CN109593797A - 一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种发酵生产γ‑氨基丁酸的方法，其包括大肠杆菌菌种活化、种子液进行入罐接种、发酵培养；发酵培养采用的发酵培养基包括：酵母浸粉15‑30g/L；蛋白胨10‑20g/L；L‑谷氨酸钠0.1‑0.5g/L；甘油1‑6g/L；三氯化铁0.5‑1g/L；其中，在发酵培养过程中的诱导培养采用：维生素B6 0.5‑1mmol/L；PLP 20‑30g/L；乳糖1‑3g/L；IPTG 5‑12g/L；并且对活化、接种、发酵过程的温度及PH均进行优化。本发明采用甘油代替葡萄糖作为碳源，可有效减少抑制性代谢性产物乙酸的累积，有利于高密度发酵；在发酵培养基中添加铁离子可以促进大肠杆菌生长，降低乙酸生成量；在不同的培养阶段采用不同的PH值提高产量，恒定PH条件下蛋白量提高了5％。本发明通过上述培养条件的优化，可有效提高γ‑氨基丁酸的产量。

Description

一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法

技术领域

本发明属于菌种发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)是一种重要的抑制性神经递质，它参与多种代谢活动，具有很高的生理活性。目前广泛应用于食品工业、饲料添加剂、医药领域中。GABA的制备方法主要有化学合成法和生物合成法两种，化学合成法成本较高，得率较低，并且在生产工艺中使用危险溶剂，甚至是有毒溶剂，因此化学合成法制备的GABA不能用于食品，也不能作为一种天然的食品添加剂，生物合成法相对而言是一种既安全又经济的方法。动、植物组织中GABA的含量都较低，例如豆叶中的GABA含量仅为0.04μg/g鲜重，因而从动、植物体内直接提取GABA并作为食品配料的可行性不大，其原因主要是因为GABA存量少并且分离困难。生物合成法中大肠杆菌是发酵生产GABA最常用的菌株，发酵培养基为麸皮水解液、玉米浆、蛋白胨、矿物质等，在发酵过程中，利用大肠杆菌脱羧酶的作用，将L-谷氨酸转化为GABA，再分离、纯化获得GABA制品。

影响微生物发酵GABA产量都包括内因和外因，内因是代谢机制，外因是代谢条件，因此GABA支路代谢机制和代谢条件是GABA制备的决定因素。代谢条件显著影响GABA的制备速度和产率。而采用目前的培养发酵条件，大肠杆菌发酵生产GABA的产量都达不到理想的收率。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，从培养基(氮源、碳源)、大肠杆菌菌种培养条件、PH值、温度、发酵条件等方面出发，对培养基及各培养条件进行优化，以高效生产γ-氨基丁酸。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其包括大肠杆菌菌种活化、种子液进行入罐接种、发酵培养；

其中，所述发酵培养采用的发酵培养基包括如下组分及含量：酵母浸粉15-30g/L；蛋白胨10-20g/L；L-谷氨酸钠0.1-0.5g/L；甘油1-6g/L；三氯化铁0.5-1g/L。

为了进一步优化上述发酵生产γ-氨基丁酸的方法，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述发酵培养包括：清洗发酵罐；空罐灭菌；将种子液移入发酵罐，并进行诱导培养；培养物进行分离、纯化获得GABA制品。

进一步地，在发酵培养过程中的诱导培养采用如下组分：维生素B6 0.5-1mmol/L；PLP 20-30g/L；乳糖1-3g/L；IPTG 5-12g/L。

进一步地，所述发酵培养基中还加入分消后的磷酸二氢钾15-25g/L；磷酸氢二钾90-120g/L。

进一步地，所述发酵罐用培养基的PH为4.5-8。

进一步地，所述大肠杆菌菌种活化包括：制备活化用培养基，灭菌倒平板，凝固备用，制得菌种活化平板；制备接种用培养基，灭菌，挑取生长正常旺盛的单一菌落至接种用培养基内接种，制备种子液。

进一步地，所述活化用培养基的组成为：氯化钠5-12g/L；酵母浸粉3-10g/L；蛋白胨5-15g/L；琼脂粉3-10g/L；所述接种用培养基的组成为：氯化钠5-12g/L；酵母浸粉3-10g/L；蛋白胨3-8g/L；其中，所述活化用培养基和接种用培养基的PH均为5.1-7.2，培养温度均为30℃-38℃。

进一步地，所述种子液进行入罐接种包括：种子罐实罐灭菌，取出种子液进行镜检、PH、OD值测定，各指标正常，入种子罐接种。

进一步地，所述种子液入罐前在600nm条件下测定的OD值为0.8-2.5，利用PH测定仪直接测定的PH值为5-8。

进一步地，所述种子罐用培养基的组成为：酵母浸粉15-30g/L；蛋白胨10-20g/L；氯化钠：5-12g/L；甘油1-6g/L；三氯化铁0.5-1g/L。

进一步地，所述种子罐用培养基的PH为5-8。

本发明通过对下述影响微生物发酵制备GABA的因素进行优化：

1)PH值；

PH值影响谷氨酸脱羧酶的活性，影响细胞膜的电荷和渗透性及外界条件的电位和物理性质；

2)辅酶、抑制剂等；

磷酸吡哆醛(PLP)是谷氨酸脱羧酶的辅酶，能促进谷氨酸脱羧酶的作用，但使用成本较高，也可以加入维生素B6(0.5mmol/L)可以使GABA产量提高20％左右。抑制剂有如巯基乙醇，二硫苏糖醇，半胱氨酸和对氯高贡苯甲酸等物质，这类物质会影响谷氨酸脱羧酶的活性，从而降低GABA的产量。

3)温度；

温度主要影响酶和微生物的活性及代谢，因此温度必然影响生物代谢GABA的能力；

4)溶氧；

合适的谷氨酸浓度可以提高GABA支路碳流量，从而促进GAD活性，但前体过多对微生物生长有抑制作用，浓度高时会产生毒性。一般主要是增加前体物质和营养物质以及无机盐等。利用纯谷氨酸作为前体成本较高，一般添加谷氨酸衍生物如谷氨酸钠或含谷氨酸丰富的其它代谢产物，如米糠、茶叶、桑叶。

5)发酵培养基的成分对GABA产量的影响

碳源的选择对发酵的影响；氮源的选择对发酵的影响。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

本发明通过对上述大肠杆菌的碳源进行优化，大肠杆菌利用葡萄糖生长快，是发酵中最常用的碳源，但过量时容易导致生长速率过快，导致葡萄糖效应，产生乙酸等副代谢产物。而本发明采用甘油代替葡萄糖作为碳源，可以有效减少抑制性代谢性产物乙酸的累积，有利于高密度发酵；

微量元素对微生物的生长起很大的作用，其中亚铁离子对微生物的生理有显著的影响，而本发明在发酵培养基中添加铁离子可以促进大肠杆菌生长，降低乙酸生成量。

PH对大肠杆菌的生长重组蛋白的表达以及重组蛋白影响很大，本发明在不同的培养阶段采用不同的PH值可以提高产量，恒定PH条件下蛋白量提高了5％。

本发明对各培养条件进行综合调整及优化，使得GABA产量提高，易于推广应用。

具体实施方式

本发明提供一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其包括大肠杆菌菌种活化、种子液进行入罐接种、发酵培养；其中，所述发酵培养采用的发酵培养基包括如下组分及含量：酵母浸粉15-30g/L；蛋白胨10-20g/L；L-谷氨酸钠0.1-0.5g/L；甘油1-6g/L；三氯化铁0.5-1g/L。

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例研究大肠杆菌优化碳源对其发酵生产γ-氨基丁酸的影响。

大肠杆菌利用葡萄糖生长快，是发酵中最常用的碳源，但过量时容易导致生长速率过快，导致葡萄糖效应，产生乙酸等副代谢产物。甘油代替葡萄糖作为碳源，可以有效减少抑制性代谢性产物乙酸的累积，有利于高密度发酵。

发酵罐中培养基配置加入甘油替代葡萄糖：

(通过取样测PH值观察乙酸的变化：乙酸的生成会导致PH下降)

原料名称	含量kg/1000L	PH	γ-氨基丁酸含量
				甘油	1-6	6-8	50-70％
葡萄糖	1-6	4-6	40-65％

实施例2

本实施例研究微量元素对其发酵生产γ-氨基丁酸的影响。

微量元素对微生物的生长起很大的作用，其中亚铁离子对微生物的生理有显著的影响，在培养基中添加铁离子可以促进大肠杆菌生长，降低乙酸生成量。

(通过取样测PH值观察乙酸的变化：乙酸的生成会导致PH下降)

原料名称	含量kg/1000L	PH	γ-氨基丁酸含量
				三氯化铁	0.5-1	6-8	50-70％
未添加	-	4-6	40-65％

实施例3

本实施例研究PH对其发酵生产γ-氨基丁酸的影响。

不同培养阶段采用不同PH值：

PH对大肠杆菌的生长重组蛋白的表达以及重组蛋白影响很大，在不同的培养阶段采用不同的PH值可以提高产量，恒定PH条件下蛋白量提高了5％。

大肠杆菌活化：培养基(固体/液体)PH：5.1-7.2；

种子液PH：5-8；

发酵罐PH：5-8。

名称	PH	蛋白含量g/L	γ-氨基丁酸含量
				种子液	5-8
发酵罐18-24h	5-8	1g/L	60-75％
				现有技术18-24h	4.5-8	0.73g/L	50-60％

实施例4

本实施例为在发酵生产γ-氨基丁酸的方法中采用的较佳的培养基。

其采用的培养基及培养条件如下：

(1)大肠杆菌菌种活化

a)活化用培养基制备：(1000ml)

组份	含量g/L
			氯化钠	5-12	提供无机盐
酵母浸粉	3-10	主要提供生长因子
			蛋白胨	5-15	提供大肠杆菌的氮源、碳源需求
琼脂粉	3-10

PH5.1-7.2，121℃灭菌20min。倒平板，凝固备用，制得菌种活化平板。

b)接种用培养基制备(1000ml)

组份	含量g/L
			氯化钠	5-12	提供无机盐
酵母浸粉	3-10	主要提供生长因子
			蛋白胨	3-8	提供大肠杆菌的氮源、碳源需求

PH 5.1-7.2，121℃灭菌20min。

取种子划线平板,并用接种环挑取生长正常旺盛的单一菌落至培养液内接种，30℃-38℃培养。

(2)种子液进行入罐接种：

取出种子液进行镜检、PH、OD值测定。各指标正常即可入种子罐接种。

OD：在600nm条件下测定其OD值(0.8-2.5)

PH：利用PH测定仪直接测定(5-8)

(3)发酵工序：

a)检查种子罐、补料罐、发酵罐的密封性、搅拌、温度等各项参数是否正常；

b)清洗罐；

c)空罐灭菌；

d)PH电极及OD电极校正；

其中，种子罐、分消罐、发酵罐的采用的培养基如下所示：

一、种子罐：

培养基配置：

原料名称	含量(g/L)
		酵母浸粉	15-30
蛋白胨	10-20
		氯化钠	5-12
甘油	1-6g/L
		三氯化铁	0.5-1g/L
PH	5-8

实罐灭菌；

接种：将成熟种子液倒入进行接种，培养条件温度28℃-37℃，发酵过程PH5-8。

二、分消罐：

直接混合灭菌某些离子在高温下发生不可逆反应导致沉淀产生，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾需与其它培养基分开灭菌。

培养基组成：

灭菌条件：121℃灭菌25min。

三、发酵罐：

培养基配置：

原料名称	含量kg/1000L
		酵母浸粉	15-30
蛋白胨	10-20
		L-谷氨酸钠	0.1-0.5
水
		甘油	1-6
三氯化铁	0.5-1
		PH	4.5-8

发酵诱导：诱导培养：

原料名称	含量g/L
		维生素B6	0.5-1mmol/L
PLP	20-30
		乳糖	1-3
IPTG	5-12

实施例5

本实施例为一实际操作的较佳的发酵过程，其步骤如下：

1.发酵工艺

利用5L发酵罐作为种子罐，进行种子培养

种子罐培养基：酵母浸粉15-30g/L；蛋白胨10-20g/L；氯化钠：5-12g/L；甘油1-6g/L；三氯化铁0.5-1g/L。

5L罐中加入种子培养基后，加水至2L，种子罐中121℃灭菌25分钟，温度降至37℃接种，通气比为0.5：1，此阶段DO和PH值持续下降，发酵罐自动补加NaOH控制PH5.0-7.0；通过提高转速提高溶氧，使其不低于30％

此阶段维持12小时，生物量达30g/L左右。

利用10L发酵罐作为发酵罐，进行菌体培养。

发酵罐培养基：酵母浸粉15-30g/L；蛋白胨10-20g/L；L-谷氨酸钠0.1-0.5g/L；氯化钠：5-12g/L；甘油1-6g/L；三氯化铁0.5-1g/L；磷酸二氢钾15-25g/L；磷酸氢二钾90-120g/L；维生素B6 0.5-1mmol/L；乳糖1-3g/L；PLP 20-30g/L；IPTG 5-12g/L。

10L罐中加入发酵培养基后，加水至4L，发酵罐中121℃灭菌25分钟，温度降至37℃后将培养好的种子移种至发酵罐中，此时发酵液共6升，转速为200rpm，通气比全程保持为0.5：1，5h开始补料，初始补料65ml/L，通过提高转速提高溶氧量，使其不低于30％，发酵液中甘油含量维持在1-6g/L。

发酵罐中菌体生长迅速，此阶段时长24小时左右，生物量达80-90/L。

用纯水将离心出来的菌液溶解，依次加入磷酸氢二钾，使其浓度为：磷酸氢二钾浓度90-120g/L，磷酸二氢钾浓度15-25g/L。少量多次加入谷氨酸，使谷氨酸浓度维持在6g/L左右，PH值5-8，将转化罐升温至30-40℃，通气比2：1，200rpm搅拌下酶促转化反应15小时左右。定时检测谷氨酸含量，转化液中GABA含量达到180g/L转化液，终止转化反应。

2.纯化

将转化液加热至70℃维持5min，然后进行陶瓷膜微滤，将破碎的菌体及大部分大分子蛋白除掉，滤液用截留分子量1000的中空纤维超滤膜，超滤去除陶瓷膜滤液中残留的蛋白质及其它大分子物质。将超滤液进一步进行钠滤脱盐处理，通过纳滤将转化液中绝大部分的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾除掉。

GABA易溶于水，在水中溶解度极高，将纳滤液浓缩至GABA含量为50％后保持搅拌，室温放置12h后，晶体大量析出，此时进行抽滤，并用95％的乙醇对晶体进行洗涤，将处理好的晶体真空干燥，即得白色针状GABA成品，产品纯度达到99.5％。

对比例1

本对比例为现有技术采用的种子罐和发酵罐的培养基，现有技术中的发酵方法其发酵时间20-30小时，离心、菌液溶解，加入谷氨酸，经将转化罐搅拌下酶促转化反应12-24小时左右。定时检测谷氨酸含量；通过纳滤将转化液中绝大部分的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾除掉，析出到晶体后做干燥处理。其采用的种子罐培养基和发酵罐培养基具体如下：

1.现有技术中种子罐培养基：酵母浸粉15-30g/L；蛋白胨5-10g/L；葡萄糖1-6g/L；磷酸二氢钾2-3g/L；磷酸氢二钾3-5g/L。

本发明实施例5中使用的种子罐培养基为酵母浸粉15-30g/L；蛋白胨10-20g/L；氯化钠：5-12g/L；甘油1-6g/L；三氯化铁0.5-1g/L；其并未添加磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、葡萄糖，且用甘油替代里葡萄糖，同时加入三氯化铁减少乙酸的生成量(可取不同时期发酵液检测PH值体现乙酸生成情况)，而磷酸氢二钾、磷酸二氢钾是在发酵罐中分消后混合到培养基里防止培养基发生沉淀。

2.现有技术中发酵罐培养基：酵母浸粉10-20g/L；蛋白胨10-15g/L；玉米浆10-20g/L；氯化钙：10-15g/L；葡萄糖1-6g/L；硫酸亚铁10-15g/L；磷酸二氢钾15-25g/L；氯化钠10-20g/L；七水硫酸镁3-10mmol/L；乳糖1-3g/L；IPTG10-15g/L；

而本发明实施例5采用的发酵罐培养基为：酵母浸粉15-30g/L；蛋白胨10-20g/L；L-谷氨酸钠0.1-0.5g/L；氯化钠：5-12g/L；甘油1-6g/L；三氯化铁0.5-1g/L；磷酸二氢钾15-25g/L；磷酸氢二钾90-120g/L；维生素B6 0.5-1mmol/L；乳糖1-3g/L；PLP 20-30g/L；IPTG5-12g/L；

由上可知，本发明采用甘油代替葡萄糖作为碳源，可以有效减少抑制性代谢性产物乙酸的累积，有利于高密度发酵；且在发酵培养基中添加三氯化铁可以促进大肠杆菌生长，降低乙酸生成量。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括大肠杆菌菌种活化、种子液进行入罐接种、发酵培养；

其中，所述发酵培养采用的发酵培养基包括如下组分及含量：酵母浸粉15-30g/L；蛋白胨10-20g/L；L-谷氨酸钠0.1-0.5g/L；甘油1-6g/L；三氯化铁0.5-1g/L。

2.根据权利要求1所述的一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述发酵培养包括：清洗发酵罐；空罐灭菌；将种子液移入发酵罐，并进行诱导培养；培养物进行分离、纯化获得γ-氨基丁酸制品。

3.根据权利要求2所述的一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，在发酵培养过程中的诱导培养采用如下组分：维生素B6 0.5-1mmol/L；PLP 20-30g/L；乳糖1-3g/L；IPTG 5-12g/L；所述发酵培养基中还加入分消后的磷酸二氢钾15-25g/L；磷酸氢二钾90-120g/L。

4.根据权利要求1所述的一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述发酵罐用培养基的PH为4.5-8。

5.根据权利要求1所述的一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述大肠杆菌菌种活化包括：制备活化用培养基，灭菌倒平板，凝固备用，制得菌种活化平板；制备接种用培养基，灭菌，挑取生长正常旺盛的单一菌落至接种用培养基内接种，制备种子液。

6.根据权利要求5所述的一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述活化用培养基的组成为：氯化钠5-12g/L；酵母浸粉3-10g/L；蛋白胨5-15g/L；琼脂粉3-10g/L；所述接种用培养基的组成为：氯化钠5-12g/L；酵母浸粉3-10g/L；蛋白胨3-8g/L；其中，所述活化用培养基和接种用培养基的PH均为5.1-7.2，培养温度均为30℃-38℃。

7.根据权利要求1所述的一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述种子液进行入罐接种包括：种子罐实罐灭菌，取出种子液进行镜检、PH、OD值测定，各指标正常，入种子罐接种。

8.根据权利要求7所述的1所述的一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述种子液入罐前在600nm条件下测定的OD值为0.8-2.5，利用PH测定仪直接测定的PH值为5-8。

9.根据权利要求7所述的1所述的一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述种子罐用培养基的组成为：酵母浸粉15-30g/L；蛋白胨10-20g/L；氯化钠：5-12g/L；甘油1-6g/L；三氯化铁0.5-1g/L。

10.根据权利要求7所述的的一种产γ-氨基丁酸的高效发酵法，其特征在于，所述种子罐用培养基的PH为5-8。