CN104830886A - 产γ-氨基丁酸的重组菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了产γ-氨基丁酸的重组菌及其构建方法与应用。采用本发明的方法将谷氨酸脱羧酶B基因(gadB基因)通过表达载体pBAD/HisB导入到大肠杆菌突变株K12ΔgadABC中构建的基因工程菌KG01阻断了γ-氨基丁酸的降解途径并且钝化了谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白对pH的敏感性，有效地减少了γ-氨基丁酸的降解提高了GABA的产量和转化效率。KG01菌株的转化率不受pH变化的影响，而且GABA的产量最高，明显高于K12ΔgabT菌株和K12菌株。以浓度为2M的谷氨酸为底物，KG01菌株连续转化三次，每次的转化率均在99％以上，产量均大于204g/L，底物残留量低，便于下游结晶精制。采用本发明的方法构建的基因工程菌生产γ-氨基丁酸，具有原料低廉，工艺简单，生产效率高等优点，具有良好的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中产γ-氨基丁酸的重组菌及其构建方法与应用。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，广泛存在于微生物，植物和动物细胞中。GABA是哺乳动物中枢神经系统的抑制性神经递质，具有降血氨，抗焦虑，降血压，治疗糖尿病，促进酒精代谢，改善肾机能和肝功能以及消臭、减肥等生理功能，广泛应用于食品保健、医药和饲料行业中。此外，GABA还可聚合形成尼龙4，在化工行业也具有良好的应用前景。
目前GABA大规模制备的理想途径是采用微生物(酶)法转化L-谷氨酸或其钠盐。微生物转化法制备GABA的关键是要获得具有高谷氨酸脱羧酶活力的菌株。利用大肠杆菌高效异源表达谷氨酸脱羧酶基因是一个非常有效的方法，已有相关专利报道(申请号：201010567447.9；201110289796.3；201210431917.8)。然而这些专利采用的是Novagen的pET-28a(+)表达载体。pET-28a(+)表达载体的乳糖操纵子，蛋白表达不够严谨且需要将细胞培养至一定浓度后再添加诱导物，生产工艺较难控制；采用的高拷贝复制起始位点和强T7启动子使细菌表达许多包涵体蛋白且诱导物IPTG具有强细胞毒性，菌体细胞和活性蛋白得率低。鉴于此，开发产量高、可重复使用、生产工艺简单、成本低、易于工业化大规模生产的新的表达系统是十分必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何制备高产量、生产工艺简单和成本低的γ-氨基丁酸。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了产γ-氨基丁酸的重组菌的构建方法。
本发明所提供的产γ-氨基丁酸的重组菌的构建方法，包括将谷氨酸脱羧酶B基因导入受体菌得到产γ-氨基丁酸的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌；
所述谷氨酸脱羧酶B基因编码a1或a2的蛋白质：
a1、氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
a2、在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有谷氨酸脱羧酶B活性的由a1衍生的蛋白质。
上述方法中，所述突变型大肠杆菌为下述B1至B7中的任一种：
B1、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行下述b1-b3的改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(该改造以“ΔgadABC”表示)；
b1、将谷氨酸脱羧酶A基因敲除，该改造以“△gadA”表示；
b2、将所述谷氨酸脱羧酶B基因敲除，该改造以“△gadB”表示；
b3、将谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因截短得到谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因，具体可为截短所述谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白的羧基端部分氨基酸的编码序列，该改造以“△gadC”表示；
B2、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b1改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(该改造以“ΔgadA”表示)；
B3、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b2改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(该改造以“ΔgadB”表示)；
B4、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b1和所述b2改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(该改造以“ΔgadAB”表示)；
B5、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(该改造以“△gadC”表示)；
B6、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b1和所述b3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(该改造以“△gadAC”表示)；
B7、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b2和所述b3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(该改造以“△gadBC”表示)。
上述敲除和截短均可通过同源重组实现。
上述方法中，所述谷氨酸脱羧酶A基因编码c1或c2的蛋白质：
c1、氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；
c2、在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有谷氨酸脱羧酶A活性的由c1衍生的蛋白质；
所述谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因编码d1或d2的蛋白质：
d1、氨基酸序列是SEQ ID No.3所示的蛋白质；
d2、在SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白活性的由d1)衍生的蛋白质。
上述方法中，所述谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.3的第1-470位氨基酸残基的蛋白质。
上述方法中，所述谷氨酸脱羧酶B基因为a11-a13中的任一种DNA分子：
a11)其编码序列是SEQ ID No.4的cDNA分子或基因组DNA；
a12)在严格条件下与a11)限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酸脱羧酶B的cDNA分子或基因组DNA；
a13)与a11)或a12)限定的DNA分子具有75％或75％以上同一性且编码所述谷氨酸脱羧酶B的cDNA分子或基因组DNA；
所述谷氨酸脱羧酶A基因为c11-c13中的任一种DNA分子：
c11)其编码序列是SEQ ID No.5的cDNA分子或基因组DNA；
c12)在严格条件下与c11)限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酸脱羧酶A的cDNA分子或基因组DNA；
c13)与c11)或c12)限定的DNA分子具有75％或75％以上同一性且编码所述谷氨酸脱羧酶A的cDNA分子或基因组DNA；
所述谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因为d11-d13中的任一种DNA分子：
d11)其编码序列是SEQ ID No.6的cDNA分子或基因组DNA；
d12)在严格条件下与d11)限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白的cDNA分子或基因组DNA；
d13)与d11)或d12)限定的DNA分子具有75％或75％以上同一性且编码所述谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白的cDNA分子或基因组DNA。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.4所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明的SEQ ID No.5所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明的SEQ ID No.6所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述方法中，所述谷氨酸脱羧酶B基因通过含有所述谷氨酸脱羧酶B基因的重组载体导入所述受体菌中，所述含有谷氨酸脱羧酶B基因的重组表达载体中，启动所述谷氨酸脱羧酶B基因转录的启动子是ara启动子，终止所述谷氨酸脱羧酶B基因转录的终止子是rrnB终止子。
上述方法中，所述含有谷氨酸脱羧酶B基因的重组载体是将SEQ ID No.4所示的DNA分子替换载体pBAD/HisB的NcoI和EcoRI识别位点间的片段得到的重组载体pEcgadB，所述重组载体pEcgadB能够表达谷氨酸脱羧酶B。
上述方法中，所述野生型大肠杆菌为大肠杆菌K12。
上述方法中，B1所述突变型大肠杆菌具体可为将大肠杆菌K12的所述谷氨酸脱羧酶A基因(gadA基因)和所述谷氨酸脱羧酶B基因(gadB基因)敲除(缺失)，并将大肠杆菌K12的所述谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因截短得到所述谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因的大肠杆菌K12突变体K12ΔgadABC，该谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.3的第1-470位氨基酸残基的蛋白质。
上述方法中，B1所述突变型大肠杆菌可按照包括如下步骤的方法构建：将B4所述突变型大肠杆菌中的所述谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因截短得到所述谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因的突变型大肠杆菌K12ΔgadABC。
上述方法中，将B4所述突变型大肠杆菌中的所述谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因截短为所述谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因可通过同源重组实现。
上述方法中，B2所述突变型大肠杆菌具体可为将大肠杆菌K12的所述谷氨酸脱羧酶A基因(gadA)敲除(缺失)得到的大肠杆菌K12突变体K12ΔgadA。
上述方法中，B3所述突变型大肠杆菌具体可为将大肠杆菌K12的所述谷氨酸脱羧酶B基因(gadB)敲除(缺失)得到的大肠杆菌K12突变体K12ΔgadB。
上述方法中，B4所述突变型大肠杆菌具体可为将大肠杆菌K12的所述谷氨酸脱羧酶A基因(gadA)和所述谷氨酸脱羧酶B基因(gadB)敲除(缺失)得到的大肠杆菌K12突变体K12ΔgadAB。
上述方法中，B4所述突变型大肠杆菌可按照包括如下步骤的方法构建：将B2所述突变型大肠杆菌中的所述谷氨酸脱羧酶B基因(gadB)敲除(缺失)得到的突变型大肠杆菌K12ΔgadAB。
按照上述产γ-氨基丁酸的重组菌的构建方法构建的重组菌也属于本发明保护的范围。
本发明所提供的所述重组菌在制备γ-氨基丁酸中的应用也属于本发明保护的范围。
为解决上述技术问题，本发明还提供了制备γ-氨基丁酸的方法。
本发明所提供的制备γ-氨基丁酸的方法，包括将所述重组菌经阿拉伯糖诱导培养得到诱导后的重组菌，用所述诱导后的重组菌催化谷氨酸或可溶性谷氨酸盐进行催化反应，得到转化液，从所述转化液中收集γ-氨基丁酸；将所述催化反应称为第1次转化，将所述转化液称为第1次转化液。
所述制备γ-氨基丁酸的方法还包括从第(n-1)次转化液中收集菌体，将该菌体命名为第n次转化菌；用所述第n次转化菌催化谷氨酸或可溶性谷氨酸盐进行催化反应，得到转化液，从所述转化液中收集γ-氨基丁酸；将所述催化反应称为第n次转化，将所述转化液称为第n次转化液，所述n为大于等于2的一个自然数，如n为2或3。
具体地，所述制备γ-氨基丁酸的方法还包括从所述第1次转化液中收集菌体，将该菌体命名为第2次转化菌；用所述第2次转化菌催化谷氨酸或可溶性谷氨酸盐进行催化反应，得到转化液，从所述转化液中收集γ-氨基丁酸；将所述催化反应称为第2次转化，将所述转化液称为第2次转化液。从所述第2次转化液中收集菌体，将该菌体命名为第3次转化菌；用所述第3次转化菌催化谷氨酸或可溶性谷氨酸盐进行催化反应，得到转化液，从所述转化液中收集γ-氨基丁酸；将所述催化反应称为第3次转化，将所述转化液称为第3次转化液。
上述制备γ-氨基丁酸的方法中，所述阿拉伯糖诱导培养在阿拉伯糖的质量浓度为0.2g/100mL的培养基中进行，所述诱导培养的温度可为20-37℃(如30℃)，所述诱导培养的时间可为10小时-30小时(如16小时)。
上述制备γ-氨基丁酸的方法中，所述可溶性谷氨酸盐具体可为谷氨酸钠；所述催化反应可进行1-20小时，具体可为1、2、3、4、5、6、8或20小时；所述催化反应的温度可为37-50℃，具体可为42℃。
实验证明，采用本发明的方法将谷氨酸脱羧酶B基因(gadB基因)通过表达载体pBAD/HisB导入到大肠杆菌突变株K12ΔgadABC中构建的基因工程菌KG01阻断了γ-氨基丁酸的降解途径并且钝化了谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白对pH的敏感性，有效地减少了γ-氨基丁酸的降解，降低了谷氨酸底物和γ-氨基丁酸产物进出细胞的运输障碍，提高了GABA的产量和转化效率。初始转化液的pH值为3.2-3.8，随着谷氨酸转化成GABA时间的延长，转化液的pH逐渐偏向中性，但是KG01菌株的转化率也没有受到pH变化的影响，而且GABA的产量(转化4h，GABA产量为305.87g/L，转化率为98.89％)要明显高于K12ΔgabT菌株(转化6h，GABA的产量为216.42g/L，转化率为69.97％)和K12菌株(转化6h，GABA产量为23.26g/L，转化率为7.52％)；KG02菌株(转化6h，GABA产量为305.42g/L，转化率为98.75％)、KG03菌株(转化6h，GABA产量为300.42g/L，转化率97.13％)和KG04菌株的GABA(转化6h，GABA产量为299.86g/L，转化率为96.95％)的产量均明显高于K12ΔgabT菌株和K12菌株。以浓度为2M的谷氨酸为底物，KG01菌株连续转化三次，每次的转化率均在99％以上，产量均大于204g/L，底物残留量低，便于下游结晶精制。采用本发明的方法构建的基因工程菌生产γ-氨基丁酸，具有原料低廉，工艺简单，生产效率高等优点，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
图1为重组载体pEcgadB的结构示意图。
图2为大肠杆菌K12的基因组部分结构示意图。
图3为gadB基因敲除和gadC基因截短后的基因组部分结构示意图。
图4为产γ-氨基丁酸的基因工程菌菌株细胞破碎得到的上清液的SDS-PAGE电泳。其中，泳道M为分子量为14.4-116KDa的蛋白质Marker；泳道1为KG05菌株的细胞破碎后得到的上清液；泳道2为KG04菌株的细胞破碎后得到的上清液；泳道3为KG03菌株的细胞破碎后得到的上清液；泳道4为KG02菌株的细胞破碎后得到的上清液；泳道5为KG01菌株的细胞破碎后得到的上清液。
图5为γ-氨基丁酸(GABA)的标准曲线。
图6为KG01菌株、KG02菌株、KG03菌株、KG04菌株、KG05菌株、K12ΔgabT菌株和K12菌株的γ-氨基丁酸产量的时间变化曲线。图中pEcgadB/K12ΔgadABC代表KG01菌株，pEcgadB/K12ΔgadAB代表KG02菌株，pEcgadB/K12ΔgadA代表KG03菌株，pEcgadB/K12ΔgadB代表KG04菌株，pEcgadB/K12代表KG05菌株，pEcgadB/K12ΔgabT代表K12ΔgabT菌株，K12代表K12菌株。
图7为KG01菌株在进行谷氨酸到GABA转化时转化液中谷氨酸和GABA的浓度随时间的变化曲线。图中a表示第一次转化时转化液中谷氨酸和GABA的浓度随时间的变化曲线；图中b表示第二次转化时转化液中谷氨酸和GABA的浓度随时间的变化曲线；图中c表示第三次转化时转化液中谷氨酸和GABA的浓度随时间的变化曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的大肠杆菌K12(Tomoya Baba，Takeshi Ara，Miki Hasegawa，Yuki Takai，Yoshiko Okumura，Miki Baba，KirillA Datsenko，Masaru Tomita，Barry L Wanner and Hirotada Mori 1.Construction of Escherichia coli K-12in-frame，single-gene knockout mutants：the Keio collection.MolecularSystems Biology.(2006):1-11)公众可从福建师范大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pBAD/HisB为invitrogen公司产品，产品目录号为V430-01。
下述实施例中的pKD13载体为耶鲁大学大肠杆菌遗传存储中心的产品，产品编号为7633(Datsenko,KA,BL Wanner 2000.One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(12):6640-5)。
下述实施例中的pKD46载体为耶鲁大学大肠杆菌遗传存储中心的产品，产品编号为7739(Datsenko,KA,BL Wanner 2000.One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(12):6640-5)。
下述实施例中的pCP20载体为耶鲁大学大肠杆菌遗传存储中心的产品，产品编号为7629(Datsenko,KA,BL Wanner 2000.One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(12):6640-5)。
下述实施例中的大肠杆菌K12ΔgadA为日本国立遗传学研究所的产品，产品编号为ECK3502(Tomoya Baba，Takeshi Ara，Miki Hasegawa，Yuki Takai，YoshikoOkumura，Miki Baba，Kiri llA Datsenko，Masaru Tomita，Barry L Wanner andHirotada Mori 1.Construction of Escherichia coli K-12in-frame，single-geneknockout mutants：the Keio collection.Molecular Systems Biology.(2006):1-11)。
下述实施例中的大肠杆菌K12ΔgadB为日本国立遗传学研究所的产品，产品编号为ECK1487(Tomoya Baba，Takeshi Ara，Miki Hasegawa，Yuki Takai，YoshikoOkumura，Miki Baba，Kiri llA Datsenko，Masaru Tomita，Barry L Wanner andHirotada Mori 1.Construction of Escherichia coli K-12in-frame，single-geneknockout mutants：the Keio collection.Molecular Systems Biology.(2006):1-11)。
下述实施例中的大肠杆菌K12ΔgabT为日本国立遗传学研究所的产品，产品编号为ECK2656(Tomoya Baba，Takeshi Ara，Miki Hasegawa，Yuki Takai，YoshikoOkumura，Miki Baba，Kiri llA Datsenko，Masaru Tomita，Barry L Wanner andHirotada Mori 1.Construction of Escherichia coli K-12in-frame，single-geneknockout mutants：the Keio collection.Molecular Systems Biology.(2006):1-11)。
大肠杆菌突变体的基因型如表1。
表1、大肠杆菌突变体的基因型
| 菌株 | 性状 |
| K12ΔgadA | ΔgadA |
| K12ΔgadB | ΔgadB |
| K12ΔgadAB | ΔgadAB |
| K12ΔgadABC | ΔgadABC |
| K12ΔgabT | ΔgabT |
实施例中的自诱导培养基ZYM配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E；其中组分A、B、C、D和E的组成如下：
A-ZY：由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：质量浓度为1％的胰蛋白胨和质量浓度为0.5％的酵母粉；
B-50×M：由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：1.25M Na2HPO4、1.25M KH2PO4、2.5M NH4Cl和0.25M Na2SO4；
C-50×5052：由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：体积百分比为25％的甘油、质量浓度为2.5％的葡萄糖、质量浓度为10％的L-阿拉伯糖；
D：由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：1M MgSO4；
E-1000×微量元素：由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：50mMFeCl3，20mM CaCl2，10mM MnCl2，10mM ZnSO4，2mM CoCl2、2mM NiCl2、2mM Na2Mo4、2mM Na2SeO3和2mM H3BO3。
实施例1、产γ-氨基丁酸基因工程菌的构建
一、构建表达谷氨酸脱羧酶B的编码基因的重组质粒
将pBAD/HisB载体的NcoI和EcoRI识别位点间的DNA序列替换为SEQ ID No.4所示的用于编码谷氨酸脱羧酶B的DNA序列，保持其它DNA序列不变，得到重组载体pEcgadB(图1)。酶切鉴定证明，谷氨酸脱羧酶B的编码基因成功插入到pBAD/HisB载体的NcoI和EcoRI识别位点间。重组载体pEcgadB可表达SEQ ID No.1所示的谷氨酸脱羧酶B，SEQ ID No.4所示的核苷酸序列为谷氨酸脱羧酶B的编码序列。
二、构建敲除γ-氨基丁酸分解代谢途径基因的大肠杆菌突变株K12ΔgadAB
大肠杆菌K12的基因组部分结构示意图如图2所示。以载体pKD13为模板，设计敲除引物gadB-P1H1(5’-TAAATCCTACTTTTTTAATGCGATCCAATCATTTTAAGGAGTTTAA AATGCTGTCAAACATGAGAATTAA-3’)和gadB-P2H2(5’-TTTCGGGACACCGTTACCGTTAAACG TTATCAGGTATGTTTAAAGCTGTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’)，引物gadB-P1H1和gadB-P2H2的5’端含有50bp的gadB基因的同源臂(下划线部分)，3’端为Kanr基因扩增引物，进行PCR扩增获得含FRT位点和Kanr基因的线性片段。将扩增得到的含FRT位点和Kanr基因的线性片段通过电穿孔方法导入重组大肠杆菌K12ΔgadA/pKD46(将pKD46载体通过氯化钙法导入大肠杆菌K12突变株K12ΔgadA得到重组大肠杆菌K12ΔgadA/pKD46)的感受态细胞中，利用卡那霉素平板筛选获得阳性转化子。将能表达Flp重组酶的pCP20载体导入获得的阳性转化子，删除阳性转化子中FRT位点间的Kanr基因(Tomoya Baba，Takeshi Ara，Miki Hasegawa，Yuki Takai，Yoshiko Okumura，Miki Baba，KirillA Datsenko，Masaru Tomita，Barry L Wanner and Hirotada Mori 1.Construction of Escherichia coli K-12in-frame，single-gene knockout mutants：the Keio collection.MolecularSystems Biology.(2006):1-11)，得到谷氨酸脱羧酶A的编码基因(gadA基因)和谷氨酸脱羧酶B的编码基因(gadB基因)缺失的大肠杆菌K12的突变株，将获得的大肠杆菌K12的突变株命名为K12ΔgadAB。通过验证引物对gadB-F(5’-TTAAACACGAGTCCTTTGC-3’)和gadB-R(5’-AGCAGGAAGAAGACTAATGA-3’)从K12ΔgadAB菌株的基因组DNA中扩增得到一个约500bp的片段，从K12ΔgadA菌株的基因组DNA中扩增得到一个约1780的片段，经测序分析表明gadB基因已成功敲除，敲除gadB基因的部分结构示意图如图3所示。
三、构建钝化谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白pH敏感性的大肠杆菌突变株K12ΔgadC、K12ΔgadAC、K12ΔgadBC和K12ΔgadABC
以载体pKD13为模板，设计敲除引物gadC-P1H1(5’-TGGTGGTACTTGCCCTGCCC TTTATTCTCTATGCTGTTCATGATCGTAAATAACTGTCAAACATGAGAATTAA-3’)和gadC-P2H2(5’-TCCCTTGTCTTATAACCATTCAGACATGGTTAGTGTTTCTTGTCATTCATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’)，引物gadC-P1H1和gadC-P2H2的5’端含有50bp谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因(简称为gadC基因)的同源臂(下划线部分)，并增加了终止密码子TAA(加粗部分)，3’端为Kanr基因扩增引物，进行PCR扩增获得含FRT位点和Kanr基因的线性片段。按照下述1-4的方法制备大肠杆菌K12的突变株。
1、将上述含FRT位点和Kanr基因的线性片段通过电穿孔方法导入重组大肠杆菌K12ΔgadAB/pKD46(将pKD46载体通过氯化钙法导入大肠杆菌K12突变株K12ΔgadAB得到重组大肠杆菌K12ΔgadAB/pKD46)的感受态细胞中，利用卡那霉素平板筛选获得阳性转化子。将能表达Flp重组酶的pCP20载体导入获得的阳性转化子，删除阳性转化子中FRT位点间的Kanr基因(Tomoya Baba，Takeshi Ara，MikiHasegawa，Yuki Takai，Yoshiko Okumura，Miki Baba，KirillA Datsenko，MasaruTomita，Barry L Wanner and Hirotada Mori 1.Construction of Escherichia coliK-12in-frame，single-gene knockout mutants：the Keio collection.MolecularSystems Biology.(2006):1-11)，得到谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白编码基因截短为谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因的大肠杆菌K12的突变株，将该突变株命名为K12ΔgadABC。该谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.3的第1-470位氨基酸残基的蛋白质。
2、将步骤1中的重组大肠杆菌K12ΔgadAB/pKD46替换为K12/pKD46(将pKD46载体通过氯化钙法导入大肠杆菌K12中得到重组大肠杆菌K12/pKD46)，其它操作均不变，得到谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白编码基因截短为谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因的大肠杆菌K12的突变株，将该突变株命名为K12ΔgadC。该谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因编码氨基酸序列是SEQ IDNo.3的第1-470位氨基酸残基的蛋白质。
3、将步骤1中的重组大肠杆菌K12ΔgadAB/pKD46替换为K12ΔgadA/pKD46(将pKD46载体通过氯化钙法导入大肠杆菌K12的突变株K12ΔgadA中得到重组大肠杆菌K12ΔgadA/pKD46)，其它操作均不变，得到谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白编码基因截短为谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因的大肠杆菌K12的突变株，将该突变株命名为K12ΔgadAC。该谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.3的第1-470位氨基酸残基的蛋白质。
4、将步骤1中的重组大肠杆菌K12ΔgadAB/pKD46替换为K12ΔgadB/pKD46(将pKD46载体通过氯化钙法导入大肠杆菌K12的突变株K12ΔgadB中得到重组大肠杆菌K12ΔgadB/pKD46)，其它操作均不变，得到谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白编码基因截短为谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因的大肠杆菌K12的突变株，将该突变株命名为K12ΔgadBC。该谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.3的第1-470位氨基酸残基的蛋白质。
通过验证引物对gadC-F(5’-GCTACATTGTGTTGGTTCTT-3’)和gadC-R(ATCGCTGGTCTTCTAATCG)从K12ΔgadABC菌株的基因组DNA中扩增得到一个约550bp的片段，从K12ΔgadAB菌株的基因组DNA中扩增得到一个约670bp的片段，测序分析表明gadC基因编码的谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白的氨基酸残基的第471-511位已成功截除，其基因组部分结构示意图如图3所示。
四、构建产γ-氨基丁酸的基因工程菌
1、构建基因工程菌KG01
采用氯化钙法将重组载体pEcgadB导入步骤三得到的K12ΔgadABC菌株中，在含有氨卞青霉素的平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子命名为pEcgadB/K12ΔgadABC。将阳性克隆子pEcgadB/K12ΔgadABC的细胞破碎后进行离心，将获得的上清液进行SDS-PAGE电泳验证，从图中可见，谷氨酸脱羧酶B(gadB)(53KD)有表达(图4中泳道5)，说明重组载体pEcgadB成功导入了K12ΔgadABC菌株中，得到产γ-氨基丁酸(GABA)的基因工程菌pEcgadB/K12ΔgadABC，将该菌株编号为KG01。
2、构建基因工程菌KG02
采用氯化钙法将重组载体pEcgadB导入步骤二得到的K12ΔgadAB菌株中，在含有氨卞青霉素的平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子命名为pEcgadB/K12ΔgadAB。将阳性克隆子pEcgadB/K12ΔgadAB的细胞破碎后进行离心，将获得的上清液进行SDS-PAGE电泳验证，从图中可见，谷氨酸脱羧酶B(gadB)(53KD)有表达(图4中泳道4)，说明重组载体pEcgadB成功导入了K12ΔgadAB菌株中，得到产γ-氨基丁酸(GABA)的基因工程菌pEcgadB/K12ΔgadAB，将该菌株编号为KG02。
3、构建基因工程菌KG03
采用氯化钙法将重组载体pEcgadB导入K12ΔgadA菌株中，在含有氨卞青霉素的平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子命名为pEcgadB/K12ΔgadA。将阳性克隆子pEcgadB/K12ΔgadA的细胞破碎后进行离心，将获得的上清液进行SDS-PAGE电泳验证，从图中可见，谷氨酸脱羧酶B(gadB)(53KD)有表达(图4中泳道3)，说明重组载体pEcgadB成功导入了K12ΔgadA菌株中，得到产γ-氨基丁酸(GABA)的基因工程菌pEcgadB/K12ΔgadA，将该菌株编号为KG03。
4、构建基因工程菌KG04
采用氯化钙法将重组载体pEcgadB导入K12ΔgadB菌株中，在含有氨卞青霉素的平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子命名为pEcgadB/K12ΔgadB。将阳性克隆子pEcgadB/K12ΔgadB的细胞破碎后进行离心，将获得的上清液进行SDS-PAGE电泳验证，从图中可见，谷氨酸脱羧酶B(gadB)(53KD)有表达(图4中泳道2)，说明重组载体pEcgadB成功导入了K12ΔgadB菌株中，得到产γ-氨基丁酸(GABA)的基因工程菌pEcgadB/K12ΔgadB，将该菌株编号为KG04。
5、构建基因工程菌KG05
采用氯化钙法将重组载体pEcgadB导入大肠杆菌K12中，在含有氨卞青霉素的平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子命名为pEcgadB/K12。将阳性克隆子pEcgadB/K12的细胞破碎后进行离心，将获得的上清液进行SDS-PAGE电泳验证，从图中可见，谷氨酸脱羧酶B(gadB)(53KD)有表达(图4中泳道1)，说明重组载体pEcgadB成功导入了大肠杆菌突变株K12中，得到产γ-氨基丁酸(GABA)的基因工程菌pEcgadB/K12，将该菌株编号为KG05。
实施例2、产γ-氨基丁酸基因工程菌转化L-谷氨酸产γ-氨基丁酸
一、产γ-氨基丁酸基因工程菌的诱导培养
分别将产γ-氨基丁酸的基因工程菌KG01、KG02、KG03、KG04、KG05、大肠杆菌K12ΔgabT(简称K12ΔgabT菌株)和大肠杆菌K12(简称K12菌株)划线到含有质量浓度为1.5％的琼脂和质量浓度为100μg/mL的氨卞青霉素的LB平板上，37℃培养12h。挑取平板上的单菌落，接种到含有质量浓度为100μg/mL的氨卞青霉素的液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，转速为220rpm；将过夜培养物以1％(体积百分比)的接种量接种至自诱导培养基ZYM中，在转速为200rpm,30℃条件下振荡培养16h，分别获得诱导后的KG01菌株、KG02菌株、KG03菌株、KG04菌株、KG05菌株、K12ΔgabT菌株和K12菌株。
二、产γ-氨基丁酸基因工程菌生物转化L-谷氨酸产γ-氨基丁酸
分别将步骤一获得的诱导后的KG01菌株、KG02菌株、KG03菌株、KG04菌株、KG05菌株、K12ΔgabT菌株和K12菌株于4℃，8000g条件下离心10min，收集菌体；再用浓度为10mM的氯化钠水溶液洗涤菌体1次后以相同的离心条件再次收集菌体，分别获得洗涤后的KG01菌株、KG02菌株、KG03菌株、KG04菌株、KG05菌株、K12ΔgabT菌株和K12菌株。分别将洗涤后的KG01菌株、KG02菌株、KG03菌株、KG04菌株、KG05菌株、K12ΔgabT菌株和K12菌株重悬于含有浓度为3M谷氨酸的水溶液中，分别获得KG01菌株、KG02菌株、KG03菌株、KG04菌株、KG05菌株、K12ΔgabT菌株和K12菌株的谷氨酸初始转化液(初始转化液的pH值为3.2-3.8)，初始转化液中菌体含量以湿重计为20g/L，将KG01菌株、KG02菌株、KG03菌株、KG04菌株、KG05菌株、K12ΔgabT菌株和K12菌株的谷氨酸初始转化液在42℃，转速为100rpm的条件下进行谷氨酸到γ-氨基丁酸的转化，分别获得KG01菌株、KG02菌株、KG03菌株、KG04菌株、KG05菌株、K12ΔgabT菌株和K12菌株在1、2、3、4、6、8和20h不同时间点的转化液。实验设两次重复，每次重复每个时间点设3个平行样。
GABA产量的分析采用高效液相色谱(HPLC)进行测定，具体测定步骤如下：
1、GABA标准曲线的绘制
准确称取0.0619g GABA标准品(购自美国Sigma公司)置于100mL容量瓶中，加入50mL高纯水，搅拌使其完全溶解后再用高纯水定容至100mL；摇匀后依次稀释成包括如下8个浓度的11个浓度(图5)：0.619g/L、0.413g/L、0.3095g/L、0.2065g/L、0.1548g/L、0.1033g/L、0.0774g/L和0.0516g/L的GABA标准溶液。
将配制的不同浓度的GABA标准溶液进行衍生反应，衍生反应的具体方法如下：将衍生剂A、衍生剂B和GABA标准溶液按照体积比1：1：2的比例进行混合得到衍生反应体系，在40℃温度条件下进行衍生反应1小时，得到衍生反应后的溶液。向衍生反应后的溶液中加入等体积的正己烷并进行涡旋混匀，静置反应10min，得到衍生液。衍生剂A为将0.12mL的异硫氰酸苯酯用乙腈定容于10mL容量瓶中获得的体积百分比浓度为1.2％的异硫氰酸苯酯溶液；衍生剂B为将1.39mL的三乙胺用乙腈定容于10mL容量瓶中获得的体积百分比浓度为13.9％的三乙胺溶液。
吸取衍生液中的下层液相，采用0.22μm的有机系滤头进行过滤，收集滤液，采用HPLC进行定量测定，以254nm吸收峰的峰面积为横坐标，GABA标准品浓度为纵坐标，绘制GABA的标准曲线(图5)。
HPLC测定条件如下：
色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18反相柱(5μm，250×4.6mm)；
柱温：40℃；
检测波长：254nm；
流动相：0.05M的乙酸-乙酸钠溶液：乙腈(v:v)＝80:20；
流速：0.8mL/min；
2、转化液中GABA产量的测定
将KG01菌株、KG02菌株、KG03菌株、KG04菌株、KG05菌株、K12ΔgabT菌株和K12菌株在1、2、3、4、6、8和20h不同时间点的转化液于10000×g离心5min，取上清，分别获得KG01菌株、KG02菌株、KG03菌株、KG04菌株、KG05菌株、K12ΔgabT菌株和K12菌株在1、2、3、4、6、8和20h不同时间点的转化液的上清液，将上清液稀释1000倍后开始衍生反应，分别获得KG01菌株、KG02菌株、KG03菌株、KG04菌株、KG05菌株、K12ΔgabT菌株和K12菌株在1、2、3、4、6、8和20h不同时间点的衍生液，吸取KG01菌株、KG02菌株、KG03菌株、KG04菌株、KG05菌株、K12ΔgabT菌株和K12菌株在1、2、3、4、6、8和20h不同时间点的衍生液中的下层液相，采用0.22μm的有机系滤头进行过滤，收集滤液，采用HPLC进行定量测定。根据转化液在254nm处吸收峰的峰面积和GABA的标准曲线换算出KG01菌株、KG02菌株、KG03菌株、KG04菌株、KG05菌株、K12ΔgabT菌株和K12菌株在1、2、3、4、6、8和20h不同时间点的转化液中的GABA的质量浓度。衍生方法与HPLC测定条件与GABA标准品的衍生和测定方法一致。
转化液中γ-氨基丁酸(GABA)含量的计算公式：γ-氨基丁酸(GABA)(g/L)＝A×(0.0033×Pst+0.001)，其中A代表转化液的稀释倍数；Pst代表转化液在254nm处吸收峰的峰面积(Pst单位：mAu)。
转化率＝[C÷(n×103.1)]×100％，其中C代表转化液中GABA的含量(g/L)；n代表转化液中底物谷氨酸的添加量(mol)；103.1代表GABA的摩尔质量(g/mol)。
不同菌株的γ-氨基丁酸(GABA)产量见图6，KG01菌株转化4h，GABA产量高达305.87g/L，转化率为98.89％；KG02菌株转化6h，GABA产量高达305.42g/L，转化率为98.75％；KG03菌株转化6h，GABA产量高达300.42g/L，转化率为97.13％；KG04菌株转化6h，GABA产量高达299.86g/L，转化率为96.95％；KG05菌株转化6h，GABA产量到达289.42g/L，转化率为93.57％；K12ΔgabT菌株转化6h，GABA产量为216.42g/L，转化率为69.97％；K12菌株转化6h，GABA产量只有23.26g/L，转化率只有7.52％。初始转化液的pH值为3.2-3.8，随着谷氨酸转化成GABA时间的延长，转化液的pH逐渐偏向中性，但是KG01菌株的转化率也没有受到pH变化的影响，而且GABA的产量要明显高于K12ΔgabT菌株；KG02菌株、KG03菌株和KG04菌株的GABA的产量均明显高于K12ΔgabT菌株。KG01菌株(K12ΔgadABC菌株)转化时间短，GABA产量和转化率最高，提高了GABA的产量和转化效率。
实施例3 利用基因工程菌KG01制备γ-氨基丁酸
挑取基因工程菌KG01的单菌落接种到含有质量浓度为100μg/mL氨卞青霉素的液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，转速220rpm；将过夜培养物以1％(体积百分比)的接种量接种至装有70L自诱导培养基ZYM的100L发酵罐中，通气比为0.6-0.8vvm，在30℃，转速为300rpm的条件下发酵培养16小时，得到发酵液。然后利用管式离心机离心发酵液，收集KG01菌体至150L转化罐中，加入60L左右纯水重悬菌株，获得重悬菌株液，使得重悬菌株液中菌体的含量以菌体湿重计为20g/L，并向重悬菌株液中添加谷氨酸，使得重悬菌株液中谷氨酸的浓度为2M，获得菌株第1次初始转化液。将菌株第1次初始转化液在42℃，转速为60rpm的条件下进行谷氨酸到GABA的第1次转化，转化时间为4h，得到第1次转化液。当第1次转化液中的谷氨酸的质量浓度低于0.5g/L时，重新离心收集菌体再进行第2次转化，第2次初始转化液中菌体的含量以菌体湿重计为20g/L，谷氨酸的浓度为2M，第2次转化时间为3h，得到第2次转化液。当第2次转化液中的谷氨酸的质量浓度低于0.5g/L时，重新离心收集菌体再进行第3次转化，第3次初始转化液中菌体的含量以菌体湿重计为20g/L，谷氨酸的浓度为2M，第3次转化时间为5h，得到第3次转化液。转化液中GABA产量测定方法同实施例2，转化液中残余谷氨酸的含量采用配有谷氨酸酶膜的SBA-40D生物传感器分析仪(山东省科学院生物研究所)进行测定，测定范围为0–1g/L。
转化液中残余谷氨酸(GLU)含量的计算公式：残余谷氨酸(GLU)含量(g/L)＝(A×S×10)/1000，其中A代表转化液的稀释倍数；S代表仪器显示数值(单位：mg/dL)；10代表mg/dL和mg/L的换算系数；1000代表mg/L和g/L的换算系数。
三次谷氨酸到GABA的转化结果见图7，第1次转化时间为4h，转化液中GABA产量达到204.21g/L，Glu残余量为0.43g/L，转化率为99.03％(图7中a)；第2次转化时间为3h，转化液中GABA产量高达205.56g/L，Glu没有残余，转化率为99.69％(图7中b)；第3次转化时间为5h，转化液中GABA产量为204.85g/L，Glu残余量为0.25g/L，转化率99.35％(图7中c)。结果说明，工程菌KG01可以连续转化3次，每次的转化率均高于99％，底物残留量低，便于下游结晶精制，具有良好的工业化应用前景。
Claims (10)
1.产γ-氨基丁酸的重组菌的构建方法，包括将谷氨酸脱羧酶B基因导入受体菌得到产γ-氨基丁酸的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌；
所述谷氨酸脱羧酶B基因编码a1或a2的蛋白质：
a1、氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
a2、在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有谷氨酸脱羧酶B活性的由a1衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述突变型大肠杆菌为下述B1至B7中的任一种：
B1、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行下述b1-b3的改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；
b1、将谷氨酸脱羧酶A基因敲除；
b2、将所述谷氨酸脱羧酶B基因敲除；
b3、将谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因截短得到谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因；
B2、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b1改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；
B3、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b2改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；
B4、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b1和所述b2改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；
B5、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；
B6、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b1和所述b3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；
B7、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b2和所述b3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述谷氨酸脱羧酶A基因编码c1或c2的蛋白质：
c1、氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；
c2、在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有谷氨酸脱羧酶A活性的由c1衍生的蛋白质；
所述谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因编码d1或d2的蛋白质：
d1、氨基酸序列是SEQ ID No.3所示的蛋白质；
d2、在SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白活性的由d1)衍生的蛋白质。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.3的第1-470位氨基酸残基的蛋白质。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述谷氨酸脱羧酶B基因通过含有所述谷氨酸脱羧酶B基因的重组载体导入所述受体菌中，所述含有谷氨酸脱羧酶B基因的重组载体中，启动所述谷氨酸脱羧酶B基因转录的启动子是ara启动子。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组载体是将SEQ ID No.4所示的DNA分子替换载体pBAD/HisB的NcoI和EcoRI识别位点间的片段得到的重组载体。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述野生型大肠杆菌为大肠杆菌K12。
8.按照权利要求1-7中任一所述的方法构建的重组菌。
9.权利要求8所述的重组菌在制备γ-氨基丁酸中的应用。
10.制备γ-氨基丁酸的方法，包括将权利要求8所述的重组菌经阿拉伯糖诱导培养得到诱导后的重组菌，用所述诱导后的重组菌催化谷氨酸或可溶性谷氨酸盐进行催化反应，得到转化液，从所述转化液中收集γ-氨基丁酸；将所述催化反应称为第1次转化，将所述转化液称为第1次转化液。
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- 2015-05-07 CN CN201510229161.2A patent/CN104830886B/zh active Active
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