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TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
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Gegenstand der Erfindung ist eine kosmetische Zusammensetzung, die die Kombination aus Honig, oder Gelée Royale, und einem Peptid, wenigstens umfassend die Aminosäuresequenz Gly-X1-X2-Pro-Gly, umfaßt.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Bekanntermaßen ist die Hautalterung das Resultat genetischer Faktoren, aber auch von Umweltfaktoren, wie beispielsweise der Sonnenexposition, und manifestiert sich sowohl durch molekulare, zellulare, histologische als auch klinische Veränderungen im Bereich der Epidermis und der Dermis.
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Unter diesen hautalterungsbedingten Veränderungen wird eine Verringerung der Dicke der Epidermis und eine Abnahme der Größe der epidermalen Kämme festgestellt, die zu einer Abflachung der dermoepidermalen Junktionszone führt, welche einen geringeren Zusammenhalt an der Schnittstelle von Epidermis und Dermis bewirkt. Weiterhin wird eine Abnahme der Fibroblastendichte im Bereich der Dermis beobachtet.
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Diese Hautatrophie kommt ebenfalls schrittweise durch Veränderungen der extrazellulären Matrix zum Ausdruck, die mit einer Verringerung der erzeugten Kollagenmenge und mit der Tatsache verbunden sind, daß Proteoglykane, Glycosaminoglycane und Fibronektin, die Bestandteile selbiger sind, sowie die Elastinfasern der Haut seltener werden.
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Diese Phänomene führen zu einer Zerbrechlichkeit der Haut, einer Verschlechterung ihrer mechanischen und funktionellen Eigenschaften sowie ihrer Schutz- und Barrierefunktionen und schließlich zu einem Elastizitätsverlust, der die Ausdrucksfalten stärker sichtbar macht.
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Im Gegensatz ist die Wundheilung ihrerseits ein Gewebereparaturprozeß, der mehrere Stufen umfaßt, darunter eine Stufe der Reparatur der Dermis und der Epidermis, die zu einer neuen Epithelisierung der Wunde führt (Ann. Dermatol. Venereol. 2005, 132: 8549–68). Die Gewebereparaturphase entsprecht der Proliferation der Fibroblasten und der Synthese der extrazellulären Matrix. Die Phase der Epithelisierung umfaßt die Migration von Epithelzellen (Keratinozyten), anschließend deren Differenzierung zur Neubildung der Epidermis. Die extrazelluläre Matrix wird schrittweise neu gestaltet.
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Der Hauptmangel einer heilenden und sich selbst reparierenden Haut ist oftmals ihr Mangel an Plastizität und Elastizität. Dies trifft auch bei einer alternden Haut oder einer Haut, die der Sonne ausgesetzt war (Lichtalterung/Elastose), zu. Diese Eigenschaft ist aber für die biomechanischen Eigenschaften und für die Schönheit der Haut essentiell.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen kosmetischen Wirkstoffs, der insbesondere im Rahmen einer kosmetischen Zusammensetzung verwendbar und in der Lage ist, die Gewebereparaturprozesse durch Stimulieren der Fibroblasten, die sich wie wahre Beschleuniger des Hautaufbaus verhalten, zu beschleunigen, mit dem Ergebnis eines Gewebereparaturprozesses, der als ein Faktor des inneren Wachstums und Matrixumbaus für eine dichtere und elastischere Dermis wirkt.
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Ein weiteres Hauptziel der Erfindung ist die Bereitstellung einer kosmetischen Zusammensetzung, die einen solchen kosmetischen Wirkstoff enthält.
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Ein weiteres Hauptziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines kosmetischen Pflegeverfahrens, das die Anwendung eines solchen kosmetischen Wirkstoffs umfaßt.
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Die Erfinder haben zum gegenwärtigen Zeitpunkt entdeckt, daß eine Kombination aus Honig oder Gelée Royale und einem Peptid, das eine besondere Sequenz umfaßt, ermöglicht, die Gewebereparaturprozesse durch Stimulieren der Fibroblasten, die sich wie wahre Beschleuniger der Hautneubildung verhalten, zu beschleunigen.
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Die vorgenannte Kombination ermöglicht somit einen Gewebereparaturprozeß, der als ein Faktor des inneren Wachstums und Matrixumbaus für eine dichtere und elastischere Dermis wirkt.
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So betrifft ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung einen kosmetischen Wirkstoff, oder eine kosmetische Zusammensetzung, die wenigstens einen kosmetisch verträglichen Hilfsstoff umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß sie Honig oder Gelée Royale sowie ein Peptid, oder ein Derivat des Peptids, umfassend die Sequenz Gly-X1-X2-Pro-Gly, umfaßt, wobei X1 und X2 Aminosäuren, die aus den natürlichen oder synthetischen Aminosäuren ausgewählt sind, und deren Derivate sind. So betrifft die vorliegende Erfindung eine Kombination aus Honig oder Gelée Royale und einem Peptid, oder einem Derivat des Peptids, umfassend die Sequenz Gly-X1-X2-Pro-Gly, sowie eine kosmetische Zusammensetzung, die diese Kombination umfaßt.
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Das vorgenannte Peptid der Kombination umfaßt vorteilhafterweise 5 bis 8 Aminosäuren, die vorteilhafterweise aus den natürlichen oder synthetischen Aminosäuren ausgewählt sind, oder ein Derivat dieser Aminosäuren.
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X1 und X2 sind vorzugsweise aus Valin (Val), Prolin (Pro), Alanin (Ala), Glycin (Gly), Lysin (Lys), Serin (Ser), Asparginsäure (Asp), Arginin (Arg), Isoleucin (Ile) oder einem ihrer Salze oder Derivate ausgewählt.
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Unter den bevorzugten Peptiden werden diejenigen genannt, die eine Sequenz umfassen oder von einer Sequenz gebildet sind, welche ausgewählt ist aus:
Val-Gly-Lys-Ser-Pro-Gly
Ile-Gly-Lys-Ser-Pro-Gly
Pro-Gly-Gly-Val-Lys-Pro-Gly
Val-Gly-Val-Val-Pro-Gly
Ile-Gly-Lys-Gly-Pro-Gly-Gly-Val
Val-Gly-Ala-Met-Pro-Gly
Val-Gly-Ala-Ser-Pro-Gly
Val-Gly-Lys-Met-Pro-Gly
Ile-Gly-Ala-Met-Pro-Gly
Ile-Gly-Ala-Ser-Pro-Gly
Ile-Gly-Lys-Met-Pro-Gly
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly
Gly-Asp-Ser-Pro-Gly-Asp-Lys
Pro-Gly-Gly-Val-Leu-Pro-Gly
Val-Gly-Val-Val-Pro-Gly
Ile-Gly-Leu-Gly-Pro-Gly-Gly-Val
Val-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly
Ile-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly
Ile-Gly-Val-Ala-Pro-Gly
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly
Gly-Ala Ala-Pro-Gly
Gly-Val-Val-Pro-Gly
Gly-Gly-Gly-Pro-Gly
Gly-Leu-Leu-Pro-Gly
Gly-Ile-Ile-Pro-Gly
Gly-Ser-Ser-Pro-Gly
Gly-Thr-Thr-Pro-Gly
Gly-Cys-Cys-Pro-Gly
Gly-Met-Met-Pro-Gly
Gly-Phe-Phe-Pro-Gly
Gly-Tyr-Tyr-Pro-Gly
Gly-Trp-Trp-Pro-Gly
Gly-Asp-Asp-Pro-Gly
Gly-Asn-Asn-Pro-Gly
Gly-Glu-Glu-Pro-Gly
Gly-Gln-Gln-Pro-Gly
Gly-Arg-Arg-Pro-Gly
Giy-His-His-Pro-Gly
Gly-Lys-Lys-Pro-Gly
Gly-Pro-Pro-Pro-Gly
Gly-(3-Hydroxyprolin)-(3-Hydroxyprolin)-Pro-Gly
Gly-4-Hydroxyprolin-4-Hydroxyprolin-Pro-Gly
Gly-Gly-Gln-Gln-Pro-Gly-Leu
Ala-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly
Ala-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Leu
Val-Gly-Gly-Val-Pro-Gly
Leu-Gly-Thr-Ile-Pro-Gly
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Das Peptid der Kombination kann vorteilhafterweise mit wenigstens einer Fettsäure mit 2 bis 22 Kohlenstoffatomen, linear oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, hydroxyliert oder nicht, schwefelhaltig oder nicht, verestert sein.
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Nach einer bevorzugten Ausführung ist das Peptid mit einer Fettsäure mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen verestert, die vorteilhafterweise eine Palmitoyl-, Stearoyl-, Elaidoyl-, Lauroyl-, Myristoyl-, Stearoyl-, Oleoyl-, Arachin- oder Linoleoyl-Gruppe sein kann.
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Das besonders bevorzugte Peptid der Kombination ist ein Peptid, das die Sequenz Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly umfaßt oder von dieser gebildet ist, oder ein kosmetisch verträgliches Salz, wobei das Peptid ferner vorteilhafterweise mit einer Palmitoyl- oder Stearoyl-Gruppe verestert ist oder ein kosmetisch verträgliches Salz ist.
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Ein bevorzugtes Peptid ist das Palmitoyl-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly, das in Form einer hydroglykolischen Lösung unter der Handelsbezeichnung BIOPEPTIDE EL durch die Gesellschaft SEDERMA in den Handel gebracht wird.
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Der Honig kann ein Sortenhonig oder ein Mischblütenhonig sein.
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Vorzugsweise ist der Honig ein Kleehonig (Trifolium repens), ein Thymianhonig (Thymus vulgaris) oder aber ein Honig der Manuka-Pflanze (Lepfospermum scoparium).
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Der kosmetische Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung kann in eine kosmetische Zusammensetzung eingebettet werden.
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So betrefft die vorliegende Erfindung auch eine kosmetische Zusammensetzung, die einen kosmetischen Wirkstoff umfaßt, wie er vorstehend definiert ist oder wie er aus der folgenden Beschreibung hervorgeht.
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Die Konzentration an Honig oder Gelée Royale, der bzw. das als einer der beiden Bestandteile des erfindungsgemäßen kosmetischen Wirkstoffs verwendet wird, könnte im Bereich zwischen 0,001 und 10 Gew.-% bezogen auf das Gewicht das kosmetischen Wirkstoffs oder der diesen enthaltenden kosmetischen Zusammensetzung liegen. Nach einer vorteilhaften Ausführungsform kann diese Konzentration im Bereich zwischen 0,01 und 5 Gew.-% des Wirkstoffs oder der kosmetischen Zusammensetzung liegen.
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Nach einer besonderen Ausführungsform kann das vorgenannte Peptid oder Peptid-Derivat in einer Konzentration zwischen 0,001 und 5 Gew.-% des kosmetischen Wirkstoffs oder der diesen enthaltenden kosmetischen Zusammensetzung liegen. Nach einer vorteilhaften Ausführungsform kann diese Konzentration im Bereich zwischen 0,01 und 5 Gew.-% des Wirkstoffs oder der kosmetischen Zusammensetzung liegen.
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Die kosmetische Zusammensetzung der Erfindung kann neben der vorgenannten Kombination eine oder mehrere weitere Substanzen umfassen, die vorteilhafterweise ausgewählt sein können aus:
- – Molekülen, die die Zellerneuerung begünstigen, wie Vitamin A, Retinol und/oder seine Ester, Alpha- oder Beta-Hydroxysäure, wie Fruchtsäuren, insbesondere Apfelsäure, Glykolsäure oder Zitronensäure, Salicylsäure oder ihre Ester, Gentisinsäure oder ihre Ester, insbesondere Tocopherolgentisat,
- – Molekülen oder Extrakten, die die Festigkeit der Haut stimulieren, wie Peptide, die die Synthese von Kollagen stimulieren, insbesondere Kollagen Typ I, II, IV oder VII, ein Extrakt von Centella asiatica, Madecassicasäure, Asiaticasäure, Madecassosid, ein Haferextrakt, ein Extrakt von Bertholletia excelsa, ein Proteinhydrolysat oder Sojapeptide, ein Extrakt von Potentilla erecta, ein Extrakt von Siegesbeckia orientalis, Ginsenoside oder Natoginsenoside, insbesondere Rb1, R0, ein Extrakt aus Samen von Vigna aconitifolia,
- – Molekülen oder Extrakten, die die Synthese von Hyaluronsäure oder von Glycosaminoglycanen im Bereich der Epidermis und der Dermis begünstigen, wie ein Extrakt Mamaku-Vital-Essenz, ein Extrakt aus Blättern von Cyathea medullaris, ein Extrakt von Eriobotrya japonica oder kleinen Fragmenten von Hyaluronsäure mit niedrigen Molekulargewichten oder aber einem Extrakt von Adenium obesum,
- – Molekülen oder Extrakten, welche die Differenzierung der Epidermis regulieren, wie Ecdysteron, Turkesteron, Kalziumderivate, Vitamin D-Vorläufer,
- – Adenosin, Carnitin oder seinen Derivaten, insbesondere Acetyl-Carnitin, Vitamin A oder eines seiner kosmetisch verträglichen Ester, insbesondere Vitamin A-Propionat oder ein Vitamin A-Palmitat,
- – Metalloproteinase-Inhibitoren (MMP), insbesondere MMP1-, MMP2-, MMP9-Inhibitoren, wie ein Extrakt von Ruscus asculeatus, Sojapeptiden oder Flavonoiden, wie Quercetin, Kaempferol, Apigenin, Wogonin, oder aus Pflanzenextrakten, die diese enthalten,
- – Elastase-Inhibitoren, wie Pflanzenextrakte von Aspergillus fumigatus, Momordica charantia, Cucurbita maxima,
- – Substanzen, welche in der Lage sind, die Synthese von Dermatopontin zu stimulieren, wie ein Amberextrakt,
- – Molekülen oder adstringierenden Pflanzenextrakten, welche die Poren zusammenziehen, wie ein Hamamelis-Extrakt,
- – Filtern, welche vor UVA- und UVB-Strahlungen schützen, wie Benzophenon, Butyl-4-methoxydibenzoylmethan, Ethylhexylmethoxycinnamat, Octocrylen, Ethylhexylsalicylat, Phenylbenzimidazol-Sulfonsäure, Homosalat, allein oder in Kombination mit Titanoxiden,
- – Molekülen oder Pflanzenextrakten, die auf die Pigmentierung wirken, wie Kojisäure, Süßholzwurzel- oder Maulbeerbaumextrakte, Arbutin, Calciumpantothensulfonat, Boldin, Diacetylboldin, Vitamin C oder eines seiner Derivate, wie Glycoside, Lilienextrakte, insbesondere aus der Zwiebel,
- – antiradikalischen oder antiinflammatorischen Molekülen oder Extrakten, wie ein Extrakt von Artemisia capillaris, ein Extrakt von Sanguisorba officinalis, Resveratrol und seine Derivate, Cucurma, Curcumin oder Tetrahydrocurcumin, Polyphenolen, die aus Traubenkernen extrahiert sind, Vitamin E und seinen Derivaten, insbesondere seinen Phosphatderivaten, Ergothionein oder seinen Derivaten, Idebenon, Resveratrol, Piceid, Stilbene oder Hydroxyphenanthrene,
- – einem Extrakt aus einer Orchidee, wie einer Orchidee, die zur Gattung Brassocattleya gehört, beispielsweise ein Extrakt aus der Orchidee Brassocattleya marcella, oder zur Gattung Vanda gehört, beispielsweise ein Extrakt aus einer Orchidee wie Vanda coerulea, Vanda teres oder aber Vanda denisoniana,
- – hydratisierenden Molekülen, wie Glycerin, oder natürlichen Polyolen, natürlichen oder synthetischen Ceramiden, Quell- oder Mineralwässern.
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Vorteilhafterweise umfaßt die Zusammensetzung ferner wenigstens einen kosmetisch verträglichen Hilfsstoff, der aus Pigmenten, Farbstoffen, Polymeren, Tensiden, Rheologiemitteln, Duftstoffen, Elektrolyten, pH-Regulatoren, Antioxidantien, Konservierungsmitteln und ihren Mischungen ausgewählt sein kann.
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Die kosmetische Zusammensetzung kann beispielsweise ein Serum, eine Lotion, eine Creme oder aber ein Hydrogel, vorzugsweise eine Maske sein oder in Form eines Sticks oder aber eines Patches vorliegen.
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Die Extrakte und die Zusammensetzungen der Erfindung weisen eine besonders gewünschte Wirkung auf, um das Auftreten von Anzeichen der Hautalterung zu verzögern oder deren Folgen zu mildem.
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Nach einer besonderen Ausführungsvariante kann oder können die ergänzende(n) kosmetische(n) Substanz(en) in einer Konzentration zwischen 0,001 und 10 Gew.-% des kosmetischen Wirkstoffs oder der kosmetischen Zusammensetzung, insbesondere in einer Konzentration im Bereich zwischen 0,01 und 5 Gew.-% des Wirkstoffs oder der kosmetischen Zusammensetzungen enthalten sein.
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Unter einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der Kombination aus Honig oder Gelée Royale und einem Peptid, wenigstens umfassend die Aminosäuresequenz Gly-X1-X2-Pro-Gly, wobei X1 und X2 Aminosäuren sind, ausgewählt aus den natürlichen oder synthetischen Aminosäuren, wie sie vorstehend oder in der folgenden Beschreibung definiert sind, insbesondere in Form einer kosmetischen Zusammensetzung, wie sie vorstehend oder in der folgenden Beschreibung definiert ist, als kosmetischer Wirkstoff, um das Auftreten von Anzeichen der Hautalterung zu verzögern oder deren Folgen zu mildern.
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Unter einem dritten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung weiterhin ein kosmetisches Pflegeverfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es das Auftragen einer Kombination aus Honig oder Gelée Royale und einem Peptid, wenigstens umfassend die Aminosäuresequenz Gly-X1-X2-Pro-Gly, wobei X1 und X2 Aminosäuren, ausgewählt aus den natürlichen oder synthetischen Aminosäuren, und deren Derivate sind, wie sie vorstehend oder in der folgenden Beschreibung definiert sind, insbesondere in Form einer kosmetischen Zusammensetzung, wie sie vorstehend oder in der folgenden Beschreibung definiert ist, auf wenigstens einen Bereich der betroffenen Haut umfaßt, insbesondere um das Auftreten von Anzeichen der Hautalterung zu verzögern oder deren Folgen zu mildern.
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Weitere Ziele, Merkmale sowie Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden erläuternden Beschreibung klar hervorgehen, die anhand von Beispielen für die Herstellung und Tests, welche die Eigenschaften der erfindungsgemäßen kosmetischen Wirkstoffe nachweisen, sowie anhand von Beispielen für eine kosmetische Zusammensetzung, die diese verwendet, erfolgt, Beispiele, die lediglich zur Veranschaulichung gegeben sind und die folglich in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken können.
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Sofern nicht anderes vermerkt, sind in den Beispielen alle Prozentangaben Gewichtsprozente, ist die Temperatur in Grad Celsius angegeben, ist der Druck der atmosphärische Druck.
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BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Die 1a, 1b, 2a bis 2d sind Beispiele, die die Methodik veranschaulichen, die für den Nachweis der Aktivität der Kombination der Erfindung eingesetzt wird.
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Die 1a und 1b sind zwei Beispiele für Betrachtungen unter dem Phasenkontrastmikroskop eines gleichen künstlich „verletzten” Bereichs des Wells, in dem die normalen humanen Fibroblasten (NHF) kultiviert werden. Das Bild der 1a zeigt einen zellfreien Bereich, der der Stelle entspricht, an der sich der IBIDI Kultureinsatz befand, unmittelbar nach Herausnahme des Einsatzes. 1b zeigt den gleichen Bereich nach einer Teilrekolonisierung durch die NHF.
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Die 2a bis 2d zeigen die Schritte der Analyse von erfaßten Bildern in Blaufluoreszenz und in Rotfluoreszenz, die ermöglicht, die Kolonisierung des künstlich verletzten Bereichs des Trägers durch die Fibroblasten mit Hilfe der oben erwähnten Kultureinsätze zu charakterisieren.
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3 zeigt auf der Ordinate, in Form eines Balken-Ergebnisses, die Anzahl der Zellen, die die Narbe rekolonisiert haben, pro Quadratzentimeter, die mit jedem der getesteten Produkte, jeweils für die unbehandelte Kontrolle, bezeichnet mit NT, den Thymianhonig und das Peptid Pal-VGVAPG, wobei jedes alleine verwendet wird, als Positivkontrolle, und schließlich die Kombination aus dem Kleehonig und dem vorerwähnten Peptid, Kombination, die die Erfindung darstellt, erhalten wird.
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Beispiel 1: Messung der Aktivität der Kombination aus einem Honig mit einem Peptid und/oder einem Peptid-Derivat bei der Wundheilung.
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Dieser Versuch stützt sich auf ein Modell von biokompatiblen Zellkultureinsätzen, die ermöglichen, in vitro Wundheilungsphänomene quantitativ und einwandfrei reproduzierbar zu messen.
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1. Zellkultur
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Die bei dieser Untersuchung verwendeten Zellen sind Normale Humane Fibroblasten (NHF).
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Die Zellen werden in 175 cm2-Flaschen in einer Dichte von 1 Million pro Flasche in DMEM-Kulturmedium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), dem 10% fetales Kälberserum und L-Glutamin 1,3 mM zugesetzt ist, ausgesät. Erreichen die Zellen Konfluenz, werden sie trypsiniert und für den Wundheilungstest erneut ausgesät.
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2. Wundheilungstest
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Aussaat der Zellen
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Vor dem Aussäen der Zellen werden am Boden von sechs Wells einer Platte Einsätze plaziert, die in Form von Kits und unter der Bezeichnung Culture-Insert (Ref. 80209) durch die Gesellschaft IBIDI (Deutschland) in den Handel gebracht werden. Die NHF werden in einer Menge von 20000 Zellen/cm2 in DMEM-Medium, das 10% fetales Kälberserum enthält, ausgesät und für 48 Stunden kultiviert.
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Wenn die Zellen Konfluenz erreicht haben, wird das Kulturmedium ausgewechselt und durch alleiniges DMEM ersetzt. Das Kultivieren wird für 24 Stunden fortgesetzt.
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Behandlungen
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Bei dieser Untersuchung werden zwei Wells pro Behandlung (getestete Substanz) verwendet. Die getesteten Substanzen sind folgende (die angegebenen Konzentrationen sind die Endkonzentrationen:
Kleehonig | 100 μg/mL |
Pal-VGVAPG in hydroalkoholischer Lösung | 1% |
Kleehonig + Pal-VGVAPG | 100 μg/mL + 1% |
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Eine Zellkultur wird auch in alleinigem DMEM-Medium, ohne Zugabe von zu testender Substanz, in zwei Wells angelegt, um eine unbehandelte Kontrolle (NT) einzurichten.
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Das Peptid Pal-VGVAPG liegt in Form einer hydroglykolischen Lösung vor, welche durch die Gesellschaft SEDERMA unter dem Handelsnamen BIOPEPTIDE EL in den Handel gebracht wird.
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Die getesteten Wirkstoffe werden auf folgende Weise zubereitet: Es wird eine Stammlösung mit 100 mg/ml Kleehonig in PBS hergestellt, die mittels Filtration über einem 0,22 μm-Filter sterilisiert wird. Die Endverdünnung (1/1000) wird in alleinigem DMEM vorgenommen.
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Die handelsübliche Lösung BIOPEPTIDE EL wird 1/100 in dem Kulturmedium verdünnt.
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Wundheilung
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Der Kultureinsatz wird zunächst mit einer sterilen Pinzette entnommen. Unter dem Phasenkontrastmikroskop wird ein „verletzter” zellfreier Bereich an der Stelle, an der sich der Einsatz befand, betrachtet (1a).
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Das Ausgangskulturmedium wird dann in jedem Well durch das Kulturmedium, das die entsprechend den vorstehend beschriebenen Bedingungen getesteten Wirkstoffe enthält, ersetzt.
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Die Zellen werden im Trockenofen bei 37°C und in einer 5% CO2 enthaltenden Atmosphäre für 16 Stunden (zuvor bestimmte optimale Meßzeit) in Kultur gehalten. Mit Hilfe einer Bildanalysetechnik wird die Intensität der Rekolonisierung des Narbenbereichs entsprechend den Behandlungen betrachtet (1b).
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Zellmarkierungen
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Nach einem Spülen mit PBS werden die Zellen für 10 Minuten mit einer 10%igen Formalinlösung fixiert, anschließend mit PBS gespüllt. Die Zellen werden dann mit einer 0,1%igen Triton X-100-Lösung für 10 Minuten permeabilisiert.
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Eine Lösung, die DAPI (4',6'-Diamidino-2-phenylindol), Fluoreszenzmolekül, das für die Markierung der Zellkerne verwendet wird, und Phalloidin 546, das für die Markierung des Aktin-Zytoskeletts verwendet wird, enthält, wird auf die Zellen gegeben und bei Raumtemperatur unter Lichtabschluß für 1 Stunde inkubiert.
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Die Zellen werden anschließend mit PBS gespült und mit einem Tropfen eines wäßrigen Eindeckmediums bedeckt.
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An einem Videomikroskop Nikon TE2000 werden unverzüglich Bilder in Blaufluoreszenz (Zellkerne) und Rotfluoreszenz (Aktinfilamente), 2 Fotos pro Well im Bereich des verletzten Bereichs erstellt.
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Bildanalyse
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Die Bildanalyse wird eingesetzt, um die Kolonisierung des künstlich „verletzten” Bereichs durch die Fibroblasten nach Entnahme des Einsatzes zu visualisieren und quantitativ zu bestimmen. Für die Analyse wird die Software Leica QWIN verwendet.
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Die Analyse umfaßt die vier nachfolgenden Schritte:
- 1 – Aufnahme eines Bildes vor der Behandlung (Zeitpunkt 0) mit Hilfe des mit der Software NIS ausgestatteten Videomikroskops NIKON TE2000 (2a): Das Bild zeigt den gestreiften, zellfreien Bereich nach Entnahme des Einsatzes.
- 2 – Bestimmung des Meßbereichs mit Hilfe eines Informatikwerkzeugs – gelber Bereich (2b).
- 3 – Aufnahme eines neuen Bildes nach den Behandlungs- und Zellkernmarkierungsschritten (2c und 2d): Der verletzte Bereich umfaßt Fibroblasten, die den anfangs zellfreien Bereich rekolonisieren.
- 4 – Automatisches Selektieren der markierten Zellkerne in dem bei Schritt 2 definierten Bereich und Zählen der markierten Zellkerne.
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Man berechnet die Anzahl von Zellen, die den verletzten Bereich rekolonisiert haben, pro Flächeneinheit (cm2). Die Messung wird an 4 Bildern durch getestete Wirkstoffe reproduziert.
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Es sei hier angemerkt, daß die 1a, 1b, 2a und 2b nicht gemäß den Behandlungen des Beispiels 1 erhalten wurden, sondern dazu dienen, die Art der gemäß den Behandlungen des Beispiels 1 erhaltenen Fotografien zu veranschaulichen. So wurden gemäß den Behandlungen des Beispiels 1 ähnliche Fotografien wie die der 1a, 1b, 2a und 2b erhalten.
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3. ERGEBNISSE
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Die Wirkung des getesteten Honigs auf die Rekolonisierung der Verletzung ist in 3 aufgezeigt.
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Der Kleehonig (+190% gegenüber der unbehandelten Kontrolle) und das Pal-VGVAPG (+150% gegenüber der unbehandelten Kontrolle) haben eine signifikante Wirkung auf die Rekolonisierung des verletzten Bereichs. Die Kombination aus dem Kleehonig und dem Pal-VGVAPG (+224% gegenüber der unbehandelten Kontrolle) weist eine signifikant stärkere Wirkung auf als sie bei den Behandlungen mit dem Kleehonig oder mit dem Pal-VGVAPG alleine beobachtet wird. Die Kombination aus dem Honig und dem Peptid Pal-VGVAPG ermöglicht, die Wirkung eines jeden dieser beiden Wirkstoffe zu steigern, was ein unerwartetes Ergebnis darstellt.
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Dies rechtfertigt die Wahl des Kleehonigs als besonders wirksamer kosmetischer Wirkstoff, um dem Auftreten von Anzeichen der Hautalterung vorzubeugen oder es zu verzögern oder deren Folgen zu mildern
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Beispiel 2 – Erfindungsgemäße kosmetische Formulierungen
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Die nachstehenden Zusammensetzungen stellen Ausführungsbeispiele der Erfindung dar. Die Prozentsätze sind in Gewicht bezogen auf das Gewicht der Endzusammensetzung ausgedrückt. Die Hautfestigkeit verbesserndes Antifalten-Serum
Kleehonig-Extrakt | 4 |
Gelée Royale | 0,1 |
Peptid Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly | 0,3 |
Centella asiatica | 0,1 |
Extrakt von Vigna aconitifolia | 0,1 |
Parsol MCX | 3 |
Hilfsstoffe | qs 100 |
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Das Serum wird morgens auf die Bereiche des Gesichts aufgetragen, die Alterungsanzeichen aufweisen. Reparierende und beruhigende Anti-Aging-Nachtcreme
Kleehonig-Glycolysat | 3 |
Extrakt von Cyathea medullaris | 0,2 |
Mangobutter | 2 |
Turkesteron | 0,02 |
Peptid Lys-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly | 0,1 |
Peptid Asp-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ser | 0,1 |
Hyaluronsäure | 1 |
Ascorbyl Glykosid | 0,4 |
Alpha-Tocopherol | 0,2 |
Kalium-Glycyrrhizinat | 0,05 |
Hilfsmittel parfümierte Emulsion | qs 100 |
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Die Creme wird vor dem Zubettgehen auf das Gesicht aufgetragen. Reparierende Antifalten-Essenz
Peptid Palmitoyl-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly | 0,2 |
Gelée Royale | 3 |
Extrakt von Bertholletia excelsa | 0,05 |
Extrakt von Malva sylvestris | 0,02 |
Glykolsäure | 0,1 |
Alkohol | 3 |
Adenosin | 0,02 |
Hilfsstoffe | qs 100 |
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Die Zubereitung wird auf die Falten und Fältchen des Gesichts aufgetragen. Anti-Aging-Make-up
Kleehonig-Glycolysat | 0,01 |
Gelée Royale | 0,02 |
Peptid Palmitoyl-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly | 0,01 |
UVA- und UVB-Filter | 5 |
Farbiger Hilfsstoff | qs 100 |
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Die Zubereitung wird auf das Gesicht aufgetragen. Entsprechung für das Sequenzprotokoll
Sequenzen | Namen | Sequenzprotokoll |
Gly-X1-X2-Pro-Gly | Prot 1 | SEQ ID NO 1 |
Val-Gly-Lys-Ser-Pro-Gly | Prot 2 | SEQ ID NO 2 |
Ile-Gly-Lys-Ser-Pro-Gly | Prot 3 | SEQ ID NO 3 |
Pro-Gly-Gly-Val-Lys-Pro-Gly | Prot 4 | SEQ ID NO 4 |
Val-Gly-Val-Val-Pro-Gly | Prot 5 | SEQ ID NO 5 |
Ile-Gly-Lys-Gly-Pro-Gly-Gly-Val | Prot 6 | SEQ ID NO 6 |
Val-Gly-Ala-Met-Pro-Gly | Prot 7 | SEQ ID NO 7 |
Val-Gly-Ala-Ser-Pro-Gly | Prot 8 | SEQ ID NO 8 |
Val-Gly-Lys-Met-Pro-Gly | Prot 9 | SEQ ID NO 9 |
Ile-Gly-Ala-Met-Pro-Gly | Prot 10 | SEQ ID NO 10 |
Ile-Gly-Ala-Ser-Pro-Gly | Prot 11 | SEQ ID NO 11 |
Ile-Gly-Lys-Met-Pro-Gly | Prot 12 | SEQ ID NO 12 |
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly | Prot 13 | SEQ ID NO 13 |
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val | Prot 14 | SEQ ID NO 14 |
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly | Prot 15 | SEQ ID NO 15 |
Gly-Asp-Ser-Pro-Gly-Asp-Lys | Prot 16 | SEQ ID NO 16 |
Pro-Gly-Gly-Val-Leu-Pro-Gly | Prot 17 | SEQ ID NO 17 |
Val-Gly-Val-Val-Pro-Gly | Prot 18 | SEQ ID NO 18 |
Ile-Gly-Leu-Gly-Pro-Gly-Gly-Val | Prot 19 | SEQ ID NO 19 |
Val-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly | Prot 20 | SEQ ID NO 20 |
Ile-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly | Prot 21 | SEQ ID NO 21 |
Ile-Gly-Val-Ala-Pro-Gly | Prot 22 | SEQ ID NO 22 |
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly | Prot 23 | SEQ ID NO 23 |
Gly-Ala-Ala-Pro-Gly | Prot 24 | SEQ ID NO 24 |
Gly-Val-Val-Pro-Gly | Prot 25 | SEQ ID NO 25 |
Gly-Gly-Gly-Pro-Gly | Prot 26 | SEQ ID NO 26 |
Gly-Leu-Leu-Pro-Gly | Prot 27 | SEQ ID NO 27 |
Gly-Ile-Ile-Pro-Gly | Prot 28 | SEQ ID NO 28 |
Gly-Ser-Ser-Pro-Gly | Prot 29 | SEQ ID NO 29 |
Gly-Thr-Thr-Pro-Gly | Prot 30 | SEQ ID NO 30 |
Gly-Cys-Cys-Pro-Gly | Prot 31 | SEQ ID NO 31 |
Gly-Met-Met-Pro-Gly | Prot 32 | SEQ ID NO 32 |
Gly-Phe-Phe-Pro-Gly | Prot 33 | SEQ ID NO 33 |
Gly-Tyr-Tyr-Pro-Gly | Prot 34 | SEQ ID NO 34 |
Gly-Trp-Trp-Pro-Gly | Prot 35 | SEQ ID NO 35 |
Gly-Asp-Asp-Pro-Gly | Prot 36 | SEQ ID NO 36 |
Gly-Asn-Asn-Pro-Gly | Prot 37 | SEQ ID NO 37 |
Gly-Glu-Glu-Pro-Gly | Prot 38 | SEQ ID NO 38 |
Gly-Gln-Gln-Pro-Gly | Prot 39 | SEQ ID NO 39 |
Gly-Arg-Arg-Pro-Gly | Prot 40 | SEQ ID NO 40 |
Gly-His-His-Pro-Gly | Prot 41 | SEQ ID NO 41 |
Gly-Lys-Lys-Pro-Gly | Prot 42 | SEQ ID NO 42 |
Gly-Pro-Pro-Pro-Gly | Prot 43 | SEQ ID NO 43 |
Gly-(3-Hydroxyprolin)-{3-Hydroxyprolin)-Pro-Gly | Prot 44 | SEQ ID NO 44 |
Gly-4-Hydroxyprolin-4-Hydroxyprolin-Pro-Gly | Prot 45 | SEQ ID NO 45 |
Gly-Gly-Gln-Gln-Pro-Gly-Leu | Prot 46 | SEQ ID NO 46 |
Ala-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly | Prot 47 | SEQ ID NO 47 |
Ala-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Leu | Prot 48 | SEQ ID NO 48 |
Val-Gly-Gly-Val-Pro-Gly | Prot 49 | SEQ ID NO 49 |
Leu-Gly-Thr-Ile-Pro-Gly | Prot 50 | SEQ ID NO 50 |
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Ann. Dermatol. Venereol. 2005, 132: 8549–68 [0006]