CN105746881A

CN105746881A - 一种产脂肽枯草芽孢杆菌发酵中草药制备饲用抗生素替代物的方法

Info

Publication number: CN105746881A
Application number: CN201610106541.1A
Authority: CN
Inventors: 刘唤明; 洪鹏志; 刘颖
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2015-03-02
Filing date: 2016-02-27
Publication date: 2016-07-13
Also published as: CN105707453A; CN104719635A

Abstract

本发明公开了一种产脂肽枯草芽孢杆菌发酵中草药制备饲用抗生素替代物的方法，包括以下主要步骤：将中草药粉碎后过60目筛备用；往粉碎的中草药中添加营养物和水混匀作为发酵培养基；发酵培养基灭菌冷却后接入能产脂肽的枯草芽孢杆菌（<i>Bacillus subtilis</i>）HL?1进行固态好氧发酵；发酵后的原料经干燥、粉碎和包装后制备成饲料添加剂成品。本发明方法制备的饲料添加剂富含脂肽和中草药有效成分，它有良好的促生长与抗病性能，在饲料行业中能完全替代饲用抗生素，有着良好的应用前景。

Description

一种产脂肽枯草芽孢杆菌发酵中草药制备饲用抗生素替代物的方法

技术领域

本发明涉及一种产脂肽枯草芽孢杆菌发酵中草药制备饲用抗生素替代物的方法，属于饲料添加剂制备的技术领域。

背景技术

目前中国每年生产的大约21万吨抗生素原料中有9.7万吨用于畜牧养殖业，占年总产量46.1%。过量的使用抗生素不仅导致了养殖动物对抗生素药物的耐药性，使养殖动物的抗病能力下降，而且这些抗生素会随食物链进入人体，使人体在无意中产生耐药细菌，一旦生病就会增加治疗难度和费用，甚至有可能会产生“超级细菌”，出现无药可治的情况。随着人们生活质量的不断提高，对各类食品包括肉食品的卫生安全有了更高的要求，对 “放心肉”、“绿色食品” 的呼声也日渐强烈。因此，寻找抗生素的绿色替代品是我国饲料和养殖行业发展中亟待解决的问题。

中草药是中国医学宝库中的瑰宝，且中草药作为饲料添加剂，在我国古代已经开始。中草药具有无毒副作用、不易引发细菌抗药性、无残留等特性，作为一种饲用抗生素的绿色替代品在饲料工业得到了广泛的认可。从20世纪80年代起, 中草药已被用于作饲用抗生素替代品, 且取得了一定的应用效果。中草药经过微生物发酵后，其有效成分被充分释放，使其更具生物活性和疗效近年来更是研究热点。中国饲料〔2010，419（15）：13-17〕文献公开了从不同中草药原料中分离得到的米曲霉对中草药进行发酵，发酵料蒸煮液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性分别较对照提高36.03%、60.83%、27.64%、41.32%。但以上对中草药的发酵只是局限在充分让中草药有效成分释放出来，从而提高抑菌活性，然而中草药有效成分的抗菌活性并没有提升。目前发酵中草药存在最大的问题是使用剂量偏大。这不仅增加了产品的使用成本，而且还影响饲料营养配比和适口性，从而使得发酵中草药仍没有在饲料工业得到广泛的应用。因此，急需大幅度提高发酵中草药中有效成分的抗菌活性，减少发酵中草药在饲料工业的使用剂量，以促进发酵中草药在饲料工业的广泛应用。

作为饲用抗生素的一种绿色替代品，抗菌肽通常具有耐热、抗菌谱广、水溶性好和不易产生耐药性等特性，近年来备受关注。抗菌脂肽是以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、纳豆菌（Bacillus natto）等为代表的芽孢杆菌产生的一系列脂肽类物质。近年来抗菌脂肽在饲料工业的应用已有研究报道。专利CN 101974586 A 公开了一种枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的生产方法及在饲料中的应用。枯草芽孢杆菌fmbj经液体发酵、浓缩、喷雾干燥后制成一种效价为20000～300000IU/g的抗菌脂肽产品。在肉鸡日粮中按4000 IU/公斤添加抗菌脂肽，提高了饲料利用率，并对肉鸡的生长发育和免疫力的增强均有较好的效果。抗菌脂肽虽然在饲料工业具有良好的应用前景，但目前由于生产成本高，并没有在饲料工业得到实际应用。因而，降低抗菌脂肽的生产成本或抗菌脂肽的使用剂量，从而降低起使用成本，是促进抗菌脂肽在饲料工业广泛的应用所需解决的技术问题。

申请人于2015年3月2日提出了发明申请201510092596.7“一种水产品下脚料和中草药混合发酵的饲料添加剂的制备方法”。该发明申请公开了以水产品下脚料和中草药为原料，通过产脂肽枯草芽孢杆菌固态发酵制备一种富含中草药有效成分、脂肽和小肽的饲料添加剂。在该发明申请中，为了使得制备的饲料添加剂富含小肽，在发酵培养基中加入了过多的水产品下脚料，发酵培养基中碳氮比失衡，这既不利于枯草芽孢杆菌产生脂肽，也不利于枯草芽孢杆菌产非淀粉多糖酶来降解中草药细胞壁，从而在一定程度上降低了制备的饲料添加剂的抗菌活性。

发明内容

针对现有技术存在的问题，以及申请人提出的发明申请201510092596.7 “一种水产品下脚料和中草药混合发酵的饲料添加剂的制备方法”所存在的不足，以申请人于2015年3月2日提出的发明申请201510092596.7为优先权，本发明提供了一种产脂肽枯草芽孢杆菌发酵中草药制备饲用抗生素替代物的方法。本发明的主要目的是不但要降低抗菌脂肽与中草药发酵的生产成本，而且还要提高中草药有效成分与抗菌脂肽的抗菌活性，从而降低抗菌脂肽与中草药在饲料工业的使用剂量，以促进抗菌脂肽与中草药在饲料工业的广泛的应用。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种产脂肽枯草芽孢杆菌发酵中草药制备饲用抗生素替代物的方法，包括如下步骤：

（1）将斜面保藏的能产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 ℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液备用；

（2）将中草药粉碎后过60目筛备用；

（3）往步骤（2）制得的粉碎后过60目筛的中草药上并添加营养物和水，并混匀，获得最终水分含量控制在40%～80%范围内的发酵培养基；

（4）将步骤（3）获得的混匀的发酵培养基于121℃灭菌30min；

（5）将步骤（4）获得的灭菌后的发酵培养基冷却至室温，然后接入步骤（1）所制备的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液，并混匀；

（6）原料的发酵：将步骤（5）获得的加入菌的发酵培养基按照下列方法进行发酵：发酵培养基分装在已消毒的发酵浅盘中，装料厚度为4cm～8cm，浅盘中发酵培养基表面覆盖已灭菌的湿纱布，再将浅盘置于已灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在30℃~32℃，发酵时间为40h～50h；

（7）成品处理：发酵结束，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即可制得一种富含脂肽和中草药有效成分的饲用抗生素替代物成品。

所述步骤（1）中接入的枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）HL-1能产生抗菌脂肽，该菌已于2015年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No．10379，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

所述步骤（2）中的中草药为黄芪、金银花、石榴皮、地榆、黄连、鱼腥草、苦参和土茯苓中的一种或其中两种以上的混合物。

所述步骤（3）中的营养物为葡萄糖、蛋白胨、氯化钾、氯化镁和磷酸氢二钾所组成的混合物。所述步骤（3）中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占发酵培养基总质量百分比计，分别为：葡萄糖0.01%～5%，蛋白胨0.01%～5%，氯化钾0.01%～5%，氯化镁0.01%～5%，磷酸氢二钾0.01%～5%。

所述步骤（5）中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液的接种量以接入的种子液的质量占发酵培养基总质量百分比计，为0.1%～5%。

本发明与现有的技术相比，有如下优点。

（1）降低了饲用抗生素的绿色替代品的生产成本。本发明用产生抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌来进行固态发酵的方法，不但可发酵产生抗菌脂肽，而且还使得中草药的有效成分释放出来。本发明将抗菌脂肽的发酵与中草药的发酵合二为一，从而在总体上降低了饲用抗生素的绿色替代品的生产成本。

（2）提高了抗菌脂肽与中草药有效成分的抗菌活性，从而显著降低了抗菌脂肽与中草药有效成分的使用剂量。本发明从成千上万的中草药库上筛选出了其有效成分与抗菌脂肽具有协同抑菌效应的中草药。本发明不但将抗菌脂肽的发酵生成与中草药发酵合二为一，而且由于抗菌脂肽与中草药有效成分的相互作用，二者的抗菌活性都显著增强。这也是目前单一的中草药发酵与抗菌脂肽发酵生产所不具备的。正是由于本发明提高了所制备的抗菌脂肽与中草药有效成分的抗菌活性，从而使得本发明所制备的饲用抗生素替代物的使用剂量大大减少，其中所含的抗菌脂肽与中草药有效成分的实际使用剂量比单独使用时减少了几倍到几十倍。

与申请人2015年3月2日提出的发明申请201510092596.7“一种水产品下脚料和中草药混合发酵的饲料添加剂的制备方法”相比，本发明申请中发酵原料中碳氮比为发酵生产的正常范围，这更有利于脂肽的发酵生产和中草药的发酵，因而本发明申请提供的技术方案所制备的饲料添加剂抗菌活性更强。

本发明提供了一种产脂肽枯草芽孢杆菌发酵中草药制备饲用抗生素替代物的方法。本发明不但降低了饲用抗生素绿色替代品的生产成本；而且还大大降低了脂肽与中草药有效成分在饲料工业的使用剂量。本发明得到的富含脂肽和中草药有效成分的饲用抗生素替代物在华南地区的猪、鸡、对虾的养殖试验表明，用本发明方法制备的饲用抗生素替代物可完全替代饲用抗生素，明显降低养殖成本，取得了显著的经济效益和社会效益。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面就中草药的种类、发酵参数和发酵方式的选择结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1：将斜面保藏的能产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 ℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌HL-1种子液备用；将黄芪和鱼腥草粉碎后过60目筛备用。将100公斤粉碎的复合中草药（40公斤黄芪+60公斤鱼腥草）混合，并加入400克葡萄糖、500克蛋白胨、700克氯化钾、300克氯化镁、500克磷酸氢二钾和100公斤水一起混匀，获得混匀后的发酵培养基；混匀后的发酵培养基于121℃灭菌30min；接着往灭菌后冷却的发酵培养基中加入4公斤枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液，搅拌并混合均匀；接种后的原料分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，装料厚度为8厘米，浅盘中物料表面覆盖已灭菌的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为 30℃，发酵时间为50h；发酵结束后，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了本发明所述的一种饲用抗生素替代物成品。

实施例2：将斜面保藏的能产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 ℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液备用；将将土茯苓和金银花粉碎后过60目筛备用。将100公斤粉碎的复合中草药（50公斤土茯苓+50公斤金银花）混合，并加入420克葡萄糖、450克蛋白胨、280克氯化钾、280克氯化镁、580克磷酸氢二钾和100公斤水一起混匀，获得混匀后的发酵培养基；混合后的发酵培养基于121℃灭菌30min；接着往灭菌后冷却的发酵培养基中加入4公斤枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液，搅拌并混合均匀；接种后的原料分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，装料厚度为4厘米，浅盘中物料表面覆盖已灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在32 ℃，发酵时间为40h；发酵结束后，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了本发明所述的一种饲用抗生素替代物成品。

Claims

1.一种产脂肽枯草芽孢杆菌发酵中草药制备饲用抗生素替代物的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

（2）将中草药粉碎后过60目筛备用；

（4）将步骤（3）获得的混匀的发酵培养基于121℃灭菌30min；

2.根据权利要求1所述的一种产脂肽枯草芽孢杆菌发酵中草药制备饲用抗生素替代物的方法，其特征在于：所述步骤（1）中所用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No．10379。

3.根据权利要求1所述的一种产脂肽枯草芽孢杆菌发酵中草药制备饲用抗生素替代物的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的中草药为黄芪、金银花、石榴皮、地榆、黄连、鱼腥草、苦参和土茯苓中的一种或其中两种以上的混合物。

4.根据权利要求1所述的一种产脂肽枯草芽孢杆菌发酵中草药制备饲用抗生素替代物的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的营养物为葡萄糖、蛋白胨、氯化钾、氯化镁和磷酸氢二钾所组成的混合物。

5.根据权利要求1所述的一种产脂肽枯草芽孢杆菌发酵中草药制备饲用抗生素替代物的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占发酵培养基总质量百分比计，分别为：葡萄糖0.01%～5%，蛋白胨0.01%～5%，氯化钾0.01%～5%，氯化镁0.01%～5%，磷酸氢二钾0.01%～5%。

6.根据权利要求1所述的一种产脂肽枯草芽孢杆菌发酵中草药制备饲用抗生素替代物的方法，其特征在于：所述步骤（5）中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液的接种量以接入的种子液的质量占发酵培养基总质量百分比计，为0.1%～5%。