CN112143725B

CN112143725B - 一种重组酯酶、编码基因、工程菌及在拆分甲霜灵中的应用

Info

Publication number: CN112143725B
Application number: CN202010874395.3A
Authority: CN
Inventors: 张朝晖; 王敏杰; 彭康
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2040-08-27
Also published as: CN112143725A

Abstract

本发明涉及一种重组酯酶、编码基因、工程菌及在拆分R,S‑甲霜灵中的应用；所述酯酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，相应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；本发明提供的重组酯酶催化R,S‑甲霜灵的不对称水解，当底物浓度为10g/L时，37℃下反应6h，底物转化率为49.8％，产物甲霜灵酸(N‑(2,6‑二甲基苯基)‑N‑(2‑甲氧基乙酰)丙氨酸)的ee_p是99.3％，主要产物为R‑甲霜灵酸。R‑甲霜灵酸和甲醇可以在氯化亚砜的催化下合成R‑甲霜灵。

Description

一种重组酯酶、编码基因、工程菌及在拆分甲霜灵中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及来源Albibacter sp.zjut528的重组酯酶、编码基因及在拆分甲霜灵中的应用。

背景技术

甲霜灵(N-(2,6-二甲基苯基)-N-(2-甲氧基乙酰)丙氨酸甲酯)是一种重要的乙酰苯胺类杀菌剂，在世界防治卵菌亚纲病害(霜霉病和晚疫病等)市场上，甲霜灵产品占15％。甲霜灵有R和S构型两种对映异构体，其抗真菌活性主要来源于R-对映体。目前市场上销售的甲霜灵产品有普通甲霜灵(外消旋体)和精甲霜灵(主要是R体)两种。手性光学纯产品替代外消旋产品不仅提高了使用药效而且还能减少释放到环境中的农药总量，从而减小对非靶标生物的潜在副作用；光学纯产品的使用还有利于产品的生产、运输和储存。

生物酶法拆分手性化合物比化学拆分法具有如下的优越性：(1)酶催化的反应具有高度的立体专一性，因此得到的产物光学纯度高。(2)副反应少，产品分离提纯容易。(3)酶反应大多在温和的条件下进行，因此没有设备腐蚀问题，生产安全性也高。

酯酶(Esterase)是一类能够催化酯键形成和断开的水解酶，它不需要辅酶。酯酶能进行不对称酯化或水解，很多反应具有高度的立体选择性和专一性，它广泛应用于食品、化工、医学及手性药物制备等领域，已成为在生物技术和有机合成方面应用最广泛的酶之一。

现阶段精甲霜灵(R-甲霜灵为主)的生产主要是以手性原料作前体的化学合成法。利用生物催化剂进行生物拆分生产R-甲霜灵已有一些报道，采用的生物催化剂主要是脂肪酶或含有脂肪酶的微生物细胞，它们拆分的底物都是生产普通甲霜灵的中间体R,S-N-(2,6-二甲基苯基)丙氨酸甲酯(R,S-MAP)，拆分所得的R-MAP还需一步反应才能生成R-甲霜灵，这步反应会降低精甲霜灵产品的手性纯度。

发明内容

本发明提供一种重组酯酶、编码基因、工程菌及其在拆分R,S-甲霜灵中的应用，该酯酶催化R,S-甲霜灵的水解具有极高的对映体R型选择性和高反应活性。

本发明采用的技术方案：

本发明提供一种来源于白色杆菌Albibacter sp.zjut528(CCTCC NO：M2015650)的重组酯酶(记为RMest)，所述重组酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明还涉及所述重组酯酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示。

本发明所述重组酯酶来源于白色杆菌Albibactersp.zjut528，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年10月29日，保藏编号CCTCC NO：M2015650，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，已在专利申请2017100693668中公开。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在80％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明还提供由所述重组酯酶编码基因构建的重组载体(具体为RMest-pET28a(+))，及由所述重组载体转化获得的重组基因工程菌(具体为RMest-pET-28a(+)-E.coliBL21Gold(DE3))。

此外，本发明还提供一种所述重组酯酶在催化R,S-甲霜灵不对称水解制备R-甲霜灵中的应用，具体所述的应用：将含重组酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH7.0磷酸盐缓冲液悬浮，高压破碎、离心，取上清液即为粗酶液；以所述粗酶液为催化剂，以R,S-甲霜灵为底物，以pH8.0磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在20～60℃、120～240rpm(优选37℃、180rpm)条件下进行水解反应，反应完全后，获得含R-甲霜灵酸的混合液，将混合液分离纯化，获得R-甲霜灵酸；R-甲霜灵酸和甲醇在氯化亚砜的催化下生成R-甲霜灵。

进一步，所述催化剂的用量以超声破碎前湿菌体的重量计为1.5-3g/L反应体系(优选1.5g/L)，所述底物终浓度为0.5-35g/L反应体系(优选10g/L)。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含重组酯酶编码基因的工程菌(优选重组菌RMest-pET-28a(+)-E.coli BL21 Gold(DE3))接种在含卡那霉素50μg/mL的LB液体培养基中，37℃，180r/min培养至菌液OD₆₀₀约为0.5～0.8，添加IPTG至终浓度为0.6mmol/L，25℃、180r/min诱导培养10h，将菌液在4℃、8000r/min离心10min，弃上清液；取沉淀细胞即湿菌体悬浮于100mmol/L的pH8.0 Tris-HCl缓冲液中，4℃下高压匀浆破碎，12000r/min离心20min，取上清液，获得粗酶液；所述悬浮用缓冲液体积用量以湿菌体重量计为50～100ml/g。

进一步，所述R-甲霜灵按如下方法制备：取R-甲霜灵酸，溶于无水甲醇中，冰浴滴加二氯亚砜，滴加完毕后冰浴反应10min，然后回流反应4h，旋蒸浓缩至粘稠的膏状体；将旋蒸产物溶于乙酸乙酯，用质量浓度5％Na₂CO₃水溶液洗涤2次，去离子水洗涤1次，有机相加入无水硫酸镁除水，过滤后旋蒸，得到R-甲霜灵；所述无水甲醇体积用量以R-甲霜灵酸重量计为8ml/g；所述二氯亚砜与R-甲霜灵酸物质的量只比为1:1.1。

本发明所述工程菌RMest-pET-28a(+)-E.coli BL21 Gold(DE3)发酵表达重组酯酶，为胞内表达。本发明采用程序Blast+，在蛋白质数据库中对酯酶RMest(氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)进行氨基酸序列比对，选择的数据库是Uniprot KB(包括UnitProt KB/Swiss-Prot and uniProt KB/TrEMBL)。在返回的结果中，与酯酶RMest同源性最高的蛋白是来自Hyphomicrobium sp.的AB hydrolase-1domain-containing protein(AB指Alpha/Beta)，氨基酸序列一致性只有40.2％，序列相似性只有57.3％，表明酯酶RMest是一种序列特异性很强的新酯酶蛋白。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

本发明提供的酯酶基因RMest在大肠杆菌中进行克隆和表达，表达的重组酯酶对水解R,S-甲霜灵有极高的R-选择性和高活性。用适量重组酶液催化水解R,S-甲霜灵，底物浓度10g/L，反应3h，底物转化率为49.8％，产物(甲霜灵酸)的ee_p为99.3％，对底物的对映体R-构型具有专一(选择)性。具有该性能的酯酶及其基因序列在国内外属首次报道，该发明对生物拆分法生产高手性纯度的精甲霜灵(R体为主)具有很大的应用价值。

附图说明

图1.PCR扩增的基因RMest的DNA片段的琼脂糖电泳图。

图2.重组质粒的PCR验证；M：Maker；泳道1：基因RMest扩增片段；泳道2：pET-28a(+)空质粒；泳道3：RMest-pET-28a(+)。

图3.重组菌RMest-pET-28a(+)-E.coli BL21 Gold(DE3)表达产物的SDS-PAGE图；M：Maker；泳道1：无IPTG诱导；泳道2：有IPTG诱导；泳道3：带有空质粒的宿主菌株。

图4.HPLC分析重组酯酶粗酶液催化水解R,S-甲霜灵的过程，A:反应0h；B:反应3h；C:反应12h。

图5.不同甲霜灵浓度下的重组酶反应速率(A)及它的Lineweaver-Burk双倒数图(B)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1：酯酶基因的扩增和重组菌的构建

1、菌株Albibacter sp.zjut528(CCTCC NO：M2015650)基因组DNA的提取

将菌株Albibacter sp.zjut528(CCTCC NO：M2015650)接种于种子培养基中，30℃、200rpm恒温摇床培养24h，获得种子液。随后将种子液以体积浓度6％的接种量转接至发酵培养基，30℃、200rpm恒温摇床培养24h，发酵液离心，收集湿菌体。按SK8255柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒的说明书，按步骤提取菌株Albibacter sp.zjut528基因组DNA。

种子培养基组成为：K₂HPO₄ 2.1g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，NaCl 0.1g/L，MgSO₄·7H₂O0.2g/L，CaCl₂ 0.025g/L，NH₄NO₃ 0.5g/L，微量元素液10mL/L，1g/L甲霜灵，溶剂为水，pH7。

微量元素液组成：CoCl₂ 0.1g/L，MnSO₄ 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.1g/L，CuSO₄ 0.1g/L，ZnSO₄·7H₂O0.1g/L，H₃BO₃ 0.01g/L，Al₂(SO₄)₃·12H₂O 0.01g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.01g/L，EDTA·2Na 1g/L，溶液配制过程：将1gEDTA·2Na溶解于800ml超纯水中，加入上述原料，定容至1L。

发酵培养基组成为：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NH₄NO₃1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，甲霜灵1g/L，溶剂为水，pH7。

2、目的基因的扩增和重组工程菌的构建

以菌株Albibacter sp.zjut528(CCTCC NO：M2015650)的基因组DNA为模板，设计特异性引物进行目标基因的扩增。设计的引物如下：

上游引物：5’-CGGGATCCACGCCGATAGAGGGTCAAAG-3’，BamH I

下游引物：5’-CCGCTCGAGCGTTTATAGCCTGCCAC-3’，XhoI。

PCR体系(50μL)：

PCR反应参数：

PCR反应结束后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，可以看出，1000-1500bp有一个明显条带，无非特异性条带，与预期大小相符。使用AxyPrep^TM DNAGel Extraction G Kit切胶回收目的片段，用限制性内切酶BamH I、Xho I(Takara公司)分别对目的片段、pET28a(+)进行双酶切，将酶切后的目的片段(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)和pET-28a(+)通过高效连接液连接，将连接产物转化到E.coli BL21Gold(DE3)宿主菌中，获得重组大肠杆菌RMest-pET-28a(+)-E.coli BL21Gold(DE3)。

将重组菌涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃恒温培养箱过夜培养。随机挑取几个平板上的单菌落，LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)过夜富集培养。使用质粒DNA小量试剂盒提取重组质粒，双酶切，以pET28a(+)空载体为对照，进行质粒PCR验证(见图2)，结果与预期相符。将重组质粒送样测序，测序结果表明，重组大肠杆菌构建成功。

实施例2：重组酯酶的表达

挑取实施例1保藏在平板上的重组大肠杆菌RMest-pET-28a(+)-E.coli BL21Gold(DE3)单菌落，接种于50ml含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，180r/min培养12h。以体积浓度1％接种量接种于50ml液体LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)。37℃，180r/min恒温摇床培养3h，加入IPTG至终浓度为0.6mmol/L，25℃，180r/min诱导10h。取诱导后的菌液进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图3所示。由图3可知，经IPTG诱导，重组大肠杆菌有目的蛋白表达，大小约为49KDa，与预期相符。

实施例3：重组酯酶的立体选择性

将实施例1重组菌RMest-pET-28a(+)-E.coli BL21 Gold(DE3)在含卡那霉素50μg/mL的LB液体培养基中，37℃，180r/min培养至菌液OD₆₀₀约为0.6，添加IPTG至终浓度为0.6mmol/L，25℃、180r/min诱导培养10h。将菌液在4℃、8000r/min离心10min，弃上清液。取沉淀的细胞(即湿菌体)0.75g悬浮于50mL、100mmol/L的pH8.0 Tris-HCl缓冲液中，4℃下高压匀浆破碎，12000r/min离心20min，取上清液，获得粗酶液50mL。

取2mL(相当于破碎前湿菌体30mg)粗酶液，加入0.2g R,S-甲霜灵和磷酸缓冲液(100mmol/L，pH8.0)，构成20ml总反应体系，37℃、180r/min摇床中反应30min和3h、12h，取样分析底物消耗和产物生成。结果如图4所示。若甲霜灵水解，产物是甲霜灵酸和甲醇。在反应初始(如图4中A)，S-甲霜灵和R-甲霜灵各占一半，保留时间分别在11min和35.7min。反应3h(如图4中B)，R-甲霜灵的峰消失，底物的转化率达到了49.8％；而产物仅有R-甲霜灵酸(16.9min)，产物的ee_p值为99.3％，表明酶的对映体选择性为严格R型。当反应再进行9h(总时间到12h)，如图4中C所示，在10.07min出现了一个较小的S-甲霜灵酸的产物峰，相应地，S-甲霜灵的峰(11min)有所下降。这时底物的转化率增加到56.5％，产物的ee_p值降到82.9％。因此，对该酯酶来说，只有当R型底物降解完之后，才会缓慢降解S型底物。

正相手性HPLC检测底物(R和S-甲霜灵)和产物(R和S-甲霜灵酸)。流动相为正己烷：异丙醇＝98：2(加入0.1％的三氟乙酸)，流速:0.5ml/min，检测紫外波长：220nm，柱温：30℃，进样量:10μl，色谱柱：250mm×4mm，大赛璐手性OD柱。色谱仪Waters。

对映体过量值(ee)和底物总转化率(C)以及对映体选择率按以下公式计算：

公式1：

公式2：

公式3：

式中，[S]s和[S]_R分别为样品中S和R型底物的含量，[P]s和[P]_R分别是S和R型产物(酸)的含量，ee_s和ee_p分别为底物和产物对映体过量值。

实施例4：重组酯酶的酶反应动力学

取实施例3方法制备的粗酶液50μL(相当于破碎前湿菌体7.5mg)，加入磷酸缓冲液(100mmol/L，pH8.0)，R,S-甲霜灵至终浓度分别为2.5、5、10、16、25、30、40、50、60、70、80、110mmol/L(甲霜灵的分子量是279g/L)，总反应体系5mL，37℃、180rpm反应10min，用50μL盐酸溶液(4mol/L)终止反应，用实施例3中的正相手性HPLC检测产物生成量，获得的酶反应动力学结果如图5中A。如图可知，酶反应速率和底物浓度的关系符合米氏方程。再用Lineweaver-Burk双倒数作图(见图5中B)，求得V_max＝0.114mmol/(L·min)，K_m＝2.04mmol/L。反应体系中测得酶(蛋白)浓度[E]＝0.156×10^-3mol/L，由K_cat＝V_m/[E]，得K_cat＝0.73min^-1。

实施例5：重组酯酶拆分外消旋甲霜灵生产R-甲霜灵

取实施例3方法制备的粗酶液200mL(相当于破碎前湿菌体3g)，加入20g R,S-甲霜灵和磷酸缓冲液(100mmol/L，pH8.0)构成2000ml总反应体系，37℃、180rpm摇床中反应3h。用氢氧化钠调节反应生成的混合液的pH值至8.5，加入等体积的乙酸乙酯萃取分层，去除有机相得到水相，将水相用盐酸调节pH值为4，加入等体积的乙酸乙酯萃取分层，去除水相得到有机相，再将有机相在35℃～60℃旋转蒸发除去乙酸乙酯，获得R-甲霜灵酸粗品8.63g。

取5g R-甲霜灵酸粗品，溶于40ml无水甲醇中，冰浴滴加1.5ml二氯亚砜(1.1倍于R-甲霜灵酸摩尔量)，滴加完毕后冰浴反应10min，然后回流反应4h，旋蒸浓缩至粘稠的膏状体。将旋蒸产物溶于乙酸乙酯，用质量浓度5％Na₂CO₃水溶液洗涤2次，去离子水洗涤1次。有机相加入无水硫酸镁除水，过滤后旋蒸，得到R-甲霜灵纯品4.72g，产品收率为94.4％，产品的手性纯度为98.8％。

实施例6：重组酯酶RMest与其它蛋白的氨基酸序列比对

在EBI网站采用程序Blast+，在蛋白质数据库中对酯酶RMest进行氨基酸序列比对，选择的数据库是Uniprot KB(包括UnitProt KB/Swiss-Prot and uniProt KB/TrEMBL)，其它参数为缺省值。表1中列出返回结果中前3个最匹配的条目。从表中可知，与酯酶RMest同源性最高(得分值230.3)的蛋白是来自Hyphomicrobium sp.的AB hydrolase-1domain-containing protein(含有Alpha/Beta水解酶-1结构域的蛋白)，氨基酸序列一致性只有40.2％，序列相似性只有57.3％，表明酯酶RMest是一种序列特异性很强的新酯酶蛋白。

表1.用Blast+在UniProt KB数据库中对酯酶RMest进行氨基酸序列比对的结果

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种重组酯酶、编码基因、工程菌及在拆分甲霜灵中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 969

<212> DNA

<213> 白色杆菌(Albibacter sp.)

<400> 1

gctgctaaag cgccgcttcg tctaaaggag ttgaaaacct tctttgtcga tggacagaaa 60

tcgcgttcgg agtacacggc ccttcctgga tcggttttca ctccagaagg cgaagttacc 120

actggtcaaa tgtatgtcca agcttggata ccggagaaaa aaaataaaga tctgcccgcc 180

atcgtcatgt tacatggctc tacgcacagc ggcgcaacat atgagacaac tcccgatggc 240

agggaaggct gggcacatta tttcgcccgt cggggcgtcg ctgtttatat cgtcgatcaa 300

ccgggccgtg gccgatcggg ctttgaccac acgaaaatca tagaggcgaa agcgaccggc 360

aatgtggaaa acttgccggt tccatctgcg tccaatcacg atactgcttg gcaggtcttt 420

cgttttggac aagcgctaaa taaacccttc aagaaaagtc gatttccttt tggatctgtc 480

gatcagtact ggaagcagtt gcttccctca attgaagggc ccggcgcgac gcccgctttg 540

gtaaagcttc tggaccgaat tggtcccgcg gtgctgatgg gtcactcagc aggcggacag 600

ccagtcatca atgcagccct cgaacgtccc gacctcgtca aagcggttgt taacctcgaa 660

gctccgggcg gatgcggtgt cgatgattcg gcaatagata gggcctataa aactgttccg 720

ttgttgagtg tttatggcga cgtagacgtg tcttacgacc cgccgaaagt ctggaaagat 780

ttgtggaata atgcggtgga aagttgtgat aaggcgtcca agaagatcaa ccgcgccggt 840

ggcaaggctc gcaacatcta tcttccaaga aagggaattt ttgggagttc gcatatgttt 900

atgatggatg ataatagcga tgaactagct ggcatcgtct ataagtggct cgttaagaat 960

actaaatag 969

<210> 2

<211> 322

<212> PRT

<213> 白色杆菌(Albibacter sp.)

<400> 2

Ala Ala Lys Ala Pro Leu Arg Leu Lys Glu Leu Lys Thr Phe Phe Val

1 5 10 15

Asp Gly Gln Lys Ser Arg Ser Glu Tyr Thr Ala Leu Pro Gly Ser Val

20 25 30

Phe Thr Pro Glu Gly Glu Val Thr Thr Gly Gln Met Tyr Val Gln Ala

35 40 45

Trp Ile Pro Glu Lys Lys Asn Lys Asp Leu Pro Ala Ile Val Met Leu

50 55 60

His Gly Ser Thr His Ser Gly Ala Thr Tyr Glu Thr Thr Pro Asp Gly

65 70 75 80

Arg Glu Gly Trp Ala His Tyr Phe Ala Arg Arg Gly Val Ala Val Tyr

85 90 95

Ile Val Asp Gln Pro Gly Arg Gly Arg Ser Gly Phe Asp His Thr Lys

100 105 110

Ile Ile Glu Ala Lys Ala Thr Gly Asn Val Glu Asn Leu Pro Val Pro

115 120 125

Ser Ala Ser Asn His Asp Thr Ala Trp Gln Val Phe Arg Phe Gly Gln

130 135 140

Ala Leu Asn Lys Pro Phe Lys Lys Ser Arg Phe Pro Phe Gly Ser Val

145 150 155 160

Asp Gln Tyr Trp Lys Gln Leu Leu Pro Ser Ile Glu Gly Pro Gly Ala

165 170 175

Thr Pro Ala Leu Val Lys Leu Leu Asp Arg Ile Gly Pro Ala Val Leu

180 185 190

Met Gly His Ser Ala Gly Gly Gln Pro Val Ile Asn Ala Ala Leu Glu

195 200 205

Arg Pro Asp Leu Val Lys Ala Val Val Asn Leu Glu Ala Pro Gly Gly

210 215 220

Cys Gly Val Asp Asp Ser Ala Ile Asp Arg Ala Tyr Lys Thr Val Pro

225 230 235 240

Leu Leu Ser Val Tyr Gly Asp Val Asp Val Ser Tyr Asp Pro Pro Lys

245 250 255

Val Trp Lys Asp Leu Trp Asn Asn Ala Val Glu Ser Cys Asp Lys Ala

260 265 270

Ser Lys Lys Ile Asn Arg Ala Gly Gly Lys Ala Arg Asn Ile Tyr Leu

275 280 285

Pro Arg Lys Gly Ile Phe Gly Ser Ser His Met Phe Met Met Asp Asp

290 295 300

Asn Ser Asp Glu Leu Ala Gly Ile Val Tyr Lys Trp Leu Val Lys Asn

305 310 315 320

Thr Lys

Claims

1.一种来源于白色杆菌 Albibactersp.CCTCC NO：M2015650的重组酯酶，其特征在于所述重组酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.一种权利要求1所述重组酯酶的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

3.一种由权利要求2所述编码基因构建的重组载体。

4.一种由权利要求3所述重组载体转化获得的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述重组酯酶在催化R,S-甲霜灵不对称水解制备R-甲霜灵中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含重组酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH8.0磷酸盐缓冲液悬浮，高压匀浆破碎、离心，取上清液即为粗酶液；以粗酶液为催化剂，以R,S-甲霜灵为底物，以pH8.0磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在20-60℃、120-240rpm条件下进行水解反应，反应完全后，获得含R-甲霜灵酸的混合液，将混合液分离纯化，获得R-甲霜灵酸，再将R-甲霜灵酸与甲醇在氯化亚砜催化下生成R-甲霜灵。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂的用量以破碎前湿菌体的重量计为1.5-3g/L反应体系，所述底物终浓度为0.5-35g/L反应体系。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含重组酯酶编码基因的工程菌接种在含卡那霉素50 μg/mL的LB液体培养基中，37℃，180 r/min培养至菌液OD₆₀₀为0.5~0.8，添加IPTG至终浓度为0.6mmol/L，25℃、180r/min诱导培养10h，将菌液在4℃、8000r/min离心10min，弃上清液；取沉淀细胞即湿菌体悬浮于100mmol/L的pH8.0Tris-HCl缓冲液中，4℃下高压匀浆破碎，12000r/min离心20min，取上清液，获得粗酶液；所述悬浮用缓冲液体积用量以湿菌体重量计为50~100ml/g。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述R-甲霜灵按如下方法制备：取R-甲霜灵酸，溶于无水甲醇中，冰浴滴加二氯亚砜，滴加完毕后冰浴反应10 min，然后回流反应4 h，旋蒸浓缩至粘稠的膏状体；将旋蒸产物溶于乙酸乙酯，用质量浓度5%Na₂CO₃水溶液洗涤2次，去离子水洗涤1次，有机相加入无水硫酸镁除水，过滤后旋蒸，得到R-甲霜灵；所述无水甲醇体积用量以R-甲霜灵酸重量计为8ml/g；所述二氯亚砜与R-甲霜灵酸物质的量只比为1:1.1。