JP6304854B2

JP6304854B2 - 蜂蜜及びペプチドの組み合わせを含む化粧用又は皮膚科用組成物

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Publication number: JP6304854B2
Application number: JP2011045482A
Authority: JP
Inventors: カウシャールジャン−ユベール; ボンテフレデリック; ノーブレスエマニュエル; ニザールカリーヌ
Original assignee: エルブイエムエイチレシェルシェ
Priority date: 2010-03-09
Filing date: 2011-03-02
Publication date: 2018-04-04
Anticipated expiration: 2031-03-02
Also published as: FR2957252B1; GB2479035B; DE102011001150A8; KR20110102189A; GB201103265D0; ITTO20110205A1; US20110268812A1; KR20180100505A; GB2479035A; DE102011001150A1; JP2011201872A; KR101978095B1; FR2957252A1

Description

本発明の主題は、蜂蜜又はローヤルゼリーと、少なくともＧｌｙ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｐｒｏ−Ｇｌｙのアミノ酸配列を含むペプチドとの組み合わせを含む化粧用組成物である。

よく知られているように、肌の老化は、遺伝的要因の他、例えば、日光への暴露等の環境的要因にも起因し、上皮及び真皮レベルにおいて、分子的、細胞的、組織的及び臨床的な変化を通して同時に表れる。

肌の老化に伴うこうした変化の中に入るものとして、上皮の厚み及び上皮稜のサイズの減少が観察され、後者は、真皮上皮接合部の扁平化を引き起こし、その結果、上皮及び真皮の境界の接着を弱める。真皮における線維芽細胞密度の低下も観察される。

この肌の萎縮は、コラーゲン生成量の減少や、細胞外基質の構成要素であるプロテオグリカン、グリコサミノグリカン及びフィブロネクチンの濃度、並びに肌におけるエラスチン線維の濃度の低下に結び付く前記細胞外基質の変化にも徐々に反映される。

これらの現象は、肌の脆弱性、肌の力学的及び機能的特性の障害、並びに肌の保護機能及びバリア機能の障害、最終的には、表情皺をより目立たせる弾性の喪失を招く。

逆に、治癒は、それ自体が組織修復過程であり、真皮及び上皮の修復ステップを包含し、創傷の再上皮化を起こすいくつかのステップを含む（Ａｎｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．２００５，１３２：８５４９−６８）。組織修復段階は、線維芽細胞の増殖及び細胞外基質の合成に相当する。上皮化段階は、上皮細胞（角化細胞）の移動と、その後の分化による上皮の再形成を含む。細胞外基質は、徐々に再建される。

肌が、それ自体を単独で治癒及び修復することの主な欠点は、多くはその可塑性及び弾性の欠如である。これは、老化した肌又は日光に晒した肌（光老化／弾力線維症）にも当てはまる。しかし、この特質は、肌の生体力学特性及び美しさに必須である。

発明の目的

本発明の主な目的は、化粧用組成物に関して特に使用でき、実際の肌構築促進剤として挙動する線維芽細胞を刺激することにより、組織修復過程を促進することによって、真皮の密度及び弾性を高めるために、内部成長兼基質再組織化因子として作用する組織修復過程を生じることができる、新規の化粧剤を提供することである。

本発明の別の主な目的は、そのような化粧剤を含む化粧用組成物を提供することである。

本発明の別の主な目的は、そのような化粧剤の適用を含む美容ケアの方法を提供することである。

本発明者らは、蜂蜜又はローヤルゼリーと特定の配列を含むペプチドとの組み合わせが、実際の肌構築促進剤として挙動する線維芽細胞を刺激することによって、組織修復過程の促進を可能にすることを今や発見した。

したがって、上記の組み合わせによって、真皮の密度及び弾性を高めるために、内部成長兼基質再組織化因子として作用する組織修復過程が可能となる。

（ａ及びｂ）正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＦ）が培養されているウェルの人工的「損傷」域を位相差顕微鏡で観察した２例を示す図である。図１ａの画像は、ＩＢＩＤＩカルチャーインサートを取り除いた直後の、前記インサートが置かれていた場所に相当する無細胞域を視覚化している。図１ｂは、ＮＨＦが部分的に再定着した後の同域を視覚化している。（ａ〜ｄ）上記のカルチャーインサートによる支持体の人工的損傷域の線維芽細胞の定着を特徴付けることを可能にする、青色蛍光及び赤色蛍光で取得した画像分析の各ステップを示す図である。ＮＴで示した非処置対照に対してそれぞれ試験した各製品、即ち、陽性対照として、それぞれ単独で使用したタイム蜂蜜及びＰａｌ−ＶＧＶＡＰＧペプチド、並びに最終的に、本発明を構成するクローバー蜂蜜と上記ペプチドとの組み合わせで得た、瘢痕に再定着した細胞の数／ｃｍ^２を、Ｙ軸に沿って示す棒グラフである。

したがって本発明の第１の主題は、蜂蜜又はローヤルゼリーと、Ｇｌｙ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの配列を含み、Ｘ_１及びＸ_２が、天然又は合成アミノ酸及びその誘導体から選択されるアミノ酸である、ペプチド又は前記ペプチドの誘導体とを含むことを特徴とする、化粧剤、又は少なくとも１種の化粧上許容される賦形剤を含む化粧用組成物を対象とする。したがって本発明は、蜂蜜又はローヤルゼリーと、Ｇｌｙ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの配列を含む、ペプチド又は前記ペプチドの誘導体との組み合わせ、及びこの組み合わせを含む化粧用組成物に関する。

該組み合わせの上記ペプチドは、天然若しくは合成のアミノ酸、又はこれらのアミノ酸の誘導体から有利に選択される、有利には５〜８個のアミノ酸を含む。

Ｘ_１及びＸ_２は、好ましくはバリン（Ｖａｌ）、プロリン（Ｐｒｏ）、アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、及びイソロイシン（Ｉｌｅ）、又はこれらの塩若しくは誘導体から選択される。

好ましいペプチドの中から、以下から選択される配列を含む、又は該配列によって形成されるペプチドが挙げられる。

Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−（３−ヒドロキシプロリン）−（３−ヒドロキシプロリン）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−４−ヒドロキシプロリン−４−ヒドロキシプロリン−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ。

該組み合わせのペプチドは、直鎖又は分岐、飽和又は不飽和、ヒドロキシル化又は非ヒドロキシル化、硫黄含有又は硫黄非含有の、２〜２２個の炭素原子を含む少なくとも１種の脂肪酸で有利にエステル化できる。

好ましい一実施形態によれば、ペプチドは、有利にはパルミトイル基、ステアロイル基、エライドイル基、ラウロイル基、ミリストイル基、ステアロイル基、オレオイル基、アラキジル基、又はリノレオイル基であってもよい、８〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸でエステル化されている。

該組み合わせの特に好ましいペプチドは、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの配列を含む、若しくは該配列によって形成されるペプチド、又は化粧上許容される塩であり、前記ペプチドは、パルミトイル基若しくはステアロイル基で有利にはエステル化もされており、又は化粧上許容される塩である。

好ましいペプチドは、Ｓｅｄｅｒｍａ社からＢｉｏｐｅｐｔｉｄｅＥＬの商品名で水−グリコール溶液の形態で販売されているパルミトイル−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙである。

蜂蜜は、単花蜂蜜又は多花蜂蜜であってもよい。

蜂蜜は、好ましくはクローバー（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍｒｅｐｅｎｓ）蜂蜜、タイム（Ｔｈｙｍｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）蜂蜜又は代替としてマヌカ（Ｌｅｐｔｏｓｐｅｒｎｕｍｓｃｏｐａｒｉｕｍ）蜂蜜である。

本発明による化粧剤は、化粧用組成物に組み込むことができる。

したがって、本発明は、上で規定した又は以下の説明で得られるような化粧剤を含む化粧用組成物をも対象とする。

本発明による化粧剤の２成分のうちの１つとして使用される蜂蜜又はローヤルゼリーの濃度は、化粧剤の質量又は同化粧剤を含有する化粧用組成物の質量に対して、０．００１〜１０質量％となり得よう。有利な一実施形態によれば、この濃度は、前記化粧剤又は前記化粧用組成物の０．０１〜５質量％であってもよい。

特定の一実施形態によれば、上記のペプチド又はペプチド誘導体は、化粧剤又は同化粧剤を含有する化粧用組成物の０．００１〜５質量％の濃度で含まれ得る。有利な一実施形態によれば、この濃度は、前記薬剤又は前記化粧用組成物の０．０１〜５質量％であってもよい。

本発明の化粧用組成物は、上記の組み合わせの他に、以下から有利に選択できる１種又は複数の他の物質を含むことができる。

−細胞再生を促進する分子、例えばビタミンＡ、レチノール及び／又はそのエステル、果実酸、特にリンゴ酸、グリコール酸又はクエン酸等のα又はβ−ヒドロキシ酸、サリチル酸又はそのエステル、ゲンチシン酸又はそのエステル、特にゲンチシン酸トコフェロール。

−肌の張りを刺激する分子又はエキス、例えばコラーゲン、特にＩ、ＩＩ、ＩＶ又はＶＩＩ型コラーゲンの合成を刺激するペプチド、Ｃｅｎｔｅｌｌａａｓｉａｔｉｃａエキス、マデカシン酸、アジア酸、マデカッソシド（ｍａｄｅｃａｓｓｏｓｉｄｅ）、オートムギエキス、Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａｅｘｓｃｅｌｓａエキス、大豆タンパク質又はペプチド水解物、Ｐｏｔｅｎｔｉｌｌａｅｒｅｃｔａエキス、Ｓｉｅｇｅｓｂｅｃｋｉａｏｒｉｅｎｔａｌｉｓエキス、ジンセノサイド（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）又はノトジンセノサイド（ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）、特にＲｂ１、Ｒ０、Ｖｉｇｎａａｃｏｎｉｔｉｆｏｌｉａの種のエキス。

−上皮及び真皮レベルにおけるヒアルロン酸又はグリコサミノグリカンの合成を促進する分子又はエキス、例えばＭａｍａｋｕＶｉｔａｌＥｓｓｅｎｃｅエキス、Ｃｙａｔｈｅａｍｅｄｕｌｌａｒｉｓの葉のエキス、Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａｊａｐｏｎｉｃａエキス、又は低分子量のヒアルロン酸小断片、又は代替としてＡｄｅｎｕｍｏｂｅｓｕｍエキス。

−上皮の分化を調節する分子又はエキス、例えばエクジステロン、ツルケステロン（Ｔｕｒｋｅｓｔｅｒｏｎｅ）、カルシウム誘導体、又はビタミンＤ前駆体。

−アデノシン、カルニチン又はその誘導体、特にアセチルカルニチン、ビタミンＡ又は化粧上許容されるそのエステル、特にビタミンＡプロピオン酸エステル又はビタミンＡパルミチン酸エステル。

−メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤、特にＭＭＰ１、２、９の阻害剤、例えばＲｕｓｃｕｓａｓｃｕｌｅａｔｕｓエキス、大豆ペプチド、又はケルセチン、ケンフェロール、アピゲニン、オウゴニン等のフラボノイド類、又はこれらを含有する植物エキス。

−エラスターゼ阻害剤、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ、苦瓜（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａｃｈａｒａｎｔｉａ）、又はセイヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｍａｘｉｍａ）の植物エキス。

−デルマトポンチン合成を刺激することができる物質、例えば琥珀エキス。

−孔を塞ぐ、収斂性植物の分子又はエキス、例えばマンサク（ｗｉｔｃｈｈａｚｅｌ）エキス。

−ＵＶＡ及びＵＶＢ放射線から保護するスクリーニング剤、例えば、単独又はチタン酸化物と併用する、ベンゾフェノン、４−ブチルメトキシジベンゾイルメタン、メトキシケイ皮酸エチルヘキシル、オクトクリレン、サリチル酸エチルヘキシル、フェニルベンゾイミダゾールスルホン酸、又はホモサラート。

−色素沈着に作用する植物の分子又はエキス、例えばコウジ酸、ブラックベリー又は甘草（ｌｉｑｕｏｒｉｃｅｒｏｏｔ）エキス、アルブチン、カルシウムパントテノスルホネート（ｃａｌｃｉｕｍｐａｎｔｏｔｈｅｎｏｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ）、ボルジン、ジアセチルボルジン、ビタミンＣ又はその誘導体、例えばグリコシド、ユリの特に球根のエキス。

−遊離基捕捉性又は抗炎症性の分子又はエキス、例えばＡｒｔｅｍｉｓｉａｃａｐｉｌｌａｒｉｓエキス、Ｓａｎｇｕｉｓｏｒｂａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓエキス、レスベラトロル及びその誘導体、ククルマ、ククルミン又はテトラヒドロククルミン、ブドウの種から抽出したポリフェノール、ビタミンＥ及びその誘導体、特にそのリン酸エステル誘導体、エルゴチオネイン若しくはその誘導体、イデベノン、レスベラトロル、ピセイド、スチルベン又はヒドロキシフェナントレン。

−Ｂｒａｓｓｏｃａｔｔｌｅｙａ属のラン、例えばランＢｒａｓｓｏｃａｔｔｌｅｙａｍａｒｃｅｌｌａのエキス、又はＶａｎｄａ属のラン、例えばＶａｎｄａｃｏｅｒｕｌｅａ、Ｖａｎｄａｔｅｒｅｓ若しくは代替としてＶａｎｄａｄｅｎｉｓｏｎｉａｎａから選択されるランのエキス等のランのエキス。

−保湿分子、例えばグリセロール若しくは天然ポリオール、天然若しくは合成のセラミド、又は湧き水若しくはミネラルウォーター。

有利には、組成物は、顔料、染料、ポリマー、界面活性剤、レオロジー剤、フレグランス、電解質、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、及び防腐剤、並びにこれらの混合物から選択できる、少なくとも１種の化粧上許容される賦形剤をも含む。

化粧用組成物は、例えば、セラム、ローション、クリーム若しくは他にヒドロゲル、好ましくはマスク、又はスティック若しくは他にパッチの形態でもよい。

本発明のエキス及び組成物は、肌の老化兆候の発現の遅延、又はその影響の減速に特に望ましい効果を発揮する。

特定の改変した一実施形態によれば、前記追加の化粧物質（複数可）は、化粧剤又は化粧用組成物の０．００１〜１０質量％の濃度、特に前記化粧剤又は前記化粧用組成物の０．０１〜５質量％の濃度で含むことができる。

第２の態様に従って、本発明は、蜂蜜又はローヤルゼリーと、少なくともＧｌｙ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｐｒｏ−Ｇｌｙのアミノ酸配列を含み、Ｘ_１及びＸ_２が、天然又は合成アミノ酸から選択されるアミノ酸であるペプチドとの、前に又は以下の記載に規定したような組み合わせであって、特に、前に又は以下の記載に規定したような化粧用組成物の形態の組み合わせの、肌の老化兆候の発現を遅延させる、又はその影響を減速する化粧剤としての使用も対象とする。

第３の態様に従って、本発明は、特に肌の老化兆候の発現を遅延させる、又はその影響を減速するために、蜂蜜又はローヤルゼリーと、少なくともＧｌｙ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｐｒｏ−Ｇｌｙのアミノ酸配列を含み、Ｘ_１及びＸ_２が、天然又は合成アミノ酸及びその誘導体から選択されるアミノ酸であるペプチドとの、前に又は以下の記載に規定したような組み合わせであって、特に、前に又は以下の記載に規定したような化粧用組成物の形態の組み合わせを当該肌の少なくとも１区域に適用することを含むことを特徴とする、美容ケアの方法も対象とする。

本発明のその他の目的、特徴及び利点は、本発明による化粧活性剤の調製及びその特性を実証する試験の実施例、並びに該化粧剤を使用した化粧用組成物の実施例に関する、以下の説明的記述であって、単に例示するためだけに示され、したがって本発明の範囲を決して限定することができない説明的記述から明らかとなろう。

本実施例において、特に指定のない限り、すべての百分率は質量基準であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧である。

図１ａ、１ｂ及び２ａ〜２ｄは、本発明の組み合わせの活性を実証するために用いる方法を例示する例である。

実施例１：蜂蜜とペプチド及び／又はペプチド誘導体の組み合わせの、治癒活性の測定
本実験は、インビトロでの治癒現象の定量的で再現性の完全な測定を可能にする、生体適合性のセルカルチャーインサートのモデルに基づいている。

１．細胞培養
本研究で使用する細胞は、正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＦ）である。
この細胞を１７５ｃｍ^３の各フラスコにフラスコ１個当たり１００万個の密度で、１０％ウシ胎児血清及びＬ−グルタミン１．３ｍＭで補完したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）培養培地中に播種する。集密に達したら、細胞をトリプシン処理し、再播種して治癒試験を行う。

２．治癒試験
細胞の播種
細胞を播種する前に、ＩＢＩＤＩ社（ドイツ）によってカルチャーインサート（整理番号：８０２０９）という名称のキット形式で販売されているインサートをプレートの６ウェル底に置く。１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地にＮＨＦを細胞２００００個／ｃｍ^２の比率で播種し、４８時間培養する。
細胞が集密に達したとき培地交換を行い、ＤＭＥＭのみにする。培養を２４時間継続する。

処置
本研究において処置（試験した物質）ごとに２ウェル使用する。
試験した物質は、以下のとおりである（ここで示される濃度は最終濃度である）。
クローバー蜂蜜１００μｇ／ｍＬ
水−アルコール溶液中のＰａｌ−ＶＧＶＡＰＧ１％
クローバー蜂蜜＋Ｐａｌ−ＶＧＶＡＰＧ１００μｇ／ｍＬ＋１％

非処置対照（ＮＴ）を実施するために、試験物質を添加しないＤＭＥＭ培地のみでの細胞培養も２ウェルで実施する。

Ｐａｌ−ＶＧＶＡＰＧペプチドは、Ｓｅｄｅｒｍａ社によってＢｉｏｐｅｐｔｉｄｅＥＬの商品名で販売されており、水−グリコール溶液の形態である。

試験した活性剤は、以下の方法で調製する。
ＰＢＳ中のクローバー蜂蜜原液１００ｍｇ／ｍｌを調製し、０．２２μｍフィルターに通して濾過することによって滅菌する。その後、最終希釈（１／１０００）をＤＭＥＭのみにおいて行う。
市販のＢｉｏｐｅｐｔｉｄｅＥＬ溶液は、培養培地中で１／１００に希釈する。

治癒
先ず初めに、カルチャーインサートを滅菌鉗子で取り除く。位相差顕微鏡を使用して、インサートが置かれていた場所で細胞が全く存在しない「損傷」域を観察する（図１ａ）。

次いで、各ウェルにおいて、上記の条件にしたがって、最初の培養培地を、試験する活性剤を含有する培養培地と交換する。

インキュベーター中３７℃で５％ＣＯ_２を含有する雰囲気下にて１６時間（事前に求めた最適な測定時間）、細胞を培養し続ける。各処置による瘢痕域の再定着度は、画像分析技術によって観察する（図１ｂ）。

細胞の標識
ＰＢＳですすぎ、その後１０％ホルマリン溶液で細胞を１０分間固定し、次いでＰＢＳですすぐ。次いで細胞を０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００溶液で１０分間浸透させる。

細胞核の標識に使用される蛍光分子であるＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、及びアクチン細胞骨格の標識に使用されるファロイジン５４６を含有する溶液を細胞に付着させ、周囲温度で暗所において１時間インキュベートする。

次いで、細胞をＰＢＳですすぎ、水溶性封入剤１滴で被覆する。

ＮｉｋｏｎＴＥ２０００ビデオ顕微鏡で、損傷域における、青色蛍光（細胞核）及び赤色蛍光（アクチンフィラメント）の画像を、各ウェル写真２枚の割合で即座に撮る。

画像分析
画像分析は、インサートを取り除いた後、人工的「損傷」域の線維芽細胞による定着を可視化及び定量化するために用いる。ＬｅｉｃａＱＷＩＮソフトウェアを分析に使用する。

分析には、以下の４つのステップが含まれる。
１ＮＩＳソフトウェアを搭載したＮＩＫＯＮＴＥ２０００ビデオ顕微鏡を使用して、処置前（時間０）の画像を取得する（図２ａ）。画像は、インサートを取り出した後の無細胞の剥離域を示している。
２コンピュータツールによる測定域、即ち、黄色域を決定する（図２ｂ）。
３処置ステップ及び細胞核の標識ステップ後に、新規に画像を取得する（図２ｃ及び２ｄ）。損傷域は、最初の無細胞域に再定着する線維芽細胞を含む。
４ステップ２で規定した域において標識した細胞核を自動選択し、前記標識した細胞核を数える。

単位面積（ｃｍ^２）当たりの損傷域に再定着した細胞の数を計算する。この測定を繰り返して、試験した活性剤ごとに４枚ずつ画像を得る。

ここで注目すべきは、図１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂが実施例１の処置に従って得たのではなく、実施例１の処置に従って得た写真のタイプを例示する役割をしていることである。したがって、図１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂのものと類似した写真が、実施例１の処置に従って得られたのである。

３．結果
創傷への再定着に対する試験した蜂蜜の効果を図３に示す。

クローバー蜂蜜（非処置対照と比べて＋１９０％）及びＰａｌ−ＶＧＶＡＰＧ（非処置対照と比べて＋１５０％）は、損傷域への再定着に有意な効果を有する。クローバー蜂蜜とＰａｌ−ＶＧＶＡＰＧの組み合わせ（非処置対照と比べて＋２２４％）は、クローバー蜂蜜のみ又はＰａｌ−ＶＧＶＡＰＧのみでの処置に関して観察したものより有意に高い効果を発揮している。蜂蜜とＰａｌ−ＶＧＶＡＰＧペプチドの組み合わせは、これら２つの活性剤のそれぞれの作用を増強することを可能とし、予期せぬ結果となっている。

これにより、肌の老化兆候の発現の予防若しくは遅延、又はその影響の減速に特に効果的な化粧活性剤として、クローバー蜂蜜を選択することが正当化される。

実施例２：本発明による化粧品製剤
以下の組成物は、本発明の実施形態の例を示す。最終組成物の質量に対して百分率を質量によって表す。

肌の張りを改善する皺取りセラム
クローバー蜂蜜エキス４
ローヤルゼリー０．１
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙペプチド０．３
Ｃｅｎｔｅｌｌａａｓｉａｔｉｃａ０．１
Ｖｉｇｎａａｃｏｎｉｔｉｆｏｌｉａエキス０．１
ＰａｒｓｏｌＭＣＸ３
賦形剤ｑｓ１００

朝、セラムを顔の老化兆候が表れている部分に塗布する。

老化防止修復用スージングナイトクリーム
クローバー蜂蜜のグリコール分解物３
Ｃｙａｔｈｅａｍｅｄｕｌｌａｒｉｓエキス０．２
マンゴーバター２
ツルケステロン０．０２
Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙペプチド０．１
Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒペプチド０．１
ヒアルロン酸１
アスコルビルグリコシド０．４
α−トコフェロール０．２
グリチルリチン酸二カリウム０．０５
フレグランス乳液の賦形剤ｑｓ１００

クリームは、就寝時に、顔に塗布する。

皺取り修復エッセンス
パルミトイル−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙペプチド０．２
ローヤルゼリー３
Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａｅｘｃｅｌｓａエキス０．０５
Ｍａｌｖａｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓエキス０．０２
グリコール酸０．１
アルコール３
アデノシン０．０２
賦形剤ｑｓ１００

調製物は、顔の皺及び細かいすじに適用する。

老化防止ファンデーション
クローバー蜂蜜のグリコール分解物０．０１
ローヤルゼリー０．０２
パルミトイル−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙペプチド０．０１
ＵＶＡ及びＵＶＢスクリーニング剤５
着色賦形剤ｑｓ１００

調製物は、顔に適用する。

Ｘａａは、天然若しくは合成アミノ酸又はその誘導体を示す。

Claims

少なくとも１種の化粧上許容される賦形剤を含み、線維芽細胞を刺激することにより、組織修復過程を促進することによって、真皮の密度及び弾性を高めるために、内部成長兼基質再組織化因子として作用する組織修復過程を生じる化粧用組成物であって、
（ｉ）クローバー（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍｒｅｐｅｎｓ）蜂蜜と、
（ｉｉ）Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの配列を含む、若しくは該配列によって形成されているペプチド、又は化粧上許容される塩であり、前記ペプチドが、パルミトイル基若しくはステアロイル基でエステル化されている、ペプチドと、を含む組成物。
ペプチドが、任意選択で水−グリコール溶液の形態のパルミトイル−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙである、請求項１に記載の組成物。
セラム、ローション、クリーム、ヒドロゲル、マスク、スティック、又はパッチの形態である、請求項１に記載の組成物。
２成分のうちの１つとして使用されるクローバー（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍｒｅｐｅｎｓ）蜂蜜の濃度が、同成分を含有する化粧用組成物の質量に対して、０．００１〜１０質量％である、請求項１に記載の組成物。
２成分のうちの１つとして使用されるクローバー（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍｒｅｐｅｎｓ）蜂蜜の濃度が、前記化粧用組成物の０．０１〜５質量％である、請求項１に記載の組成物。
上記ペプチドの濃度が、その同一物を含有する化粧用組成物の０．００１〜５質量％である、請求項１に記載の組成物。
上記ペプチドの濃度が、前記化粧用組成物の０．０１〜５質量％である、請求項１に記載の組成物。