CN103283949A

CN103283949A - 一种粪链球菌活菌制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN103283949A
Application number: CN2013102343904A
Authority: CN
Inventors: 李帅伟; 李本涛
Original assignee: GUANGZHOU GLAM BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU GLAM BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明涉及一种粪链球菌活菌制剂的生产方法，属于微生物技术领域，具体涉及一种粪链球菌活菌制剂的液体厌氧发酵生产方法。它包括以下步骤：采用粪链球菌作为发酵菌种，接种于经过优化的液体培养基中，在温度为40~42℃的条件下培养16~20h，放罐并测定活菌数，用植物淀粉吸附发酵液并干燥、粉碎和包装，制成活性稳定的粪链球菌制剂。本发明的优点：用普通发酵罐即可完成粪链球菌的高密度发酵，操作简单，效果稳定，能耗低；不用离心机和冷冻干燥机等设备，降低了生产成本，提高了生产效率，易于推广使用。

Description

一种粪链球菌活菌制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵工程领域，具体地说是一种液体培养基经粪链球菌厌氧发酵制备益生菌饲料添加剂的方法。

背景技术

粪链球菌（Enterococcus faecalis）又叫粪肠球菌，其菌体形态为链球或球状，菌体直径大小0.3 μm～0.7μm，无芽孢；稀释后在肉汤琼脂平板上形成的菌落呈圆形、乳白色，表面凸起湿润，有光泽，边缘整齐，大多数成双或短链状排列，通常不运动。在丰富培养基上菌落大而光滑，直径1-2mm。其营养要求低，在普通营养琼脂上也可生长。能在10℃或45℃ pH 9.6或含6.5% NaCl肉汤培养基中生长，并能耐65℃高温30分钟。它可利用精氨酸为能源，发酵山梨醇，不发酵阿拉伯糖。在简单的培养基上生长不需叶酸。粪链球菌是目前微生物青贮接种剂主要菌种之一，它经过系列工艺制成的微生物制剂直接投喂养殖动物后，有利于改善肠道内微生态平衡，防治动物肠道菌丛区系紊乱，还能分解蛋白质为小肽、合成B族维生素等功效。它也能增强巨嗜细胞的活性，促进动物的免疫反应，提高抗体水平。粪链球菌在国外饲料行业中已普遍使用，国内的生产与应用刚刚开始。粪链球菌的生理特性有如下几点：（1）粪链球菌分泌的乳酸为L型乳酸，又称为自然乳酸或生理乳酸，可全被动物吸收利用。乳酸杆菌分泌的乳酸L型和D型都有，但D型则不能被动物吸收利用。在动物的肠道里。粪链球菌可在肠内形成生物薄膜附着在肠道粘膜上，可以在肠道内发育、生长、繁殖，繁殖时问很短，19min分裂一次。粪链球菌还可把部分蛋白质分解成酰胺和氨基酸，把大部分的碳水化合物的无氮浸出物转化为乳酸，而且能使饲料里的纤维变软，所以饲料的转化吸收率就比较高。粪链球菌分解的这些特殊营养成分弥补了常规饵料的营养缺陷，对各种养殖动物幼体起到了十分重要的营养强化和促生长作用。（2）粪链球菌产生的抗菌物质大多是肽或蛋白质，被称为细菌素。粪链球菌可分泌两类细菌素，一类仅只是对相关的菌有抑制作用，抗菌谱较窄，可阻碍病原微生物接触肠粘膜细胞；另一类具有广谱抗菌活性，它们对致病菌如：沙门氏菌、致贺氏病和假单孢菌都有很好的抑制作用。所以，长期在饲料中添加粪链球菌可以减少养殖动物肠炎等疾病的发生。粪链球菌在生长和代谢过程中产生对养殖动物有益的营养物质，如乳酸、氨基酸、维生素、酶及抑菌物质。在畜禽养殖过程中，添加了粪链球菌不仅有利于提高饲料的消化率，同时也相应降低了排泄物中的氨态氮的浓度，减少了排泄物的不消化物，改善了饲养环境，减少了污染，既有防腐作用又增加饲料的风味，促进养殖动物的食欲。（3）由于饲料中饼粕、麦麸等农副产品中的植酸磷含量较高，对钙等矿物质元素利用造成影响，而在粪链球菌的生理作用下通过催化、水解等反应分泌出的L-乳酸，它可以对钙质合成L-乳酸钙，促进养殖动物对钙质的吸收。所以饲料中添加粪链球菌可减少养殖中有机物和矿物质排泄量有效地减少水质污染。

粪链球菌是一种新型饲料添加剂，其用途和分类与我国的微生态制剂相同，属于益生素的一种，但比益生素又多具备保健剂之功能，尤其对人及动物无毒无病原性，对酸有很强的抵抗力，可顺利地通过胃，并在肠道内迅速增殖，调解肠道菌群抑制大肠杆菌和沙门氏菌，分泌乳酸和类杀菌因子，刺激免疫系统提高免疫能力，促进动物全群健康水平等方面，是饲料业中的绿色添加剂。

将粪链球菌经过高密度液体发酵，获得高菌体密度的发酵培养液，经植物淀粉吸附后，干燥，粉碎，制成的干酪乳杆菌微生态制剂应用于畜牧养殖，能够调节动物肠道菌群平衡，增强机体免疫力，提高抗病能力。

以往的粪链球菌的发酵方式主要存在以下问题和不足：（1）采用厌氧培养罐或通过持续通入二氧化碳或氮气维持其厌氧环境来进行，原料不能重复使用，操作较复杂，成本较高；（2）液体发酵产物的后处理需要高速冷冻离心机进行离心和低温冷冻干燥，工艺复杂，成本高昂，产量低；（3）发酵产物的活菌密度不够高。

发明内容

本发明的目的是提供一种粪链球菌活菌制剂的制备方法，以克服现有的粪链球菌活菌制剂的制备方法上存在的上述不足。

实现本发明目的的技术方案如下：

一种粪链球菌活菌制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）配制培养基；

（2）溶解上罐的培养基，装上pH电极并调整pH值，然后将培养基装入发酵罐中；

（3）对发酵罐中的培养基加温灭菌；

（4）接种粪链球菌种子菌：在发酵罐降温后加入无机盐溶液，然后加入液体石蜡及接入种子菌；

（5）控温发酵；控制pH值和温度，在保温的状态下发酵；

（6）放罐并测定发酵液菌数；

（7）用玉米粉、小麦粉或者大豆粉及其组合物吸附发酵液，将吸附后的混合物干燥和粉碎，制得稳定的粪链球菌活菌制剂。

与现有技术相比，本发明的技术优势：

（1）直接利用普通发酵罐即可进行生产，操作简单，质量稳定，成本低廉，易于产业化生产；

（2）产品发酵周期明显缩短，产品到达终点酸度或pH值的时间为16～20小时，而传统的粪链球菌单独发酵达到同样的酸度或pH值需要48小时甚至更长时间；生产周期大大缩短，易于产业化，从而可将粪链球菌广泛应用于畜牧养殖业；

（3）产品成本与发酵污染风险降低：本发明由于生产周期缩短，生产成本降低，同时，发酵基料前期产酸较快、pH值下降迅速，能较好抑制杂菌污染，产品发酵失败风险大大降低；

（4）采用厌氧培养罐或通过持续通入二氧化碳或氮气维持其厌氧环境来进行，原料不能重复使用，操作较复杂，成本较高；用于隔绝空气的液体石蜡可以多次反复使用，大大降低了生产成本；

（5）本发明采用经过优化的粪链球菌液体发酵培养基，粪链球菌菌数含量明显提高，发酵产物活菌浓度可达1.0×10⁹ CFU/mL以上；

（6）本发明采用植物淀粉吸附发酵液，后处理工艺不需要用高速冷冻离心机，本发明将植物淀粉吸附混合物直接干燥和粉碎，包装后即制成产品，后处理工艺大大简化，生产成本更低；

（7）国内外有关粉末发酵剂的研制，大多采用真空冷冻干燥法，此方法的优点是菌体细胞存活率高，但是工艺复杂，制作成本高，而吸附后干燥法的生产成本低，操作工艺简单，较易用于大规模的工业化生产和推广应用，适合于我国饲料企业在现有设备条件下生产粪链球菌微生态制剂产品。

具体实施方式

实施例1 制备稳定化的粪链球菌活菌制剂的工艺流程，包括以下步骤：

（1）菌种活化：

本发明采用粪链球菌作为发酵菌种，购于广东省微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：GIM1.130，将-80℃保存的粪链球菌活菌菌种在MRS培养基（蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，琼脂粉 15.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2~6.6，高温高压灭菌）固体斜面上划线，37℃培养16个小时左右，菌种活化一般1~3次；

（2）制备一级种子：

将活化的粪链球菌活菌，用接种环挑取一环接种于20mL MRS液体（蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2~6.6，高温高压灭菌）的试管中，37℃深层静置培养20小时左右，菌液以3%的接种量接种到装有适当体积MRS培养基的三角瓶中，37℃深层静置培养20小时左右备用；若培养基灭菌后未立即使用，则需在沸水浴中加热10min驱氧后使用；

（3）配制液体发酵培养基：

培养基包括的原料及重量份数为：玉米粉70，小麦粉20，豆饼粉10，葡萄糖15，酵母浸出粉2，蛋白胨4，原料当以克计，蒸馏水相应以mL计的份数为800~1000，溶解，加入发酵罐内进行121℃，时间为20分钟的高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐1.2g/1000mL基料, 无机盐：CaCl₂ 0.02%，MgSO_4·7H₂O 0.04%，MnSO₄·H₂O 0.04%，，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡至厚度为2cm；

（4）液体发酵：

将经过灭菌处理的液体发酵培养基按照5%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，然后加入液体石蜡至厚度为2cm，保持温度为37~40℃，pH 6.0-6.8，培养20个小时放罐，将粪链球菌活菌培养物进行菌落计数，经过这样发酵的活菌体浓度达到2.6×10⁹CFU/mL；

（5）用植物淀粉吸附发酵液：以质量比为7:2:1的玉米粉、小麦粉豆饼粉作为发酵液的吸附剂，并将植物淀粉吸附的发酵液混合物进行干燥，65℃下加温处理60min左右，经过干燥、粉碎和包装，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。

实施例2 与上述实施例1不同的是：

（1）培养基配方：玉米粉60，小麦粉25，豆饼粉15，葡萄糖10，酵母浸出粉1.5，蛋白胨3.0，原料当以克计，蒸馏水相应以mL计的份数为800~1000，溶解经100℃、30min高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐1.0g/1000mL基料，无机盐的组成： MgSO_4·7H₂O 0.04%，MnSO₄·H₂O 0.04%，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡厚度为1cm左右；

（2）控温发酵：接入粪链球菌液体种子的接种量为3%，搅拌均匀，起始pH 6.6，控制 pH 6.0~6.8，发酵温度控制在37~40℃，发酵18个小时，放罐，将粪链球菌培养物进行菌落计数，经过这样发酵的活菌体浓度为1.6×10⁹CFU/mL；

（3）用植物淀粉吸附发酵液：以等质量的玉米粉和小麦粉混合均匀，作为发酵液的吸附剂，将吸附的混合物经过干燥、粉碎和包装，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。

Claims

1.一种粪链球菌活菌制剂的制备方法包括以下步骤：

（1）菌种活化：

（2）制备一级种子：

（3）配制液体发酵培养基：

培养基包括的原料及重量份数为：玉米粉40~60，小麦粉15~30，豆饼粉5~15，葡萄糖10~15，酵母浸出粉1~3，蛋白胨2~4，原料当以克计，蒸馏水相应以mL计的份数为800~1000，溶解，加入发酵罐内进行100~121℃，时间为10~30分钟的高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐0.7~1.5g/1000mL基料，无机盐选自CaCl₂ 、MgSO_4·7H₂O及MnSO₄·H₂O中的两种或者三种，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡至厚度为1~2cm；

（4）液体发酵：

将经过灭菌处理的液体发酵培养基按照3~5%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，然后加入液体石蜡至厚度为1~2cm，保持温度为37~40℃，pH 6.0-6.8，培养16~20个小时放罐，将粪链球菌活菌培养物进行菌落计数，经过这样发酵的活菌体浓度可达1.0×10⁹CFU/mL以上；

（5）用植物淀粉吸附发酵液：以玉米粉、豆饼粉或小麦粉，或者其任意组合，作为发酵液的吸附剂，并将植物淀粉吸附的发酵液混合物进行烘干干燥，粉碎和包装，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。

2.根据权利要求1所述的粪链球菌活菌制剂，其特征在于所述的液体发酵培养基为：玉米粉40~60，小麦粉15~30，豆饼粉5~15，葡萄糖10~15，酵母浸出粉1~3，蛋白胨2~4，原料当以克计，蒸馏水相应以mL计的份数为800~1000，溶解，加入发酵罐内进行100~121℃，时间为10~30分钟的高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐0.7~1.5g/1000mL基料，无机盐选自CaCl₂ 、MgSO_4·7H₂O及MnSO₄·H₂O中的两种或者三种，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡至厚度为1~2cm。

3.根据权利要求1所述的稳定安全的粪链球菌活菌制剂，其特征在于：培养温度为温度为37~40℃，pH 6.0~6.8。

4.根据权利要求1所述的稳定安全的粪链球菌活菌制剂，其特征在于：各级种子菌接种量为3~5%的接种量。

5.根据权利要求1所述的稳定安全的粪链球菌活菌制剂，其特征在于：所用的菌种为链球菌属的粪链球菌。

6.根据权利要求1所述的稳定安全的粪链球菌活菌制剂，其特征在于：作为饲料添加剂的应用领域为畜禽饲料添加剂。