DE102011000471A1

DE102011000471A1 - Kosmetische Zusammensetzung

Info

Publication number: DE102011000471A1
Application number: DE102011000471A
Authority: DE
Inventors: Carine Nizard; Jean-Hubert Cauchard; Kristell Lazou; Jean-Christophe Archambault; Emmanuelle Noblesse; Frederic Bonte; Sylvianne Schnebert; Eric Perrier
Original assignee: LVMH Recherche GIE
Current assignee: LVMH Recherche GIE
Priority date: 2010-02-03
Filing date: 2011-02-02
Publication date: 2012-01-19
Also published as: JP5825793B2; IT1403806B1; JP2011157356A; FR2955770B1; KR101844598B1; GB2477631A; FR2955770A1; ITTO20110085A1; US20110262551A1; GB201101733D0; KR20110090803A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine kosmetische Zusammensetzung, die als kosmetischen Wirkstoff einen Honig aus Klee (Trifolium repens) oder einen Extrakt dieses Honigs umfaßt. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung eines Kleehonigs (Trifolium repens) oder eines Extraktes dieses Honigs als Wirkstoff in einer kosmetischen Zusammensetzung, um dem Auftreten von Anzeichen der Hautalterung vorzubeugen oder es zu verzogern oder deren Folgen zu mildern, insbesondere um die Epidermis zu restrukturieren, die Haut zu festigen und/oder die Milderung oder den Abbau von Falten oder Faltchen, insbesondere im Bereich des Gesichts und des Halses zu begünstigen. Die Erfindung betrifft auch ein kosmetisches Pflegeverfahren, das diese kosmetische Zusammensetzung verwendet.

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Honigs aus Klee (Trifolium repens) oder eines Extraktes dieses Honigs als Wirkstoff in einer kosmetischen Zusammensetzung, um dem Auftreten von Anzeichen der Hautalterung vorzubeugen oder es zu verzögern oder deren Folgen abzuschwächen, sowie eine kosmetische Zusammensetzung, die einen Wirkstoff enthalt, und ein kosmetisches Pflegeverfahren, das deren Auftragen umfallt.
STAND DER TECHNIK
Bekanntermaßen ist die Hautalterung das Resultat genetischer Faktoren, aber auch von Umweltfaktoren, wie beispielsweise der Sonnenexposition, und manifestiert sich sowohl durch molekulare, zellulare, histologische als auch klinische Veränderungen im Bereich der Epidermis und der Dermis.
Im Laufe der Alterung stellt man eine Verschlechterung der das Leben der Zelle sicherstellenden Mechanismen bis hin zur Apoptose oder „genetisch programmierter Zelltod” fest Diese Storungen führen zu einer Verringerung der Zellproliferation sowie zu einer schrittweisen Schwächung der Zellaktivität, die durch Veränderungen des Zellzyklus, wie die Oxidation, die Verschlechterung der interzellularen Kommunikation, oder aber die Bildung freier Radikale zum Ausdruck kommt.
So wird insbesondere eine Verringerung der Dicke der Epidermis und eine Abnahme der Größe der epidermalen Kämme festgestellt, die durch eine Abflachung der dermoepidermalen Junktionszone zum Ausdruck kommt, welche ihrerseits zu einer geringeren Kohärenz an der Schnittstelle von Epidermis und Dermis führt
Diese Hautatrophie kommt ebenfalls schrittweise durch Veränderungen der extrazellulären Matrix, in Verbindung mit einer Abnahme der Kollagenproduktion und der Elastinfasern der Haut, sowie dadurch zum Ausdruck, daß Proteoglykane, Glycosaminoglycane und Fibronektin seltener werden.
All diese Phänomene führen dazu, daß die Haut zerbrechlicher ist, was mit einer Verschlechterung ihrer Schutz- und Barrierefunktionen, insbesondere gegenüber Umweltstreß, dem sie ausgesetzt ist, sowie ihrer mechanischen Eigenschaften (Elastizitätsverlust, der die Ausdrucksfalten stärker sichtbar macht) verbunden ist.
Wiederholter mechanischer Streß fuhrt auch zu Veränderungen der Genexpression, woher beispielsweise die Überaktivierung der Metalloproteinasen rührt, die die Hautalterung durch lokale Verringerung von Materie verstärken, wodurch es zu einer Vertiefung der Falte und zum Festigkeitsverlust kommt.
Im Gegensatz ist die Wundheilung ihrerseits ein Gewebereparaturprozeß insbesondere der Dermis und der Epidermis, der zu einer neuen Epithelisierung der Wunde führt
Dieser Prozeß umfaßt mehrere Stufen.

– eine Gewebereparaturphase, die der Migration und der Proliferation der Fibroblasten, unter dem Einfluß von Zytokinen, darunter TGF-beta (Transforming growth factor-beta), und der Synthese einer neuen, aus Kollagen, Fibronektinen und Proteoglykanen bestehenden extrazellulären Matrix entspricht,
– eine Phase der Epithelisierung der Wunde, die die Migration von Epithelzellen (Keratinozyten), anschließend deren Differenzierung für die Neubildung der Epidermis umfallt.

Die Aktivitat von Honig bei der Versorgung von Verbrennungen, oberflächlichen Verletzungen oder Geschwuren ist bekannt.
Honig ermöglicht eine schnelle und saubere Ausheilung von Wunden sowie das schnelle Ersetzen der verletzten Gewebe
Er stimuliert die Bildung von Granulationsgeweben, die Entwicklung einer Neovaskularisierung und die Fibroblastenproliferation und beschleunigt somit die Epithelisierung der Wunden (Molan, Primary Intentions, 1998, Dez, 148–158; Efem, B. J. Surg., 1988, 75, 679–681).
Man kennt insbesondere die Verwendung von Thymianhonig bei der Versorgung chirurgischer Wunden (Descottes, Phytotherapie, 2009, 7, 112–116).
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Da, wie man zuvor gesehen hat, die Mechanismen der Zellproliferation und der Synthese der Strukturverbindungen der Haut im Laufe der Alterung nach und nach mangelhaft werden, ist folglich deren Stimulation eine Strategie, deren Ziel es ist, den Prozeß der Wundheilung einer geschädigten Haut nachzubilden, um die gleichen Wirkungen zu erzielen
Hauptziel der Erfindung ist die Identifikation von Wirkstoffen, die an den Wundheilungsprozessen beteiligte Targets stimulieren, um eine Zellverdichtung im Bereich der Dermis und der Epidermis sowie eine Neugestaltung der extrazellularen Matrix zu erzielen, wodurch dazu beigetragen wird, die mechanischen und funktionellen Eigenschaften der Haut zu verbessern.
Das Hauptziel der Erfindung besteht darin, einen neuen kosmetischen Wirkstoff naturlicher Herkunft, mit einem guten Wundheilungsvermögen, der die Umwelt achtet, bereitzustellen.
Ein weiteres Hauptziel der Erfindung ist es, einen neuen kostengünstigen kosmetischen Wirkstoff zu finden, der in ausreichender Menge für die Kosmetikindustrie verfügbar ist
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelderin hat entdeckt, daß Honig aus Klee (Trifolium repens) die Expression von Genen, die für die Synthese von an den Wundheilungsprozessen beteiligten Zytokinen kodieren, signifikant stimuliert und daß er ferner ermöglicht, die Proliferation der Fibroblasten im Bereich der kunstlich verletzten Dermis zu beschleunigen.
Diese Ergebnisse ermoglichen, die Verwendung dieses besonderen Wirkstoffs als kosmetischen Wirkstoff für die Stimulation der Reparaturprozesse der Oberflächengewebe der gesunden und unverletzten Haut, insbesondere der Dermis und der Epidermis in Betracht zu ziehen, um deren mechanische und funktionelle Eigenschaften wiederherzustellen
Die Verbesserung der mechanischen Eigenschaften der Haut kommt insbesondere durch eine sichtbare Milderung der Falten und Fältchen der Haut, insbesondere im Bereich des Gesichts und des Halses zum Ausdruck.
Die Anmelderin hat überraschend entdeckt, daß Kleehonig – was die Expression von Genen, die an der Synthese von Zellfaktoren beteiligt sind, welche im Laufe der Wundheilungsprozesse erzeugt werden – wirkungsvoller als Thymianhonig oder andere für ihr Wundheilungsvermogen bekannte Wirkstoffe wirkt. Er ist auch wirkungsvoller bei der Stimulation der Proliferation von Fibroblasten im Bereich der Dermis einer künstlich verletzten Haut.
Kleehonig ist somit ein besonders wirksamer Wirkstoff zur Sicherstellung des erneuten Ankurbelns der Zellaktivität, deren schrittweise Schwachung zum Elastizitätsverlust der Haut fuhrt, was die Bildung von Falten und Fältchen zur Folge hat.
Kleehonig ist im Handel in großem Maße erhaltlich
Kleehonig umfaßt hauptsächlich, in seine Masse eingebettet, Pollenkörner, deren Form und Größe für die Pflanzenart Trifolium repens charakteristisch sind.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Anmeldung betrifft somit die Verwendung eines Kleehonigs (Trifolium repens) oder eines Extraktes dieses Honigs als Wirkstoff in einer kosmetischen Zusammensetzung, um dem Auftreten von Anzeichen der Hautalterung vorzubeugen oder es zu verzögern oder deren Folgen zu mildern, insbesondere um die Epidermis zu restrukturieren, die Haut zu festigen und/oder die Milderung oder den Abbau von Falten oder Faltchen, insbesondere im Bereich des Gesichts und des Halses zu begünstigen.
Vorzugsweise wird der Kleehonig oder ein Extrakt dieses Honigs als kosmetischer Antifaltenwirkstoff verwendet.
Ein besonders bevorzugter Kleehonig ist der in Neuseeland produzierte.
Ein zweiter Gegenstand der Erfindung betrifft eine kosmetische Zusammensetzung, die als kosmetischen Wirkstoff einen Kleehonig (Trifolium repens) oder einen Extrakt dieses Honigs enthält.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine kosmetische Anti-Aging- oder Antifalten-Zusammensetzung, die als Antifalten- oder Anti-Aging-Wirkstoff einen Kleehonig (Trifolium repens) oder einen Extrakt dieses Honigs umfaßt.
Die Zusammensetzung kann auch einen oder mehrere Sortenhonig(e) anderer Pflanzen umfassen, vorzugsweise einen Sortenhonig aus Thymian (Thymus vulgaris) oder einen Honig der Manuka-Pflanze (Leptospermum scoparium) und/oder einen oder mehrere Mischblütenhonig(e) und/oder einen oder mehrere Extrakte dieser Honige und/oder ein oder mehrere Imkereiprodukte, wie Gelée Royale.
Die Herstellung eines Honigextraktes ist seitens des Fachmannes wohlbekannt.
Ein bevorzugter Extrakt wird mit Hilfe polarer Lösungsmittel erhalten.
Als polares Losungsmittel oder Gemisch polarer Losungsmittel wird vorteilhafterweise ein Lösungsmittel oder ein Gemisch von Lösungsmitteln gewählt, das (die) aus Wasser, einem C₁-C₄-Alkohol, beispielsweise Ethanol, einem C₂-C₆-Glykol, vorzugsweise ausgewählt aus Glycerin, Butylenglykol und Propylenglykol, und deren Mischungen ausgewählt ist (sind) Nach einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird die Extraktion unter Verwendung eines hydroalkoholischen oder hydroglykolischen Gemischs durchgeführt
Die Eigenschaften des Kleehonigs können in kosmetischen Zusammensetzungen erhalten oder verbessert werden, in denen er mit weiteren Wirkstoffen in Form von gereinigten Molekülen und/oder Pflanzenextrakten, deren kosmetische Wirkungen denen des Honigs ähnlich sind und/oder diese erganzen, kombiniert ist
Neben dem vorgenannten Kleehonig kann die kosmetische Zusammensetzung somit einen oder mehrere weitere kosmetische Wirkstoffe umfassen, die aus Substanzen mit einer Anti-Aging-Aktivität, Substanzen mit einer depigmentierenden Aktivität oder einer hautaufhellenden Aktivitat, Substanzen mit einer schlankmachenden Aktivitat, Substanzen mit einer hydratisierenden Aktivität, Substanzen mit einer beruhigenden, mildernden oder entspannenden Aktivität, Substanzen, welche die Mikrozirkulation der Haut stimulieren, um das Strahlen des Teints, insbesondere des Gesichts zu verbessern, Substanzen mit einer talgregulierenden Aktivitat für die Pflege fettender Haut, Substanzen, die dazu bestimmt sind, die Haut zu reinigen oder zu klären, Substanzen mit einer antiradikalischen Aktivität ausgewahlt sind
So umfaßt die kosmetische Zusammensetzung der Erfindung vorteilhafterweise eine oder mehrere weitere Substanzen, die ausgewahlt sind aus

– Molekülen, die die Zellerneuerung begünstigen, wie Vitamin A, Retinol und/oder seine Ester, Alpha- oder Beta-Hydroxysäuren, wie Fruchtsäuren, insbesondere Apfel-, Glykol- oder Zitronensaure, Salicylsäure oder ihre Ester, Gentisinsäure oder ihre Ester, insbesondere Tocopherolgentisat,
– Molekülen oder Extrakten, die die Festigkeit der Haut stimulieren, wie Peptide, die die Synthese von Kollagen stimulieren, insbesondere Kollagen Typ I, II, IV oder VII, ein Extrakt von Centella asiatica, Madecassicasaure, Asiaticasaure, ein Haferextrakt, ein Extrakt von Bertholletia excelsa, ein Proteinhydrolysat oder Sojapeptide, ein Extrakt von Potentilla erecta, ein Extrakt von Siegesbeckia orientalis, Ginsenoside oder Notoginsenoside, insbesondere Rb1, R0, ein Extrakt aus Samen von Vigna aconitifolia,
– Molekülen oder Extrakten, die die Synthese von Hyaluronsäure oder von Glycosaminoglycanen im Bereich der Epidermis oder der Dermis begünstigen, wie ein Extrakt Mamaku-Vital-Essenz, ein Extrakt aus Blättern von Cyathea medullaris, ein Extrakt von Eriobotrya japonica oder Fragmenten von Hyaluronsäure mit niedrigen Molekulargewichten oder aber einem Extrakt von Adenium obesum,
– Molekülen oder Extrakten, welche die Differenzierung der Epidermis regulieren, wie Ecdysteron, Turkesteron, Kalziumderivate, Vitamin D-Vorlaufer,
– Adenosin, Carnitin oder seinen Derivaten, insbesondere Acetyl-Carnitin, Vitamin A oder eines seiner kosmetisch verträglichen Ester, insbesondere Vitamin A-Propionat oder Vitamin A-Palmitat,
– Metalloproteinase-Inhibitoren (MMP), insbesondere MMP1-, MMP2-, MMP9-Inhibitoren, wie ein Extrakt von Ruscus asculeatus, Sojapeptiden oder Flavonoiden, wie Quercetin, Kaempferol, Apigenin, Wogonin, oder aus Pflanzenextrakten, die diese enthalten,
– Elastase-Inhibitoren, wie Pflanzenextrakte von Aspergillus fumigatus, Momordica charantia, Cucurbita maxima,
– Substanzen, welche die Synthese von Dermatopontin stimulieren, wie ein Amberextrakt,
– Molekulen oder adstringierenden Pflanzenextrakten, welche die Poren zusammenziehen, wie ein Hamamelis-Extrakt,
– Filtern, welche vor UVA- und UVB-Strahlungen schützen, wie Benzophenon, Butyl-4-methoxydibenzoylmethan, Ethylhexylmethoxycinnamat, Octocrylen, Ethylhexylsalicylat, Phenylbenzimidazol-Sulfonsaure, Homosalat, allein oder in Kombination mit Titanoxiden, Molekülen oder Pflanzenextrakten, die auf die Pigmentierung wirken, wie Kojisaure, Süßholzwurzel- oder Maulbeerbaumextrakte, Arbutin, Calciumpantothensulfonat, Boldin, Diacetylboldin, Vitamin C oder eines seiner Derivate, insbesondere Glycoside, Lilienextrakte, insbesondere aus der Zwiebel,
– antiradikalischen oder antiinflammatorischen Molekülen oder Extrakten, wie ein Extrakt von Artemisia capillaris, ein Extrakt von Sanguisorba officinalis, Resveratrol und seine Derivate, Cucurma, Curcumin oder Tetrahydrocurcumin, Polyphenolen, die aus Traubenkernen extrahiert sind, Vitamin E und seinen Derivaten, insbesondere seinen Phosphatderivaten, Ergothionein oder seinen Derivaten, Idebenon, Piceid, Stilbene oder Hydroxyphenanthrene,
– einem Extrakt aus einer Orchidee, wie einer Orchidee, die zur Gattung Brassocattleya gehört, beispielsweise ein Extrakt aus der Orchidee Brassocattleya marcella, oder zur Gattung Vanda gehört, beispielsweise ein Extrakt aus einer Orchidee wie Vanda coerulea, Vanda teres oder aber Vanda denisoniana,
– hydratisierenden Molekülen, wie Glycerin, oder natürlichen Polyolen, naturlichen oder synthetischen Ceramiden, Quell- oder Mineralwässern.

Vorteilhafterweise umfaßt die Zusammensetzung ferner wenigstens einen kosmetisch verträglichen Hilfsstoff, der aus Pigmenten, Farbstoffen, Polymeren, Tensiden, Rheologiemitteln, Duftstoffen, Elektrolyten, pH-Regulatoren, Antioxidantien, Konservierungsmitteln und ihren Mischungen ausgewählt sein kann
Die kosmetische Zusammensetzung liegt vorteilhafterweise in Form eines Serums, einer Lotion, einer Creme oder eines Hydrogels, vorzugsweise einer Maske, oder in Form eines Sticks oder eines Patches vor
Die Zusammensetzungen der Erfindung weisen eine besonders gewunschte Wirkung auf, um dem Auftreten von Anzeichen der Hautalterung vorzubeugen oder dieses zu verzögern oder deren Folgen abzuschwächen, insbesondere um die Epidermis zu restrukturieren, die Haut zu festigen und/oder um die Milderung oder den Abbau von Falten zu begünstigen.
Wie zuvor dargelegt, betrifft die vorliegende Erfindung eine Verwendung des Kleehonigs, wie er vorstehend definiert ist, als kosmetischer Wirkstoff, der dazu bestimmt ist, dem Auftreten von Anzeichen der Hautalterung vorzubeugen oder dieses zu verzögern oder deren Folgen abzuschwächen, insbesondere dazu bestimmt ist, die Epidermis zu restrukturieren, die Haut zu festigen und/oder die Milderung oder den Abbau von Falten zu begünstigen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein kosmetisches Pflegeverfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es das Auftragen eines Kleehonigs oder einer kosmetischen Zusammensetzung, wie sie vorstehend definiert ist, in einer wirkungsvollen Menge auf die betroffenen Hautbereiche umfaßt, um dem Auftreten von Anzeichen der Hautalterung vorzubeugen oder dieses zu verzögern oder deren Folgen abzuschwächen, insbesondere um die Epidermis zu restrukturieren, die Haut zu festigen und/oder um die Milderung oder den Abbau von Falten zu begünstigen.
Vorteilhafterweise erfolgt das Auftragen auf einen Hautbereich des Gesichts, des Halses oder des Korpers, insbesondere der Hande, der Alterungsanzeichen, wie das Vorliegen von Falten oder Fältchen zeigt.
Für jeden der vorgenannten Gegenstände der Erfindung wird die Konzentration des als kosmetischer Wirkstoff eingesetzten Kleehonigs zwischen 0,001 und 10 Gew.-%, insbesondere zwischen 0,01 und 5 Gew.-%, besser noch zwischen 0,1 und 3 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der kosmetischen Zusammensetzung liegen
Weitere Ziele, Merkmale sowie Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden erläuternden Beschreibung klar hervorgehen, die anhand von Beispielen für die Herstellung von Extrakten und Tests, welche die Eigenschaften der Extrakte nachweisen, sowie anhand eines Beispiels für eine kosmetische Zusammensetzung, die derartige Extrakte verwendet, erfolgt, Beispiele, die lediglich zur Veranschaulichung gegeben sind und die folglich in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken konnen
Sofern nicht anderes vermerkt, sind in den Beispielen alle Prozentangaben Gewichtsprozente, ist die Temperatur in Grad Celsius angegeben, ist der Druck der atmosphärische Druck.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1a, 1b, 2a bis 2f und 3 beziehen sich auf das nachfolgende Beispiel 1.
Die 4 bis 6 beziehen sich auf Beispiel 2.
Die 1a und 1b sind zwei Beispiele für Betrachtungen unter dem Phasenkontrastmikroskop eines gleichen künstlich „verletzten” Bereichs des Wells, in dem die normalen humanen Fibroblasten (NHF) kultiviert werden. Das Bild der 1a zeigt einen zellfreien Bereich, der der Stelle entspricht, an der sich der IBIDI Kultureinsatz befand, unmittelbar nach Herausnahme des Einsatzes. 1b zeigt den gleichen Bereich nach einer Teilrekolonisierung durch die NHF
Die 2a bis 2d zeigen die vier Schritte der Analyse von erfaßten Bildern in Blaufluoreszenz und in Rotfluoreszenz, die ermöglicht, die Kolonisierung des künstlich verletzten Bereichs des Trägers durch die Fibroblasten mit Hilfe der IBIDI Einsatze zu charakterisieren. Die 2c und 2d zeigen den unbehandelten verletzten Bereich (Negativkontrolle) nach Markieren der Zellkerne (Schritt 3 der Bildanalyse) bzw. dann nach automatischer Erfassung der Zellkerne (Schritt 4 der Bildanalyse) Die 2e und 2f zeigen den verletzten Bereich nach der Behandlung mit einem erfindungsgemäßen Kleehonig, nach Schritt 3 (2e) bzw. Schritt 4 (2f) der Bildanalyse.
3 zeigt auf der Ordinate, in Form eines Balken-Ergebnisses, die Anzahl der Zellen, die die Narbe rekolonisiert haben, pro Quadratzentimeter, die mit jedem der getesteten Produkte, der unbehandelten Kontrolle, bezeichnet mit NT, dem Handelsprodukt „Gatuline Skin Repair als positive Referenzkontrolle, dem Thymianhonig als weiteres Referenzprodukt bzw. dem erfindungsgemäßen Kleehonig erhalten wird.
4 zeigt auf der Ordinate, in Form eines Balken-Ergebnisses, das Transkript-Verhältnis des HMGB1-Gens zwischen den Zellen von behandelten normalen NHK (normale humane Keratinozyten) und den Zellen von unbehandelten, durch Beta-2-Mikroglobulin normalisierten normalen NHK, das mit jedem der getesteten Produkte, der Kontrolle, bezeichnet mit NT, dem Handelsprodukt „Gatuline Skin Repair” als positive Referenzkontrolle bzw. dem erfindungsgemäßen Kleehonig erhalten wird.
5 zeigt auf der Ordinate, in Form eines Balken-Ergebnisses, das Transkript-Verhältnis des TGF-beta-Gens zwischen den Zellen von behandelten NHF (normale humane Fibroblasten) und den Zellen von unbehandelten, durch Beta-2-Mikroglobulin normalisierten NHF, das mit jedem der getesteten Produkte, der Kontrolle, bezeichnet mit NT, dem Handelsprodukt „Gatuline Skin Repair” als positive Referenzkontrolle bzw. dem erfindungsgemäßen Kleehonig erhalten wird.
6 zeigt auf der Ordinate, in Form eines Balken-Ergebnisses, das Transkript-Verhältnis bei der Expression der beta-1,4-Galactosyltransferase-Gene, zwischen den behandelten NHF und den unbehandelten, durch Beta-2-Mikroglobulin normalisierten NHF, das mit jedem der getesteten Produkte, der Kontrolle, bezeichnet mit NT, dem Handelsprodukt „Gatuline Skin Repair” als positive Referenzkontrolle bzw. dem erfindungsgemaßen Kleehonig erhalten wird.
BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFUHRUNGSFORMEN
Beispiel 1 – Untersuchung des Kleehonigs in einem in vitro Wundheilungsmodell
Dieser Versuch stützt sich auf die Verwendung von biokompatiblen Zellkultureinsätzen, die ermöglichen, in vitro Wundheilungsphanomene quantitativ und einwandfrei reproduzierbar zu messen.
Material und Methode
1. Zellkultur
Die bei dieser Untersuchung verwendeten Zellen sind Normale Humane Fibroblasten (NHF).
Die Zellen werden in 175 cm²-Flaschen in einer Dichte von 1 Million pro Flasche in DMEM-Kulturmedium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), dem 10% fetales Kalberserum und L-Glutamin 1,3 mM zugesetzt ist, ausgesät. Erreichen die Zellen Konfluenz, werden sie trypsiniert und für den Wundheilungstest erneut ausgesat
2 Wundheilunqstest
Aussaat der Zellen
Vor dem Aussäen der Zellen werden am Boden von sechs Wells einer Platte Einsätze plaziert, die in Form von Kits und unter der Bezeichnung Culture-Insert (Ref. 80209) durch die Gesellschaft IBIDI (Deutschland) in den Handel gebracht werden. Die NHF werden in einer Menge von 20000 Zellen/cm² in DMEM-Medium, das 10% fetales Kalberserum enthält, ausgesät und für 48 Stunden kultiviert.
Wenn die Zellen Konfluenz erreicht haben, wird das Kulturmedium ausgewechselt und durch alleiniges DMEM ersetzt Das Kultivieren wird für 24 Stunden fortgesetzt.
Behandlungen
Bei dieser Untersuchung wurden zwei identische Versuche mit einem Abstand von einer Woche unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. Es werden zwei Wells für jede getestete Substanz verwendet.
Die getesteten Substanzen sind folgende:

GATULINE SKIN REPAIR (Positivkontrolle) 0,10%

Thymianhonig (Ursprung: Frankreich) 100 μg/ml

Kleehonig (Ursprung: Neuseeland) 100 μg/ml
Eine Zellkultur wird auch in alleinigem DMEM-Medium, ohne Zugabe von zu testender Substanz, in zwei Wells angelegt, um eine unbehandelte Kontrolle (NT) einzurichten.
GATULINE SKIN REPAIR ist ein durch die Gesellschaft GATTEFOSSE (Frankreich) in den Handel gebrachter hydroalkoholischer Extrakt von gemeiner Eselsdistel; es wird beschrieben, daß er eine Wirkung zum Schutz geschädigter Haut durch eine Stimulation der Expression der Marker der keratinozytären Differenzierung (ex-vivo-Test an streifenformigen Hautexplantaten) hat.
Die getesteten Wirkstoffe (Thymianhonig und Kleehonig) werden auf folgende Weise zubereitet. Es wird eine Stammlösung mit 100 mg/ml des Honigs in PBS hergestellt, die anschließend uber einem 0,22 μm-Filter sterilisiert wird Die Endverdünnung (1/1000) wird in alleinigem DMEM vorgenommen
Wundheilung
Der Kultureinsatz wird zunächst mit einer sterilen Pinzette entnommen. Unter dem Phasenkontrastmikroskop wird ein „verletzter” zellfreier Bereich an der Stelle, an der sich der Einsatz befand, betrachtet (1a).
Das Ausgangskulturmedium wird dann in jedem Well durch das Kulturmedium, das die entsprechend den vorstehend beschriebenen Bedingungen getesteten Wirkstoffe enthält, ersetzt.
Die Zellen werden im Trockenofen bei 37°C und in einer 5% CO₂ enthaltenden Atmosphäre für 16 Stunden (zuvor bestimmte optimale Meßzeit) in Kultur gehalten. Mit Hilfe einer Bildanalysetechnik wird die Intensitat der Rekolonisierung des Narbenbereichs nach den Behandlungen betrachtet (1b).
Zellmarkierungen
Nach einem Spülen mit PBS werden die Zellen für 10 Minuten mit einer 10%igen Formalinlösung fixiert, anschließend mit PBS gespült Die Zellen werden dann mit einer 0,1%igen Triton X-100-Losung für 10 Minuten permeabilisiert.
Eine Losung, die DAPI (4',6'-Diamidino-2-phenylindol), Fluoreszenzmolekül, das für die Markierung der Zellkerne verwendet wird, und Phalloidin 546, das für die Markierung des Aktin-Zytoskeletts verwendet wird, enthält, wird auf die Zellen gegeben und bei Raumtemperatur unter Lichtabschluß fur 1 Stunde inkubiert Die Zellen werden anschließend mit PBS gespült und mit einem Tropfen eines wäßrigen Eindeckmediums bedeckt
An einem Videomikroskop Nikon TE2000 werden unverzuglich Bilder in Blaufluoreszenz (Zellkerne) und Rotfluoreszenz (Aktinfilamente), 2 Fotos pro Well im Bereich des verletzten Bereichs erstellt.
Bildanalyse
Die Bildanalyse wird eingesetzt, um die Kolonisierung des künstlich „verletzten” Bereichs durch die Fibroblasten nach Entnahme des Einsatzes zu visualisieren und quantitativ zu bestimmen. Für die Analyse wird die Software Leica QWIN verwendet.
Die Analyse umfaßt die vier nachfolgenden Schritte

1 – Aufnahme eines Bildes vor der Behandlung (Zeitpunkt 0) mit Hilfe des mit der Software NIS ausgestatteten Videomikroskops NIKON TE2000 (2a). Das Bild zeigt den gestreiften, zellfreien Bereich nach Entnahme des Einsatzes.
2 – Bestimmung des Meßbereichs mit Hilfe eines Informatikwerkzeugs – gelber Bereich (2b).
3 – Aufnahme eines neuen Bildes nach den Behandlungs- und Zellkernmarkierungsschritten (2c und 2d für die Kontrolle NT und 2e und 2f für die Behandlung mit dem Honig der Erfindung): Der verletzte Bereich umfaßt Fibroblasten, die den anfangs zellfreien Bereich rekolonisieren.
4 – Automatisches Selektieren der markierten Zellkerne in dem bei Schritt 2 definierten Bereich und Zahlen der markierten Zellkerne (2d und 2f).

Man berechnet die Anzahl von Zellen, die den verletzten Bereich rekolonisiert haben, pro Flächeneinheit (cm²) Die Messung wird an 4 Bildern durch getestete Wirkstoffe reproduziert.
3. Ergebnisse
Die Wirkung eines jeden der getesteten Wirkstoffe auf die Rekolonisierung der Narbe ist in 3 aufgezeigt.
In dieser Figur zeigt sich klar, daß der Kleehonig eine signifikante Aktivität hinsichtlich der Rekolonisierung des verletzten Bereichs durch die Fibroblasten hat, in gleichem Grad wie Gatuline Skin Repair (Positivkontrolle). Der Kleehonig erzeugt hingegen selbst eine Wirkung, die weit uber der des Thymianhonigs liegt, dessen wunderheilende Wirkung wohlbekannt ist; dies stellt ein unerwartetes Ergebnis dar.
Dies rechtfertigt die Wahl des Kleehonigs als besonders wirksamer kosmetischer Wirkstoff, um dem Auftreten von Anzeichen der Hautalterung vorzubeugen oder es zu verzogern oder deren Folgen abzuschwächen.
Beispiel 2 – Wirkung des Honigs auf die Expression von Genen, die für Marker der Wundheilung kodieren.
Ziel dieser Untersuchung ist es, die Modulation der Expression von drei Genen, die für an dem Wundheilungsprozeß beteiligte Proteine kodieren, durch eine den Kleehonig umfassende Behandlung zu bewerten
Die ausgewahlten Gene sind folgende:

• HMGB1 (High Mobility Group Box 1) Dieses Gen kodiert fur ein multifunktionales Zytokin, das an der inflammatorischen Antwort und der Wundheilung beteiligt ist. Ein hohes Expressionsniveau dieses Proteins spiegelt eine Wundheilung von guter Qualitat wider (Straino et al, J. Invest. Dermatol. 2008 Jun; 128(6): 1545–53).
• beta-1,4-Galactosyltransferase. Dieses Gen kodiert für eine Galactosyltransferase, die an der Kollagenablagerung, ein grundlegendes Element bei der Wundheilung, beteiligt ist (Shen et al, Am J Dermatopathol, 2008 Feb; 30(1) 10-5).
• TGF-beta: Dieses Gen spielt eine zentrale Rolle beim gesamten Wundheilungsprozeß (Wang XJ et al., J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2006 Sep; 11(1): 112–7)

Man untersucht den Einfluß eines jeden Wirkstoffs auf die Expression der vorgenannten Gene mit Hilfe der quantitativen PCR-Technologie, nach einer Phase der Behandlung von normalen humanen Keratinozyten (NHK) oder normalen humanen dermalen Fibroblasten (NHF) mit dem erfindungsgemäßen Wirkstoff.
1 Zellkultur
Die Hautzellen (Keratinozyten oder Fibroblasten) werden bis zur Verwendung in in flussigen Stickstoff (–180°C) getauchten Kryorohrchen konserviert. Nach dem Auftauen bei 37°C wird der Inhalt eines jeden Kloröhrchens aufgenommen, anschließend zentrifugiert (fur 5 Minuten bei 150 g bei Raumtemperatur).
Der Zellrückstand wird in 10 ml eines jedem Zelltyp angepaßten Kulturmediums aufgenommen, dann in eine 75 cm²-Flasche ausgesät.
Die Zusammensetzung dieser Medien ist folgende:

Medium A, für die Keratinozytenkultur ausgelegt KSFM (Invitrogen) + Hypophysenextrakte (Invitrogen) 50 μg/ml
Medium B, für die Fibroblastenkultur ausgelegt DMEM (Invitrogen) + fetales Kälberserum (Biowest) 10% v/v

Bei Konfluenz werden die Zellen (Keratinozyten oder Fibroblasten) durch ein Trypsin/EDTA-Medium (1 ml Trypsin 0,5% und 0,2 g/L EDTA) für einige Minuten bei 37°C vom Kulturträger abgelöst. Nach der Neutralisierung der Wirkung des Trypsin und erneutem Zentrifugieren wird jeder Zellrückstand in 1 mL des Mediums A (NHK) oder des Mediums B (NHF) aufgenommen.
2. Behandlungen
Die Zellen (NHK oder NHF) werden in Petrischalen mit einem Durchmesser von 35 mm in einer Dichte von 2,5.10⁵ Zellen/Schale in ihrem jeweiligen Medium ausgesät. Das Kulturmedium der NHF (Medium B) wird 24 Stunden vor der Behandlungsphase durch alleiniges DMEM-Medium ersetzt.
Pro Kulturbedingung werden zwei Schalen besät, also 2 Schalen für jede getestete Substanz und 2 Schalen, die mit dem Kulturmedium (unbehandelte Kontrolle) besät werden, falls dies erforderlich ist. Getestete Substanzen (Verdünnung im Kulturmedium)

– Kleehonig 100 μg/mL

– GATULINE SKIN REPAIR (Positivkontrolle) 0,01%
Nach 24-ständiger Behandlung werden die Zellen geerntet, um hieraus die Gesamt-RNA zu extrahieren.
3. Erhalt der Gesamt-RNA mit Hilfe des Extraktors EZ1 (Qiagen)
Das Kulturmedium der Zellen wird entfernt, anschließend werden 500 μL Qiazol (im Kit geliefert) zugegeben. Das Zelllysat wird in einem 1,5 mL-Rohrchen aufgenommen. Die Gesamt-RNA werden nach dem Protokoll des Lieferanten extrahiert.
Die erhaltenen Gesamt-RNA-Losungen werden quantitativ bestimmt, und ihre Qualitat wird mit Hilfe des Bioanalyzers 2100 (Agilent Technologies) gepruft, der mit einem Computer verbunden ist, auf dem sich die spezifische Software zur Analyse der Ergebnisse (Expertensoftware 2100) befindet. Die Technik erfordert eine 12-Well-Mikroplatte (RNA 6000 NanoChips) sowie einen Kit von Reagenzien (RNA 6000 Nano Reagents & Supplies), speziell für die quantitative Bestimmung der eukaryotischen Gesamt-RNA.
4. Synthese der komplementären DNA
Der verwendete Kot fur Reverse Transkription (RT) ist der High capacity cDNA archive Kit. Er wurde nach dem gelieferten Protokoll verwendet. 100 ng Gesamt-RNA, nach DNAse, werden für ein Endvolumen von 25 μL in Wasser verdünnt. Anschließend werden sie fur 10 Minuten bei 25°C, dann für 2 Stunden bei 37°C mit 25 μL eines zuvor – wie nachstehend angegeben – zubereiteten Reaktionsgemischs High capacity cDNA archive kit 2X inkubiert Reaktionsgemisch High capacity cDNA archive kit 2X fur 1 Reaktion

RT buffer 5 μL

dNTP buffer 2 μL

Random Primer 5 μL

RNAse out 0,5 μL

RT 2,5 μL

H₂O 10 μL
5. Quantitative Real time RT-PCR
Die Wirkung der unterschiedlichen Behandlungen wird mittels quantitativer Real time PCR mit dem 7900HT Fast-96 Well-Block (Applied Biosystems) ausgewertet. Zubereitung des Reaktionsgemischs High für 1 Reaktion:

TaqMan Fast universal PCR master mix (2x) 10 μL

Tag Man gene expression assay 1 μL

H₂O 4 μL
Die 15 μL des Gemischs werden in die Wells einer speziell für den 7900HT-Apparat konzipierten 96-Well-Platte gegeben, es werden 5 μL Wasser (für den Blindversuch) oder 5 μL aufeinanderfolgende cDNA-Verdünnungen (fur die Reihe) oder 5 μL 1:50 verdunnte Proben in die entsprechenden Wells zugegeben
ERGEBNISSE
– Expression des HMGB1-Gens in NHK nach 24-ständiger Behandlung
Die Transkript-Menge, die fur das HMGB1-Gen kodiert, gemessen fur eine Probe, wird auf die Transkript-Mengen bezogen, die fur das invariante Gen Beta-2-Mikroglobulin (Beta-2-m) codieren. Die erhaltenen Ergebnisse werden in Form von Histogrammen (4) verarbeitet. Die Behandlung mit dem Kleehonig erhöht die Expression des Gens um das 1,17-fache im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle, ganz im Gegensatz zur Positivkontrolle, die die Expression des Gens nicht erhöht.
– Expression des TGF-beta-Gens in NHF nach 24-stundiger Behandlung
Die Transkript-Menge, die für das TGF-beta-Gen kodiert, wird auf die Transkript-Menge bezogen, die für das invariante Gen Beta-2-Mikroglobulin (Beta-2-m) codiert Die erhaltenen Ergebnisse werden in Form von Histogrammen (5) verarbeitet. Die Behandlung der Zellen mit dem Kleehonig erhoht die Expression des untersuchten Gens um das 1,76-fache im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle. Die Positivkontrolle erhöht die Expression des untersuchten Gens ebenfalls signifikant.
– Expression des beta-1,4-Galactosyltransferase-Gens in NHF nach 24-stündiger Behandlung
Die Transkript-Menge, die für das beta-1,4-Galactosyltransferase-Gen kodiert, wird auf die Transkript-Mengen bezogen, die für das invariante Gen Beta-2-m codieren Die erhaltenen Ergebnisse werden in Form von Histogrammen (6) verarbeitet Nach der Behandlung mit dem Kleehonig wird eine 1,59-fache Erhohung der Transkript-Menge des beta-1,4-Galactosyltransferase-Gens 1 im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle festgestellt. Die Positivkontrolle ist ebenfalls signifikant aktiv.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
Der Kleehonig stimuliert die Expression der fur die Marker HMGB1, TGF-beta und beta-1,4-Galactosyltransferase kodierenden Gene signifikant.
Er begünstigt alle an der Gewebereparatur und der Wundheilung beteiligten Prozesse
Dies rechtfertigt die Wahl des Kleehonigs als besonders wirksamer kosmetischer Wirkstoff, um dem Auftreten von Anzeichen der Hautalterung vorzubeugen oder es zu verzögern oder deren Folgen abzuschwächen.
Beispiel 3 – Die Hautfestigkeit verbesserndes Anti-Aging-Serum
Es wird ein Serum hergestellt, dessen Zusammensetzung folgende ist (% ausgedrückt in Gewicht bezogen auf die Endzusammensetzung)

Kleehonig 4

Gelée Royale 0,5

Centella asiatica Heteroside 0,1

Extrakt von Malva sylvestris 0,1

Extrakt von Vigna aconitifolia 0,1

Hilfsstoffe, darunter Konservierungsmittel qs 100
Das Serum wird morgens auf das Gesicht aufgetragen, um die Festigkeit der Haut zu verbessern.
Beispiel 4 – Beruhigende Anti-Aging-Nachtcreme

Es wird eine Emulsion hergestellt, deren Zusammensetzung folgende ist (% ausgedrückt in Gewicht bezogen auf die Endzusammensetzung).

Kleehonig-Glycolysat	1
(beispielweise hydroalkoholisch (Wasser-Butylenglykol-Gemisch)
Glycerin	3
Mangobutter	2
Hyaluronsäure	1
Ergothionein	0,4
Ascorbyl Glykosid	0,4
Alpha-Tocopherol	0,2
Kalium-Glycyrrhizinat	0,05
Konservierungsmittel	qs
Hilfsmittel parfümierte Emulsion	qs 100

Die Creme wird vor dem Zubettgehen auf das Gesicht, insbesondere auf die Bereiche, die Anzeichen der Hautalterung aufweisen, aufgetragen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Molan, Primary Intentions, 1998, Dez, 148–158; Efem, B. J. Surg., 1988, 75, 679–681 [0012]
Descottes, Phytotherapie, 2009, 7, 112–116 [0013]
Straino et al, J. Invest. Dermatol. 2008 Jun; 128(6): 1545–53 [0076]
Shen et al, Am J Dermatopathol, 2008 Feb; 30(1) 10-5 [0076]
Wang XJ et al., J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2006 Sep; 11(1): 112–7 [0076]

Claims

Verwendung eines Kleehonigs der Art Trifolium repens oder eines Extraktes dieses Honigs als Wirkstoff in einer kosmetischen Zusammensetzung, um dem Auftreten von Anzeichen der Hautalterung vorzubeugen oder es zu verzogern oder deren Folgen zu mildern, insbesondere um die Epidermis zu restrukturieren, die Haut zu festigen und/oder die Milderung oder den Abbau von Falten oder Faltchen, insbesondere im Bereich des Gesichts und des Halses zu begünstigen
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er als kosmetischer Anti-Falten-Wirkstoff verwendet wird
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung zwischen 0,01 und 10 Gew.-% Kleehonig, vorzugsweise zwischen 0,01 und 5 Gew.-% Kleehonig, oder einen Extrakt dieses Honigs umfaßt
Verwendung nach einem der Anspruche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung einen oder mehrere Sortenhonig(e) anderer Pflanzen umfaßt, vorzugsweise einen Sortenhonig aus Thymian (Thymus vulgaris) oder einen Honig der Manuka-Pflanze (Leptospermum scoparium) und/oder einen oder mehrere Mischblütenhonig(e) und/oder einen oder mehrere Extrakte dieser Honige und/oder ein oder mehrere Imkereiprodukte, wie Gelée Royale.
Verwendung nach einem der Anspruche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung in Form eines Serums, einer Lotion, einer Creme oder eines Hydrogels, vorzugsweise einer Maske, oder in Form eines Sticks oder eines Patches vorliegt.
Kosmetische Zusammensetzung, die als kosmetischen Wirkstoff einen Kleehonig der Art Trifolium repens oder einen Extrakt dieses Honigs umfaßt
Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Anti-Aging- oder Anti-Falten-Zusammensetzung ist, die Kleehonig der Art Trifolium repens oder den genannten Extrakt als Anti-Falten- oder Anti-Aging-Wirkstoff umfaßt
Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie zwischen 0,01 und 10 Gew.-% Kleehonig, vorzugsweise zwischen 0,01 und 5 Gew.-% Kleehonig umfaßt.
Zusammensetzung nach einem der Anspruche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen oder mehrere Sortenhonig(e) anderer Pflanzen umfaßt, vorzugsweise einen Sortenhonig aus Thymian (Thymus vulgaris) oder einen Honig der Manuka-Pflanze (Leptospermum scoparium) und/oder einen oder mehrere Mischblütenhonig(e) und/oder einen oder mehrere Extrakte dieser Honige und/oder ein oder mehrere Imkereiprodukte, wie Gelée Royale.
Zusammensetzung nach einem der Anspruche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form eines Serums, einer Lotion, einer Creme oder eines Hydrogels, vorzugsweise einer Maske, oder in Form eines Sticks oder eines Patches vorliegt.
Kosmetisches Pflegeverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß es das Auftragen eines Kleehonigs oder einer kosmetischen Zusammensetzung, wie sie in einem der Ansprüche 6 bis 10 definiert ist, in einer wirkungsvollen Menge auf die betroffenen Hautbereiche umfaßt, um dem Auftreten von Anzeichen der Hautalterung vorzubeugen oder dieses zu verzögern oder deren Folgen abzuschwächen, insbesondere um die Epidermis zu restrukturieren, die Haut zu festigen und/oder um die Milderung oder den Abbau von Falten zu begunstigen
Kosmetisches Pflegeverfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es das Auftragen auf einen Hautbereich des Gesichts, des Halses oder der Hände, der Alterungsanzeichen, wie das Vorliegen von Falten oder Faltchen zeigt, umfaßt.