CN109294960A - 一种用于粪肠球菌的发酵培养基及发酵方法 - Google Patents

一种用于粪肠球菌的发酵培养基及发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于粪肠球菌的发酵培养基及发酵方法。一种用于粪肠球菌的发酵培养基，包括以下成分：按重量份计，酵母膏2～10份、红糖5～20份、磷酸0.03～0.1份、碳酸铵0.01～0.05份、蛋白胨1～5份、复合B族维生素0.001～0.005份、吐温0.005～0.05份、水500～1000份。本发明的培养基不含非水溶性成分，因此省去了后续纯化除去非水溶性成分的处理工序，同时该培养基通过优化营养组成提高了发酵水平，同时降低了原料成本。

Description

一种用于粪肠球菌的发酵培养基及发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，尤其是涉及一种用于粪肠球菌的发酵培养基及发酵方法。
背景技术
粪肠球菌产乳酸，是乳酸菌的一种。粪肠球菌是中华人民共和国农业部2045号公告《饲料添加剂品种目录(2013)》中的一种微生物添加剂，也是目前在畜牧行业中广泛应用的一种微生物。
乳酸菌具有调节动物肠道健康，提高动物机体免疫力的功能。乳酸菌发酵工艺一直是发酵行业研究热点，如何提高发酵水平，降低生产成本，从而降低使用成本，是乳酸菌研究的主要方向之一。粪肠球菌是畜牧行业中常用的一种乳酸菌，在无抗化养殖过程中扮演着重要的角色。传统的粪肠球菌发酵培养基配方，为了提高发酵液活菌数，一般含有豆粕、麸皮等非水溶性成分，对后续分离、纯化和干燥过程带了麻烦，增加了生产成本。而以MRS培养基配方为基础的清液培养基配方，原料成本较高，且发酵水平偏低。
因此，开发一种经济适用的清液发酵培养基，提高粪肠球菌发酵水平，降低浓缩干燥生产成本，具有较大的经济价值。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于粪肠球菌的发酵培养基，该培养基不含非水溶性成分，因此省去了后续纯化除去非水溶性成分的处理工序，同时该培养基通过优化营养组成提高了发酵水平，同时降低了原料成本。
本发明的第二目的在于提供一种粪肠球菌的发酵方法，该发酵方法采用流加发酵的方式，即降低了原料成本，又提高了发酵水平。
为了解决以上技术问题，本发明提供了以下技术方案：
一种用于粪肠球菌的发酵培养基，包括以下成分：
按重量份计，酵母膏2～10份、红糖5～20份、磷酸0.03～0.1份、碳酸铵0.01～0.05份、蛋白胨1～5份、复合B族维生素0.001～0.005份、吐温0.005～0.05份、水500～1000份。
本发明提供的上述发酵培养基主要用于粪肠球菌的生产罐培养，由酵母膏、红糖、磷酸、碳酸铵、蛋白胨、复合B族维生素和吐温七种主要原料组成，这七种主要原料均为水溶性的，因此本发明的发酵培养基属于清液培养基，不存在后续纯化除非水溶性原料的工序。
另外，本发明所选用的原料均为简单易得的低成本原料，因此相比传统MRS培养基原料成本低，但并没有牺牲发酵水平，甚至发酵水平显著高于传统MRS培养基，所得发酵液中粪肠球菌活菌数达到4×1010CFU/mL以上，经浓缩后达到3.5×1011CFU/mL以上，发酵终止时测得的OD600达到39以上。
综上，本发明的培养基集合了成本低、发酵水平高、工序简单等诸多优点。
以上发酵培养基还可以进一步改进，具体如下。
优选地，所述发酵培养基的pH值为7.5～7.7或6.0～6.5。
pH值为7.5～7.7的发酵培养基主要适用于种子液初步接种时的环境，pH值为6.0～6.5的发酵培养基主要适用于粪肠球菌发酵过程中的环境。
优选地，所述蛋白胨为骨蛋白胨。
优选地，按重量份计，酵母膏2～8份、红糖5～20份、磷酸0.03～0.06份、碳酸铵0.02～0.05份、蛋白胨1～3份、复合B族维生素0.001～0.003份、吐温0.005～0.03份、水700～1000份。
优选地，按重量份计，酵母膏2～8份、红糖10～20份、磷酸0.03～0.06份、碳酸铵0.02～0.05份、蛋白胨1～3份、复合B族维生素0.001～0.003份、吐温0.005～0.03份、水1000份。
本发明中的所述复合B族维生素可采用常规的任意复合B族维生素，例如市购或现配。
另外，本发明还提供了粪肠球菌的发酵方法，包括下列步骤：
将粪肠球菌的种子液接种于上文所述的发酵培养基中，发酵培养。
优选地，所述种子液的接种量为：按重量份计，每500～1000份所述发酵培养基接种8～12份，优选接种8～10份。
优选地，所述发酵培养的条件为：发酵温度30～38℃，进气量0.5～1.5VVM，发酵过程中调节发酵液的pH为6.0～6.5。
发酵培养的条件与培养基的配方对粪肠球菌的发酵培养同等重要，经过筛选，利用本发明提供的培养基时，温度30～38℃、进气量0.5～1.5VVM、pH为6.0～6.5的发酵条件更利于粪肠球菌的快速、大量繁殖；换言之，培养基与培养条件配合能获得更高的产率。
优选地，发酵温度为35～37℃。
优选地，进气量为1～1.5VVM。
优选地，发酵过程中调节发酵液的pH为6.0～6.3。
优选地，所述发酵过程中调节发酵液的pH的方法为：用氨水调节。
优选地，在所述发酵培养开始5.5～8小时后(优选5.5～6.5小时后)，每隔10～15min流加一次红糖溶液。
分批流加红糖溶液可以及时补充粪肠球菌繁殖所需的营养，避免一次性加入过多影响后导致供氧不足的问题，还能避免后期生长过程中营养不足导致生长速率降低的问题。
优选地，所述红糖溶液的浓度为30wt％～50wt％，优选40wt％～50wt％。
优选地，所述发酵培养的时长为18～24小时。
优选地，所述发酵培养过程中全程流加的所述红糖溶液量为50-100份；
更优选地，所述发酵培养过程中全程流加的所述红糖溶液量为60-75份。优选地，所述种子液的接种量为：按重量份计，每500～1000份所述发酵培养基接种8～12份，优选接种8～10份。
优选地，所述种子液为经过两级扩培后的种子液，所述两级扩培的方法为：
按重量份计，在主要由葡萄糖0.5～1.5份、酵母膏1.5～4.5份、蛋白胨0.5～1.5份和90～100份水组成的pH7.0～7.5的培养基中接入0.5～1.5％的粪肠球菌贮存种子液，摇床培养15～20小时，得到一级种子液；
在主要由酵母膏1.5～2.5份、红糖15～25份、蛋白胨4～6份和水700～1100份组成的pH 7.5～7.7的培养基中接入0.5～1.5％的所述一级种子液，通气搅拌培养，通气量为0.05～0.07VVM，培养12～15小时后，pH自然降至3.5～4.0，得到二级种子液。
优选地，在所述发酵培养后进行离心浓缩：离心机进液压力0.15～0.25MPa，离心机转速5800～5900r/min。
优选地，所述种子液为经过两级扩培后的种子液，所述两级扩培的方法为：
按重量份计，在主要由葡萄糖0.5～1份、酵母膏3～4.5份、蛋白胨0.5～1份和95～100份水组成的pH7.0～7.5的培养基中接入1～1.5％的粪肠球菌贮存种子液，摇床培养15～20小时，得到一级种子液；
在主要由酵母膏2～2.5份、红糖15～20份、蛋白胨5～6份和水700～900份组成的pH 7.5～7.7的培养基中接入1～1.5％的所述一级种子液，通气搅拌培养，通气量为0.05～0.07VVM，培养12～15小时后，pH自然降至3.5～4.0，得到二级种子液。
以上扩培方法与本发明的发酵培养方法相配合能达到更好的效果。
另外，在以上所述过程中，若涉及移种发酵，需预先对培养基高温灭菌。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
(1)通过优化粪肠球菌发酵培养基的配方降低了培养基成本以及提高了菌产量；
(2)通过优化发酵培养的条件以及扩培条件进一步提高了菌产量。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
(1)制取一级种子液
按重量份数配，称取葡萄糖1份，酵母膏3份，蛋白胨1份，溶解于95份水中，用氢氧化钠调pH7.0～7.5，115℃蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃，接入1wt％的粪肠球菌贮存种子液。置于摇床中，振荡摇瓶培养15～20小时，即为一级种子液。
(2)制取二级种子液
按重量份数配，称取酵母膏2份、红糖20份、骨蛋白胨5份、水900份，加到种子发酵罐中。用NaOH调pH至7.5～7.7。115～118℃，蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃，接入1wt％一级种子液，通气培养，通气量为0.05VVM，搅拌转速为100r/min，培养温度为37±0.5℃，培养12小时，pH自然降至4.0，移种至生产罐中。
(3)生产罐培养
按重量份数配，生产罐培养基为酵母膏2份、红糖5份、磷酸0.03份、碳酸铵0.01份、骨蛋白胨1份、复合B族维生素0.001份、吐温0.005份，水1000份。用NaOH调pH至7.5～7.7。115～118℃，蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃后，移种(接种量10份)，开始发酵。进气量1VVM，搅拌转速150r/min，培养温度为37±0.5℃。培养6小时开始，流加浓度为50％的红糖溶液(每次加量为1份)，每小时流加5次，全程共流加60份。发酵过程中，通过流加氨水，调节pH6.0～6.5。
发酵培养18小时，取样检测OD600，OD值达到60以上，结束发酵，检测发酵液中粪肠球菌活菌数为6.2×1010CFU/mL以上。发酵液用碟片式离心机进行离心浓缩，离心机进液压力0.15～0.25MPa，离心机转速5800～5900r/min，浓缩后，浓缩液中粪肠球菌活菌数达到5.4×1011CFU/mL以上。浓缩液加入20％淀粉，搅拌均匀后后进喷塔，喷雾干燥，获得干粉中活菌数为9.23×1011CFU/mL。
实施例2
(1)制取一级种子液
按重量份数配，称取葡萄糖1份，酵母膏3份，蛋白胨1份，溶解于95份水中，用氢氧化钠调pH7.0～7.5，115℃蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃，接入1wt％的粪肠球菌贮存种子液。置于摇床中，振荡摇瓶培养15～20小时，即为一级种子液。
(2)制取二级种子液
按重量份数配，称取酵母膏2份、红糖20份、骨蛋白胨5份、水900份，加到种子发酵罐中。用NaOH调pH至7.5～7.7。115～118℃，蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃，接入1wt％一级种子液，通气培养，通气量为0.05VVM，搅拌转速为100r/min，培养温度为37±0.5℃，培养12小时，pH自然降至4.0，移种至生产罐中。
(3)生产罐培养
按重量份数配，生产罐培养基为酵母膏10份、红糖20份、磷酸0.1份、碳酸铵0.05份、骨蛋白胨5份、复合B族维生素0.005份、吐温0.05份，水1000份。用NaOH调pH至7.5～7.7。115～118℃，蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃后，移种(接种量10份)，开始发酵。进气量1VVM，搅拌转速150r/min，培养温度为37±0.5℃。培养6小时开始，流加浓度为50％的红糖溶液(每次加量为1份)，每小时流加5次，全程共流加60份。发酵过程中，通过流加氨水，调节pH6.0～6.5。
发酵培养18小时，取样检测OD600，OD值达到48，结束发酵，检测发酵液中粪肠球菌活菌数为4.5×1010CFU/mL以上。发酵液用碟片式离心机进行离心浓缩，离心机进液压力0.15～0.25MPa，离心机转速5800～5900r/min，浓缩后，浓缩液中粪肠球菌活菌数达到3.6×1011CFU/mL以上。浓缩液加入20％淀粉，搅拌均匀后后进喷塔，喷雾干燥，获得干粉中活菌数为6.13×1011CFU/mL。
实施例3
(1)制取一级种子液
按重量份数配，称取葡萄糖1份，酵母膏3份，蛋白胨1份，溶解于95份水中，用氢氧化钠调pH7.0～7.5，115℃蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃，接入1wt％的粪肠球菌贮存种子液。置于摇床中，振荡摇瓶培养15～20小时，即为一级种子液。
(2)制取二级种子液
按重量份数配，称取酵母膏2份、红糖20份、骨蛋白胨5份、水900份，加到种子发酵罐中。用NaOH调pH至7.5～7.7。115～118℃，蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃，接入1wt％一级种子液，通气培养，通气量为0.05VVM，搅拌转速为100r/min，培养温度为37±0.5℃，培养12小时，pH自然降至4.0，移种至生产罐中。
(3)生产罐培养
按重量份数配，生产罐培养基为酵母膏8份、红糖10份、磷酸0.06份、碳酸铵0.02份、骨蛋白胨3份、复合B族维生素0.003份、吐温0.03份，水1000份。用NaOH调pH至7.5～7.7。115～118℃，蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃后，移种(接种量1wt％)，开始发酵。进气量1VVM，搅拌转速150r/min，培养温度为37±0.5℃。培养6小时开始，流加浓度为50％的红糖溶液(每次加量为0.5份)，每小时流加5次，全程共流加60份。发酵过程中，通过流加氨水，调节pH6.0～6.5。
发酵培养18小时，取样检测OD600，OD值达到39，结束发酵，检测发酵液中粪肠球菌活菌数为4×1010CFU/mL以上。发酵液用碟片式离心机进行离心浓缩，离心机进液压力0.15～0.25MPa，离心机转速5800～5900r/min，浓缩后，浓缩液中粪肠球菌活菌数达到3×1011CFU/mL以上。浓缩液加入20％淀粉，搅拌均匀后后进喷塔，喷雾干燥，获得干粉中活菌数为5×1011CFU/mL。
实施例4
(1)制取一级种子液
按重量份数配，称取葡萄糖1份，酵母膏3份，蛋白胨1份，溶解于95份水中，用氢氧化钠调pH7.0～7.5，115℃蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃，接入1wt％的粪肠球菌贮存种子液。置于摇床中，振荡摇瓶培养15～20小时，即为一级种子液。
(2)制取二级种子液
按重量份数配，称取酵母膏2份、红糖20份、骨蛋白胨5份、水900份，加到种子发酵罐中。用NaOH调pH至7.5～7.7。115～118℃，蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃，接入1wt％一级种子液，通气培养，通气量为0.05VVM，搅拌转速为100r/min，培养温度为37±0.5℃，培养12小时，pH自然降至4.0，移种至生产罐中。
(3)生产罐培养
按重量份数配，生产罐培养基为酵母膏2份、红糖5份、磷酸0.03份、碳酸铵0.01份、骨蛋白胨1份、复合B族维生素0.001份、吐温0.005份，水1000份。用NaOH调pH至7.5～7.7。115～118℃，蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃后，移种(接种量1wt％)，开始发酵。进气量1VVM，搅拌转速150r/min，培养温度为37±0.5℃。培养8小时开始，流加浓度为50％的红糖溶液(每次加量为1份)，每小时流加5次，全程共流加60份。发酵过程中，通过流加氨水，调节pH6.0～6.5。
发酵培养18小时，取样检测OD600，OD值达到52，结束发酵，检测发酵液中粪肠球菌活菌数为5.1×1010CFU/mL以上。发酵液用碟片式离心机进行离心浓缩，离心机进液压力0.15～0.25MPa，离心机转速5800～5900r/min，浓缩后，浓缩液中粪肠球菌活菌数达到4.9×1011CFU/mL以上。浓缩液加入20％淀粉，搅拌均匀后后进喷塔，喷雾干燥，获得干粉中活菌数为8.2×1011CFU/mL。
实施例5
(1)制取一级种子液
按重量份数配，称取葡萄糖1份，酵母膏3份，蛋白胨1份，溶解于95份水中，用氢氧化钠调pH7.0～7.5，115℃蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃，接入1wt％的粪肠球菌贮存种子液。置于摇床中，振荡摇瓶培养15～20小时，即为一级种子液。
(2)制取二级种子液
按重量份数配，称取酵母膏2份、红糖20份、骨蛋白胨5份、水900份，加到种子发酵罐中。用NaOH调pH至7.5～7.7。115～118℃，蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃，接入1wt％一级种子液，通气培养，通气量为0.05VVM，搅拌转速为100r/min，培养温度为37±0.5℃，培养12小时，pH自然降至4.0，移种至生产罐中。
(3)生产罐培养
按重量份数配，生产罐培养基为酵母膏2份、红糖5份、磷酸0.03份、碳酸铵0.01份、骨蛋白胨1份、复合B族维生素0.001份、吐温0.005份，水1000份。用NaOH调pH至7.5～7.7。115～118℃，蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃后，移种(接种量1wt％)，开始发酵。进气量1VVM，搅拌转速150r/min，培养温度为37±0.5℃。培养6小时开始，流加浓度为40％的红糖溶液(每次加量为1份)，每小时流加5次，全程共流加60份。发酵过程中，通过流加氨水，调节pH6.0～6.5。
发酵培养18小时，取样检测OD600，OD值达到45，结束发酵，检测发酵液中粪肠球菌活菌数为4.75×1010CFU/mL以上。发酵液用碟片式离心机进行离心浓缩，离心机进液压力0.15～0.25MPa，离心机转速5800～5900r/min，浓缩后，浓缩液中粪肠球菌活菌数达到3.5×1011CFU/mL以上。浓缩液加入20％淀粉，搅拌均匀后后进喷塔，喷雾干燥，获得干粉中活菌数为6.5×1011CFU/mL。
对比例1
(1)制取一级种子液
按重量份数配，称取葡萄糖1份，酵母膏3份，蛋白胨1份，溶解于95份水中，用氢氧化钠调pH7.0～7.5，115℃蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃，接入1wt％的粪肠球菌贮存种子液。置于摇床中，振荡摇瓶培养15～20小时，即为一级种子液。
(2)制取二级种子液
按重量份数配，称取酵母膏2份、红糖20份、骨蛋白胨5份、水900份，加到种子发酵罐中。用NaOH调pH至7.5～7.7。115～118℃，蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃，接入1wt％一级种子液，通气培养，通气量为0.05VVM，搅拌转速为100r/min，培养温度为37±0.5℃，培养12小时，pH自然降至4.0，移种至生产罐中。
(3)生产罐培养
按照传统MRS培养基配方配制，蛋白胨10份，牛肉膏10份，酵母膏5份，柠檬酸氢二铵2份，葡萄糖20份，吐温(80)1份，乙酸钠5份，磷酸氢二钾2份，硫酸镁0.58份，硫酸锰0.25份，水1000份，用氢氧化钠调pH6.2～6.6。115～118℃，蒸汽灭菌20分钟。降温至37℃后，移种(接种量1wt％)，开始发酵。进气量1VVM，搅拌转速150r/min，培养温度为37±0.5℃。培养6小时开始，流加浓度为50％的红糖溶液(每次加量为1份)，每小时流加5次，全程共流加60份。发酵过程中，通过流加氨水，调节pH6.0～6.5。
发酵培养18小时，取样检测OD600，OD值达到12，结束发酵，检测发酵液中粪肠球菌活菌数为9.6×109CFU/mL以上。发酵液用碟片式离心机进行离心浓缩，离心机进液压力0.15～0.25MPa，离心机转速5800～5900r/min，浓缩后，浓缩液中粪肠球菌活菌数达到8.95×1010CFU/mL以上。浓缩液加入20％淀粉，搅拌均匀后后进喷塔，喷雾干燥，获得干粉中活菌数为1.25×1011CFU/mL。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种用于粪肠球菌的发酵培养基，其特征在于，包括以下成分：
按重量份计，酵母膏2～10份、红糖5～20份、磷酸0.03～0.1份、碳酸铵0.01～0.05份、蛋白胨1～5份、复合B族维生素0.001～0.005份、吐温0.005～0.05份、水500～1000份；优选地，所述蛋白胨为骨蛋白胨。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的pH值为7.5～7.7或6.0～6.5。
3.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，按重量份计，酵母膏2～8份、红糖5～20份、磷酸0.03～0.06份、碳酸铵0.02～0.05份、蛋白胨1～3份、复合B族维生素0.001～0.003份、吐温0.005～0.03份、水700～1000份。
4.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，按重量份计，酵母膏2～8份、红糖10～20份、磷酸0.03～0.06份、碳酸铵0.02～0.05份、蛋白胨1～3份、复合B族维生素0.001～0.003份、吐温0.005～0.03份、水1000份。
5.粪肠球菌的发酵方法，其特征在于，包括下列步骤：
将粪肠球菌的种子液接种于权利要求1-4任一项所述的发酵培养基中，发酵培养；
优选地，所述种子液的接种量为：按重量份计，每500～1000份所述发酵培养基接种8～12份，优选接种8～10份；
优选地，所述发酵培养的条件为：发酵温度30～38℃，进气量0.5～1.5VVM，发酵过程中调节发酵液的pH为6.0～6.5；
优选地，所述发酵过程中调节发酵液的pH的方法为：用氨水调节。
6.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，在所述发酵培养开始5.5～8小时后，每隔10～15min流加一次红糖溶液；
优选地，所述红糖溶液的浓度为30wt％～50wt％，优选40wt％～50wt％。
7.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养的时长为18～24小时。
8.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养过程中全程流加的所述红糖溶液量为50-100份；
优选地，所述发酵培养过程中全程流加的所述红糖溶液量为60-75份。
9.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，所述种子液为经过两级扩培后的种子液，所述两级扩培的方法为：
按重量份计，在主要由葡萄糖0.5～1.5份、酵母膏1.5～4.5份、蛋白胨0.5～1.5份和90～100份水组成的pH7.0～7.5的培养基中接入0.5～1.5％的粪肠球菌贮存种子液，摇床培养15～20小时，得到一级种子液；
在主要由酵母膏1.5～2.5份、红糖15～25份、蛋白胨4～6份和水700～1100份组成的pH7.5～7.7的培养基中接入0.5～1.5％的所述一级种子液，通气搅拌培养，通气量为0.05～0.07VVM，培养12～15小时后，pH自然降至3.5～4.0，得到二级种子液。
10.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，在所述发酵培养后进行离心浓缩：离心机进液压力0.15～0.25MPa，离心机转速5800～5900r/min。
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