CN112011483B - 适用于粪肠球菌増菌的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种适用于粪肠球菌増菌的培养方法。本发明最大的创新之处是在发酵培养基中加入了经水回流提取的甘草提取物，发酵过程中采用了流加氨水的方式调节发酵pH值，以糊精作为保护剂进行喷雾干燥，使发酵菌量较常规方式提高了约60%，菌量由原来的50～60亿CFU/ml提升至约80～100亿CFU/ml；产品收率达到94%，且产品质量稳定。本发明的方法可有效提高粪肠球菌规模化发酵水平，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种适用于粪肠球菌増菌的培养方法。
背景技术
关于粪肠球菌増菌的培养方法或培养基，以下的文献作了披露：
杨罡等人在《江西科学》第35卷第3期中发表了《粪肠球菌xwAP增培养基的优化》一文中采用单因素试验和中心组合设计对粪肠球菌増菌的培养基进行了优化。结果表明：其所培养的活菌浓度可达到3.21×109CFU/mL，是MRS的3.89倍。
尽管上述的方法进行了一系列的优化和改进，但是其活菌浓度仍然不高。因此需要发明一种更有效的粪肠球菌增菌的方法。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种适用于粪肠球菌増菌的培养方法，通过该方法培养的活菌浓度能达到80～100亿CFU/ml；产品收率达到94％。
本发明所提供的适用于粪肠球菌増菌的培养方法，包括以下的步骤：
适用于粪肠球菌増菌的培养方法，包括以下的步骤：
(1)在甘草饮片中加入水回流提取，过滤，获得一次提取液；再在一次滤渣中加入水回流提取，过滤，获得二次提取液和二次滤渣；最后在二次滤渣中加入水回流提取，过滤，获得三次提取液；将一次提取液、二次提取液和三次提取液合并，静置，弃沉淀，收集上清液，减压浓缩，得甘草提取物；
(2)准备粪肠球菌一级发酵用MRS液体培养基，灭菌；
(3)准备二级菌种用培养基和发酵用培养基：取蔗糖，酵母膏，鱼粉，番茄汁，微量元素溶液，水，甘草提取物；其中微量元素溶液由MgSO4〃7H2O、MnSO4〃4H2O、ZnSO4〃7H2O所组成；
将上述的物料调pH值至6.8～7.5，灭菌；
(4)粪肠球菌保存菌种复苏传2代，用MRS液体培养基洗下菌苔，加入到冷却的一级菌种瓶中，发酵培养，得一级菌种；
一级菌种接种灭菌好的二级种子罐，培养，得二级菌种；
(5)将二级菌种接种到发酵罐进行培养，在pH值降至5.5～5.7时，在搅拌的同时流加氨水调节发酵罐内的pH值，发酵结束前停止添加氨水；
(6)在(5)中获得的发酵液中加入5％的糊精溶解，用冷却水降温，喷雾干燥；收集粪肠球菌干燥菌粉。
优选的，(1)在1份甘草饮片加入7份水回流提取50min，过滤，获得一次提取液和一次滤渣；再在一次滤渣中加入5份水回流提取50min，过滤，获得二次提取液和二次滤渣；最后在二次滤渣中加入5份水回流提取50min，过滤，收集三次提取液；将一次提取液、二次提取液和三次提取液合并，静置4～6h，弃沉淀，收集上清液，减压浓缩至其重量的50～60％，得甘草提取物。
优选的，(2)准备粪肠球菌一级发酵用MRS液体培养基1L，于121℃灭菌20min。
优选的，(3)准备二级菌种用培养基和发酵用培养基：二级菌种用培养基为100L，发酵用培养基为4300L；蔗糖1.5，酵母膏0.4份，鱼粉1.8份，番茄汁5～10份，微量元素溶液1份，水85～90份，甘草提取物2～10份；微量元素溶液组成为MgSO4〃7H2O 0.5％，MnSO4〃4H2O2％，ZnSO4〃7H2O 0.5％；10％氢氧化钠调pH值至6.8～7.5，于121℃灭菌20min。
优选的，(4)粪肠球菌保存菌种复苏传2代，用MRS液体培养基洗下菌苔，加入冷却至36.0～39.0℃的一级菌种瓶，于37.5±1℃培养16h，发酵4h后每2h震摇培养瓶一次，每次1min；得一级菌种；将一级菌种接种于灭菌好的二级种子罐，于37.5±1℃培养16h，发酵4h后每2h开搅拌一次，每次1min，得二级菌种。
优选的，(5)在发酵罐中加入(3)中的发酵用培养基，然后将二级菌种接种至发酵罐进行培养，发酵条件与(4)中的二级菌种培养条件相同，培养20～24h，当pH值降至5.5～5.7时，在搅拌的同时流加质量浓度为12.5％氨水将发酵罐内pH值调至6.8～7.5；发酵结束前3小时停止添加氨水。
优选的，(6)发酵液加入质量浓度为5％糊精溶解，用冷却水降温至16-18℃,于进风温度165～175℃、出风温度70～80℃的条件下进行喷雾干燥。
优选的，上述适用于粪肠球菌増菌的培养方法，包括以下的步骤：(1)在1份甘草饮片加入7份水回流提取50min，过滤，收集一次提取液；再在滤渣中加入5份水回流提取50min，过滤，获得二次提取液和二次滤渣；最后在二次滤渣中加入5份水回流提取50min，过滤，获得三次提取液，合并这三次收集的提取液，静置4～6h，弃沉淀，收集上清液，减压浓缩至其重量的50～60％，得甘草提取物；
(2)准备粪肠球菌一级发酵用MRS液体培养基1L，于121℃灭菌20min；
(3)准备二级菌种用和发酵用培养基，分别为100L和4300L，配方为：蔗糖1.5份，酵母膏0.4份，鱼粉1.8份，番茄汁5～10份，微量元素溶液1份，水85～90份，甘草提取物2～10份；微量元素溶液组成为MgSO4〃7H2O 0.5％，MnSO4〃4H2O 2％，ZnSO4〃7H2O0.5％，10％氢氧化钠调pH值至6.8～7.5，于121℃灭菌20min；
(4)粪肠球菌保存菌种复苏传2代，用MRS液体培养基洗下菌苔，加入冷却至36.0～39.0℃的一级菌种瓶，于37.5±1℃培养16h，发酵4h后每2h震摇培养瓶一次，每次1min；得一级菌种；将一级菌种接种于灭菌好的二级种子罐，于37.5±1℃培养16h，发酵4h后每2h开搅拌一次，每次1min，得二级菌种；
(5)在发酵罐中加入(3)中的发酵用培养基，然后将二级菌种接种至发酵罐进行培养，发酵条件与(4)中的二级菌种培养条件相同，培养20～24h，当pH值降至5.6时，在搅拌的同时流加质量浓度为12.5％氨水将发酵罐内pH值调至6.8～7.5；发酵结束前3小时停止添加氨水；
(6)发酵液加入质量浓度为5％的糊精溶解，用冷却水降温至16～18℃,于进风温度165～175℃、出风温度70～80℃的条件下进行喷雾干燥。
本发明的有益效果在于：液体培养基添加甘草提取物后，使发酵菌量较常规方式提高了约60％，菌量由原来的50～60亿CFU/ml提升至约80～100亿CFU/ml，产品收率达到94左右％，且产品质量稳定。本发明的方法可有效提高粪肠球菌规模化发酵水平，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。
实施例1
适用于粪肠球菌増菌的培养方法，包括以下的步骤：
(1)在1份甘草饮片加入7份水回流提取50min，过滤，收集一次提取液；再在滤渣中加入5份水回流提取50min，过滤，获得二次提取液和二次滤渣；最后在二次滤渣中加入5份水回流提取50min，过滤，获得三次提取液，合并这三次收集的提取液，静置5h左右，弃沉淀，收集上清液，减压浓缩至其重量的55％左右，得甘草提取物；
(2)准备粪肠球菌一级发酵用MRS液体培养基1L，于121℃灭菌20min；
(3)准备二级菌种用和发酵用培养基：分别为100L和4300L，配方为：蔗糖1.5份，酵母膏0.4份，鱼粉1.8份，番茄汁8份，微量元素溶液1份，水90份，甘草提取物8份；微量元素溶液组成为MgSO4〃7H2O 0.5％，MnSO4〃4H2O 2％，ZnSO4〃7H2O 0.5％，10％氢氧化钠调pH值至7.0，于121℃灭菌20min；
(4)粪肠球菌保存菌种复苏传2代，用MRS液体培养基洗下菌苔，加入冷却至38℃的一级菌种瓶，于37.5℃培养16h，发酵4h后每2h震摇培养瓶一次，每次1min；得一级菌种；将一级菌种接种于灭菌好的二级种子罐，于37.5±1℃培养17h，发酵4h后每2h开搅拌一次，每次1min，得二级菌种；
(5)在发酵罐中加入(3)中的发酵用培养基，然后将二级菌种接种至发酵罐，于37.5±1℃培养16h，发酵4h后每2h开搅拌一次，每次1min，培养24h，当pH值降至5.6时，在搅拌的同时流加质量浓度为12.5％氨水将发酵罐内pH值调至7.0左右；发酵结束前3小时停止添加氨水；
(6)发酵液加入质量浓度为5％的糊精溶解，用冷却水降温至17℃，于进风温度170℃、出风温度75℃的条件下进行喷雾干燥。
经检测，实施例1中的产品收率为94.6％，该收率是指喷雾干燥后的产品中的活菌数/喷雾干燥前发酵液中的活菌数×100％。
实施例2
适用于粪肠球菌増菌的培养方法，包括以下的步骤：
(1)在1份甘草饮片加入7份水回流提取50min，过滤，收集一次提取液；再在滤渣中加入5份水回流提取50min，过滤，获得二次提取液和二次滤渣；最后在二次滤渣中加入5份水回流提取50min，过滤，获得三次提取液，合并这三次收集的提取液，静置5h左右，弃沉淀，收集上清液，减压浓缩至其重量的60％左右，得甘草提取物；
(2)准备粪肠球菌一级发酵用MRS液体培养基1L，于121℃灭菌20min；
(3)准备二级菌种用和发酵用培养基：分别为100L和4300L，配方为：蔗糖1.5份，酵母膏0.4份，鱼粉1.8份，番茄汁8份，微量元素溶液1份，水90份，甘草提取物8份；微量元素溶液组成为MgSO4〃7H2O 0.5％，MnSO4〃4H2O 2％，ZnSO4〃7H2O 0.5％，10％氢氧化钠调pH值至7.0，于121℃灭菌20min；
(4)粪肠球菌保存菌种复苏传2代，用MRS液体培养基洗下菌苔，加入冷却至38℃的一级菌种瓶，于37.5℃培养16h，发酵4h后每2h震摇培养瓶一次，每次1min；得一级菌种；将一级菌种接种于灭菌好的二级种子罐，于37.5±1℃培养17h，发酵4h后每2h开搅拌一次，每次1min，得二级菌种；
(5)在发酵罐中加入(3)中的发酵用培养基，然后将二级菌种接种至发酵罐，于37.5±1℃培养16h，发酵4h后每2h开搅拌一次，每次1min，培养22h，当pH值降至5.6时，在搅拌的同时流加质量浓度为12.5％氨水将发酵罐内pH值调至6.8左右；发酵结束前3小时停止添加氨水；
(6)发酵液加入质量浓度为5％糊精溶解，用冷却水降温至16℃，于进风温度165℃、出风温度70℃的条件下进行喷雾干燥。
经检测，实施例2中的产品收率为93.8％。
实施例3
适用于粪肠球菌増菌的培养方法，包括以下的步骤：
(1)在1份甘草饮片加入7份水回流提取50min，过滤，收集一次提取液；再在滤渣中加入5份水回流提取50min，过滤，获得二次提取液和二次滤渣；最后在二次滤渣中加入5份水回流提取50min，过滤，获得三次提取液，合并这三次收集的提取液，静置5h左右，弃沉淀，收集上清液，减压浓缩至其重量的58％左右，得甘草提取物；
(2)准备粪肠球菌一级发酵用MRS液体培养基1L，于121℃灭菌20min；
(3)准备二级菌种用和发酵用培养基：分别为100L和4300L，配方为：蔗糖1.5份，酵母膏0.4份，鱼粉1.8份，番茄汁10份，微量元素溶液1份，水90份，甘草提取物10份；微量元素溶液组成为MgSO4〃7H2O 0.5％，MnSO4〃4H2O 2％，ZnSO4〃7H2O 0.5％；10％氢氧化钠调pH值至7.5，于121℃灭菌20min；
(4)粪肠球菌保存菌种复苏传2代，用MRS液体培养基洗下菌苔，加入冷却至39.0℃的一级菌种瓶，于38.5℃培养16h，发酵4h后每2h震摇培养瓶一次，每次1min；得一级菌种；将一级菌种接种于灭菌好的二级种子罐，于37.5±1℃培养18h，发酵4h后每2h开搅拌一次，每次1min，得二级菌种；
(5)在发酵罐中加入(3)中的发酵用培养基，然后将二级菌种接种至发酵罐，于37.5±1℃培养16h，发酵4h后每2h开搅拌一次，每次1min，培养22h，当pH值降至5.7时，在搅拌的同时流加质量浓度为12.5％氨水将发酵罐内pH值调至6.8左右；发酵结束前3小时停止添加氨水；
(6)发酵液加入质量浓度为5％糊精溶解，用冷却水降温至18℃,于进风温度175℃、出风温度80℃的条件下进行喷雾干燥。
经检测，实施例3中的产品收率为94.2％。
实施例4
关于甘草提取物对于发酵后的菌量是否有增加，本发明人采用实施例1中的发酵条件，考察不同甘草提取物添加量的情况粪肠球菌发酵水平，如下表1所示；
表1添加不同量甘草提取物的条件下粪肠球菌发酵水平
从表1中的数据可以看出，在不添加甘草提取物时，发酵菌液中的活菌含量约为5.3～5.8×109；当甘草提取物达到6％时，活菌个数达到了9.5×109；可见加入了甘草提取物之后，活菌的个数显著的增加。并且相较于背景技术中所提到的方案，本发明中的方法所获得的活菌远远的高于上述方案获得的活菌数量。
Claims (1)
1.适用于粪肠球菌増菌的培养方法，包括以下的步骤：
（1）在1份甘草饮片中加入7份水回流提取50min，过滤，获得一次提取液和一次滤渣；再在一次滤渣中加入5份水回流提取50min，过滤，获得二次提取液和二次滤渣；最后在二次滤渣中加入5份水回流提取50min，过滤，收集三次提取液；将一次提取液、二次提取液和三次提取液合并，静置5h，弃沉淀，收集上清液，减压浓缩至其重量的55%，得甘草提取物；
（2）准备粪肠球菌一级发酵用MRS液体培养基1L，于121℃灭菌20min；
（3）准备二级菌种用培养基和发酵用培养基：二级菌种用培养基为100L，发酵用培养基为4300L；所述培养基的配方如下：蔗糖1.5份，酵母膏0.4份，鱼粉1.8份，番茄汁8份，微量元素溶液1份，水90份，甘草提取物8份；微量元素溶液组成为MgSO4·7H2O 0.5%，MnSO4·4H2O2%，ZnSO4·7H2O 0.5%；10%氢氧化钠调pH值至7.0，于121℃灭菌20min；
（4）粪肠球菌保存菌种复苏传2代，用MRS液体培养基洗下菌苔，加入到冷却至38.0℃的一级菌种瓶，于37.5℃培养16h，发酵4h后每隔2h震摇培养瓶一次，每次震摇1min；得一级菌种；将一级菌种接种于灭菌好的二级种子罐，于37.5±1℃下培养17h，发酵4 h后每2 h启动一次搅拌，每次1min，得二级菌种；
（5）在发酵罐中加入（3）中的发酵用培养基，然后将二级菌种接种至发酵罐，于37.5±1℃培养16h，发酵4 h后每2 h启动一次搅拌，每次搅拌1min，培养24 h，当pH值降至5.6时，在搅拌的同时流加质量浓度为12.5%氨水将发酵罐内pH值调至7.0；发酵结束前3小时停止添加氨水；
（6）在（5）中的发酵液中加入5wt%的糊精溶解，用冷却水降温至17℃,于进风温度170℃、出风温度75℃的条件下进行喷雾干燥，获得粪肠球菌干燥菌粉。
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