), 상기 화장품 혼합물을 용매, 부형제 등과 혼합하여 0.1 내지 10 %(v/v)의 농도로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기한 진피, 후박, 현호색 및 아선약의 에탄올 추출물 외에도 필요에 따라 본 발명의 효과를 저하시키지 않는 범위 내에서 피부 외용제에 일반적으로 사용하는 각종 성분, 예를 들면 수용성 성분, 분말 성분, 유분, 계면활성제, 보습제, 점도 조절제, 방부제, 산화방지제, 향료, 색소 등을 배합하여 구성될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물의 제형은 임의로 선택할 수 있으며, 유효성분인 진피, 후박, 현호색 및 아선약의 에탄올 추출물과 함께, 물, 생리식염수, 글리세롤, 유분, 계면활성제, 보습제, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제 및 향료 등과 같은 기 공지된 화장료용 부형제가 혼합되어 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이 형태를 이루는 화장료 조성물이 형성될 수 있다. 상기 화장료 조성물을 사용하여 유연 화장수, 밀크로션, 영양크림, 맛사지 크림, 에센스, 클렌싱 폼, 클렌싱 워터, 팩 또는 바디오일 등의 기초 화장료 및 파운데이션, 립스틱, 마스카라 또는 메이크업 베이스 등의 색조 화장료를 제조할 수 있으며, 또한 세안제 및 목욕제를 제조할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 진피, 후박, 현호색 및 아선약의 에탄올 추출 연조엑스를 제조하고, 이를 부틸렌글라이콜 및 정제수와 함께 1 중량%의 화장품 혼합물로 제조하였다 (실시예 2).

상기 실시예 2에서 제조된 화장품 혼합물은, 열수 추출물인 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물에 비하여 콜라겐이 높게 발현되어 효과가 더 우수한 것을 확인하였다 (도 3). 콜라겐은 피부 및 근육 등을 지탱하는데 중요한 역할을 하며 피부 주름의 원인이 되는 피부 속 진피층의 중요한 구성요소이므로, 상기 결과는 본 발명의 화장료 조성물이 피부 주름 개선에 우수한 효과가 있음을 보여준다.

본 발명의 또 다른 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 화장료 조성물의 보습 효능을 확인하기 위해 피부 세포 내에서 HAS-2 및 필라그린 (filaggrin)의 발현을 확인하였다. 그 결과 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물에 비해 HAS-2 및 필라그린의 발현이 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명의 화장료 조성물이 피부 보습에 우수한 효과가 있음을 확인하였다 (도 4 및 도 5).

본 발명의 또 다른 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 화장료 조성물의 항산화 효능을 확인하기 위해 SOD-2의 발현을 확인하였다. 그 결과 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물에 비해 SOD-2의 발현이 증가하는 것을 확인하여, 본 발명의 화장료 조성물이 우수한 항산화 효과를 가진다는 것을 확인하였다 (도 6).

본 발명의 또 다른 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 화장료 조성물의 염증 완화 효과 확인을 위해서 TNF-α의 발현을 확인하였다. 그 결과 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물에 비해 대표적인 염증 유발 인자인 TNF-α의 발현이 감소되어 염증반응에 효과가 있음을 확인하였다 (도 7).

상기의 결과를 토대로, 본 발명의 화장료 조성물은 다양한 유전자의 발현에 관여함으로써 피부 주름 개선, 피부 보습, 항산화 및 항염증에 우수한 효과를 가진다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명은 피부 주름 개선, 피부 보습, 항산화 및 항염증 효과가 증가된 기능성 화장품 원료로 사용하여 다양한 제품군에 적용할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 진피, 후박, 현호색 및 아선약을 에탄올로 추출하는 단계를 포함하는, 피부 주름 개선, 피부 보습, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물의 제조 방법이다.

진피, 후박, 현호색 및 아선약 에탄올 추출물을 포함하는 화장료 조성물, 상기 조성물의 피부 주름 개선, 피부 보습, 항산화 또는 항염증 용도 및 상기 조성물의 제조 방법에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 제조 방법은 여과, 농축 및 살균 공정을 추가적으로 더 포함할 수 있다.

일례로, 본 발명의 화장료 조성물은 절단 건조된 진피, 후박, 현호색, 아선약을 에탄올이 포함된 교반조에서 3 일간 상온 침지하는 1 단계; 침지액을 분리하고 1 ㎛ 내지 5 ㎛의 필터 및 규조토로 여과하는 2 단계; 60 ℃이하의 감압농축으로 건조감량 38 %이하로 농축하는 3 단계; 및 2 회에 걸쳐 85 ℃에서 40 분간 살균하는 4 단계로 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 진피, 후박, 현호색 및 아선약의 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 주름 개선, 피부 보습, 항산화 및 항염증 효과가 매우 우수하므로, 기능성 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명 실시예 1의 에탄올 추출물 및 실시예 2의 화장품 혼합물의 제조공정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물 각각이 0.5 % 내지 50 %로 혼합된 배지에서 HDFa의 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물 각각이 0.1 % 내지 1 %로 혼합된 배지에서 HDFa의 콜라겐 발현을 나타낸 것이다 (AD : Adenoisine 0.01 %).
도 4는 본 발명의 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물 각각이 0.1 % 내지 1%로 혼합된 배지에서 HDFa의 HAS-2 발현을 나타낸 것이다 (HA : Hyaluronic Acid 0.01 %).
도 5는 본 발명의 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물 각각이 0.5 % 내지 1 %로 혼합된 배지에서 HaCaT의 필라그린 발현을 나타낸 것이다 (HA : Hyaluronic Acid 0.01%).
도 6은 본 발명의 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물 각각이 1 %로 혼합된 배지에서 HaCaT의 SOD-2 발현을 나타낸 것이다 (BHT : Butylated hydroxytoluence 10 μM).
도 7은 본 발명의 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물 각각이 0.1% 내지 1%로 혼합된 배지에서 UV에 의한 손상된 HaCaT의 TNF-α 발현을 나타낸 것이다 (HC : Hydroquinone 10 μM).

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 에탄올 추출 연조엑스의 제조

본 발명의 실시예는 70 중량%의 에탄올을 사용하여 진피, 후박, 현호색 및 아선약을 혼합, 상온침지, 추출액분리/여과, 감압농축 및 살균하는 공정으로 구성된다 (도 1).

1 단계: 물 316 kg 및 에탄올 740 kg (에탄올 70 중량%)이 포함된 교반조에 세절된 진피 129.31 kg, 후박 25.86 kg, 현호색 93.11 kg 및 아선약 51.73 kg을 넣고 교반하였다.

2 단계: 상기 1 단계의 진피, 후박, 현호색 및 아선약의 유효성분이 70 중량%의 에탄올 용매에서 추출될 수 있도록 상온에서 3 일간 침지하였다.

3 단계: 상기 2 단계의 침지혼합물 중 추출액을 분리하고, 1 ㎛ 여과필터와 규조토로 필터하여 미세고형분이 제거된 추출액으로 분리하였다.

4 단계: 상기 3 단계에서 고형분이 분리된 추출액은 60 ℃에서 건조감량이 38 중량% 이하가 될 수 있도록 감압농축하여 연조엑스로 제조하였다.

5 단계: 1 단계에서 4 단계의 과정 중 발생할 수 있는 미생물의 멸균을 위하여 상기 4 단계의 감압농축액을 85 ℃에서 40 분간 살균하고, 이 과정을 2 회 반복하여 에탄올 추출 연조엑스로 제조하였다.

실시예 2: 화장품 혼합물의 제조

상기 실시예 1의 에탄올 추출 연조엑스 1 kg을 부틸렌글라이콜 50 kg 및 정제수 49 kg과 혼합하여 1 중량%의 화장품 혼합물로 제조하였다.

비교예 1: 열수 추출 연조엑스의 제조

1 단계: 교반조에 물 100 kg을 넣고 세절된 진피 129.31 kg, 후박 25.86 kg, 현호색 93.11 kg 및 아선약 51.73 kg을 넣었다.

2 단계: 상기 1 단계의 진피, 후박, 현호색 및 아선약의 유효성분이 추출될 수 있도록 100 ℃로 가온하여 1 시간 동안 순환 추출하였다.

상기 실시예 1의 3 단계 ~ 5 단계와 동일하게 추출액의 분리/여과, 농축, 살균과정을 통하여 열수 추출 연조엑스로 제조하였다.

비교예 2: 화장품 혼합물의 제조

상기 실시예 2와 동일한 공정으로 비교예 2의 열수 추출 연조엑스 1 kg을 부틸렌글라이콜 50 kg 및 정제수 49 kg과 혼합하여 1 중량%의 화장품 혼합물로 제조하였다.

실험예 1: 화장품 혼합물의 세포 독성 확인

상기 실시예 2와 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물의　세포 독성 실험을 살아있는 세포의 미토콘드리아 활성을 측정하여 세포 생존율을 확인할 수 있는 MTT-ASSAY를 수행하여 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

[시험방법]

HDFa (human dermal fibroblast)를 96-웰 플레이트에 5 Х 10⁵ 개의 세포/웰로 분주한 다음, 37 ℃, 5 % CO₂ 세포 배양 조건에서 18 시간 배양하였다. 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물을 각각 0.5 % 내지 50 % (v/v)의 농도로 혼합한 새로운 배지로 교체한 뒤, 18 시간 동안 배양하였다. 18 시간 이후, MTT ASSAY를 수행하여 세포 생존율을 확인하였다.

[시험결과]

본 발명의 실시예 2에서 제조된 화장품 혼합물은 0.5 % 내지 1 % 범위에서 세포 생존율이 동일 농도의 비교예 2 보다 우수함을 확인하였다 (도 2).

실험예 2: 화장품 혼합물의 콜라겐 발현 효과 확인

세포외기질의 주요 구성 성분인 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로 프로콜라겐 (procollagen)이라는 전구 물질의 형태로 합성된다. 콜라겐은 피부, 근육 등 몸 전체를 지탱하고 유지하는데 필수적인 성분으로, 특히 주름의 원인이 되는 피부 속 진피층의 중요한 구성요소이다.

따라서 HDFa (human dermal fibroblast)에 본 발명의 실시예 2와 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물을 처리하여 콜라겐의 발현 정도를 확인하였고, 그 결과를 도 3과 같이 나타내었다.

[시험방법]

먼저, HDFa (human dermal fibroblast)를 사용하여 37 ℃, 5 % CO₂를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물을 각각 0.1 % 내지 1 %의 농도로 혼합하고, 새로운 배지를 넣어 48 시간 동안 배양하였다. 48 시간 후, 상기 배양된 세포로부터 RNA를 추출하여 콜라겐 유전자 (COL1A1; Collagen type 1 alpha 1 chain)에 대한 RT-PCR을 진행하고, 증폭된 유전자는 겔 다큐멘테이션 시스템 (Gel documentation system)을 이용하여 분석하였다. COL1A1 유전자에 대한 프라이머 서열은 다음과 같다.

COL1A1 정방향 프라이머: 5'-GGC CCA GAA GAA CTG GTA CA-3' (서열번호 1)

COL1A1 역방향 프라이머: 5'-CGC TGT TCT TGC AGT GGT AG-3' (서열번호 2)

[시험결과]

본 발명의 실시예 2에서 제조된 화장품 혼합물은 비처리군 (0 %) 및 동일 농도의 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물보다 콜라겐의 발현을 더 증가시키는 것을 확인하였다 (도 3). 따라서, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 보습에 우수한 효과를 가진다.

실험예 3: 화장품 혼합물의 HAS-2 발현 효과 확인

히알루론산 (Hyaluronic acid, HA)은 탄수화물 형태의 성분으로 진피층 내에서 수분과 결합하여 세포가 정상적으로 활동할 수 있는 환경을 조성하는 중요한 역할을 하는 물질이다. HA의 합성은 HAS (hyaluronan synthase)에 의해 진행되며 HAS의 유전자는 HAS-1, HAS-2, HAS-3의 세 가지 형태가 보고되었는데, 그 중 HAS-2는 섬유아세포에서 HA의 합성에 결정적인 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다.

따라서 HDFa (human dermal fibroblast)에 본 발명의 실시예 2와 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물을 각각 처리하여 인간 섬유아세포 내 HAS-2의 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

[시험방법]

먼저 HDFa (human dermal fibroblast)는 37 ℃, 5 % CO₂를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물을 0.1 % 내지 1 %의 농도로 혼합하고, 새로운 배지를 넣어 48 시간 동안 배양하였다. 48 시간 후, 상기 배양된 세포로부터 RNA를 추출하여 HAS-2 유전자에 대한 RT-PCR을 진행하고, 증폭된 유전자는 겔 다큐멘테이션 시스템을 이용하여 분석하였다. HAS-2 유전자에 대한 프라이머 서열은 다음과 같다.

HAS-2 정방향 프라이머: 5'-GCT ACC AGT TTA TCC AAA CG-3' (서열번호 3)

HAS-2 역방향 프라이머: 5'-GTG ACT CAT CTG TCT CAC CG-3' (서열번호 4)

[시험결과]

본 발명의 실시예 2에서 제조된 화장품 혼합물은 비처리군 (0 %) 및 동일 농도의 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물보다 HA의 합성에 결정적인 역할을 하는 HAS-2의 발현을 증가시킨다는 것을 확인하였다 (도 4). 따라서, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 보습에 우수한 효과를 가진다.

실험예 4: 화장품 혼합물의 필라그린 발현 효과 확인

피부장벽을 구성하는 핵심 단백질로는 필라그린 (Filaggrin), 로리크린 (Loricrin) 및 인볼루크린 (Involucrin)이 알려져 있다. 이중 필라그린은 표피의 과립세포에 존재하는 KG (keratohyaline granule)를 구성하는 프로필라그린 (profilaggrin)이 분해됨으로써 생성되는 단백질로, 각질형성세포 내에서 케라틴 필라멘트를 응집하여 피부장벽에서 중요한 역할을 담당한다. 또한 필라그린은 여러 분해효소들에 의해 유리아미노산으로 최종 분해되어 천연보습인자로서의 기능을 하여 표피의 수분 유지 기능에 관여한다.

따라서 HaCaT (human keratinocyte)에 본 발명의 실시예 2와 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물을 처리한 후 필라그린의 발현을 확인하여, 피부장벽형성 및 천연보습 인자로서의 효과를 확인하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

[시험방법]

먼저 HaCaT (human keratinocyte)은 37 ℃, 5 % CO₂를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물을 각각 0.5 % 내지 1 %의 농도로 혼합하고, 새로운 배지를 넣어 48 시간 동안 배양하였다. 48 시간 후 상기 배양된 세포로부터 RNA를 추출하여 필라그린 유전자에 대한 RT-PCR을 진행하고 증폭된 유전자는 겔 다큐멘테이션 시스템을 이용하여 분석하였다. 필라그린 유전자에 대한 프라이머 서열은 다음과 같다.

필라그린 정방향 프라이머: 5'-AGT GCA CTC AGG GGG CTC ACA-3' (서열번호 5)

필라그린 역방향 프라이머: 5'-CCG GCT TGG CCG TAA TGT GT-3' (서열번호 6)

[시험결과]

본 발명의 실시예 2에서 제조된 화장품 혼합물은 비처리군 (0 %) 및 동일 농도의 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물보다 필라그린의 발현을 증가시킨다는 것을 확인하였다 (도 5). 따라서, 본 발명의 화장료 조성물은 피부장벽형성 및 천연보습 인자로서 우수한 효과를 가진다.

실험예 5: 화장품 혼합물의 SOD-2 발현 효과 확인

활성산소는 세포막을 공격해서 세포 기능을 상실하게 만들고, 체내 신호전달체계를 망가뜨리거나 면역력을 떨어뜨려 여러 질병으로 이어지게 한다. 이러한 활성산소가 생성되면 생체 내의 방어기전으로서 SOD (superoxide dismutase), CAT (catalase), GPx (glutathione peroxidase)와 같은 항산화 효소들이 활성산소를 불활성화 시키거나 제거함으로써 항산화 작용을 하게 된다.

따라서 HaCaT (human keratinocyte)에 본 발명의 실시예 2와 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물을 처리한 후 세포 내 주요 항산화제인 SOD-2의 발현을 확인함으로써 항산화 효과를 확인하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

[시험방법]

먼저 HDFa (human dermal fibroblast)는 37 ℃, 5 % CO₂를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물을 각각 1 %의 농도로 혼합하고, 새로운 배지를 넣어 48 시간 동안 배양하였다. 48 시간 후 상기 배양된 세포로부터 RNA를 추출하여 SOD-2 유전자에 대한 RT-PCR을 진행하고 증폭된 유전자는 겔 다큐멘테이션 시스템을 이용하여 분석하였다. SOD-2 유전자에 대한 프라이머 서열은 다음과 같다.

SOD-2 정방향 프라이머: 5'-CGT CAC CGA GGA GAA GTA CC-3' (서열번호 7)

SOD-2 역방향 프라이머: 5'-CTG ATT TGG ACA AGC AGC AA-3' (서열번호 8)

[시험결과]

본 발명의 실시예 2에서 제조된 화장품 혼합물은 비처리군 (0 %) 및 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물보다 세포 내 항산화제인 SOD-2의 발현을 증가시킨다는 것을 확인하였다 (도 6). 따라서, 본 발명의 화장료 조성물은 우수한 항산화 효과를 가진다.

실험예 6: 화장품 혼합물의 TNF -α 발현 효과 확인

염증은 UV, LPS (lipopolysaccharide)와 같은 외부 자극에 의해 IL-1α, NF-κB 및 TNF-α와 같은 염증 관련 사이토카인이 과도하게 생성되면서 유발된다. 이러한 염증성 사이토카인들은 피부 각질형성 세포로부터 분비되어 피부의 염증 반응이 시작되는데 관여한다.

따라서 HaCaT (human keratinocyte)에 본 발명의 실시예 2와 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물을 처리하고, 염증반응을 유발한 후 TNF-α의 발현으로 피부염증의 증가 정도를 확인하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

[시험방법]

먼저 HaCaT (human keratinocyte)은 37 ℃, 5 % CO₂를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물을 0.1 % 내지 1 %의 농도로 혼합하고, 새로운 배지를 넣어 48 시간 동안 배양하였다. 이후 사용된 배지를 제거하고 새 배지로 교체한 뒤, 10 분 동안 20 mJ/cm²의 UV를 조사하여 세포 손상을 유도하였다. 손상된 세포는 새 배지로 교체 후 1 일간 추가 배양한 다음, 상기 배양된 세포로부터 RNA를 추출하고 TNF-α 유전자에 대한 RT-PCR을 진행하였다. RT-PCR을 통해 증폭된 유전자는 겔 다큐멘테이션 시스템을 이용하여 분석하였다. TNF-α 유전자에 대한 프라이머 서열은 다음과 같다.

TNF-α 정방향 프라이머: 5'-CAT TCT GGG AGG GGT CTT CC-3' (서열번호 9)

TNF-α 역방향 프라이머: 5'-GGT TGA GGG TGT CTG AAG GA-3' (서열번호 10)

[시험결과]

본 발명의 실시예 2에서 제조된 화장품 혼합물 0.1 % 내지 1 %는 비처리군 (0 %) 및 동일 농도의 비교예 2에서 제조된 화장품 혼합물보다 TNF-α의 발현을 감소시킨다는 것을 확인하였다 (도 7). 따라서, 본 발명의 화장료 조성물은 피부의 염증반응을 억제하는 우수한 효과를 가진다.

결론적으로 본 발명의 진피, 후박, 현호색 및 아선약을 포함하는 에탄올 추출물은 다양한 유전자의 발현에 관여함으로써, 주름 개선, 보습, 항산화 및 염증 완화에 우수한 효과를 가지는 기능성 화장품의 유효성분으로 활용이 가능하다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> DONG WHA PHARM. CO., LTD. <120> An ethanol extract composition of Citrus Unshiu Peel, Magnolia Bark, Corydalis and Gambir with improved skin wrinkles, moisturizing, antioxidant and anti-inflammatory effects <130> P17-183-DHWA <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1 primer F <400> 1 ggcccagaag aactggtaca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1 primer R <400> 2 cgctgttctt gcagtggtag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAS-2 primer F <400> 3 gctaccagtt tatccaaacg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAS-2 primer R <400> 4 gtgactcatc tgtctcaccg 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Filaggrin primer F <400> 5 agtgcactca gggggctcac a 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Filaggrin primer R <400> 6 ccggcttggc cgtaatgtgt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD-2 primer F <400> 7 cgtcaccgag gagaagtacc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD-2 primer R <400> 8 ctgatttgga caagcagcaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha primer F <400> 9 cattctggga ggggtcttcc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha primer R <400> 10 ggttgagggt gtctgaagga 20

Claims

진피, 후박, 현호색 및 아선약의 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 주름 개선, 피부 보습, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 에탄올은 50 중량% 내지 95 중량% 에탄올인 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 에탄올 추출물은 연조엑스 (soft extract)인 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 진피, 후박, 현호색 및 아선약의 에탄올 추출물을 0.1 중량% 내지 10 중량%로 포함하는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 화장료용 부형제를 추가로 포함하는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택된 제형을 갖는 것인, 화장료 조성물.
진피, 후박, 현호색 및 아선약을 에탄올로 추출하는 단계를 포함하는, 피부 주름 개선, 피부 보습, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물의 제조 방법.
제7항에 있어서, 여과, 농축 및 살균 공정으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 공정을 추가로 더 포함하는 것인, 화장료 조성물의 제조 방법.