CN105296456A - 一种pH稳定性提高的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酸性稳定的谷氨酸脱羧酶(GAD)的pH稳定性向中性范围偏移的突变体，属于生物工程领域。将来源于植物乳杆菌GB01-21谷氨酸脱羧酶的谷氨酸脱羧酶编码基因进行定点突变，主要将第89位的谷氨酸E分别突变为精氨酸R或丙氨酸A。谷氨酸脱羧酶突变体分别在pH6.5时的相对酶活由原来的38％提高至72％或84％，在中性pH范围内的酶活稳定性显著提高。以重组大肠杆菌合成的谷氨酸脱羧酶突变体进行转化时，GABA产量达到260g/L,产率为99.6％；而以重组谷氨酸棒杆菌合成的谷氨酸脱羧酶突变体进行转化时，GABA产量达到116g/L,产率为99.5％。本发明减少了发酵设备在酸性条件下的损耗，为高效合成γ-氨基丁酸奠定了基础。

Description

一种pH稳定性提高的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用
技术领域
本发明公开了一种酸性稳定的谷氨酸脱羧酶(GAD)的pH稳定性向中性范围偏移的突变体，属于生物工程领域。
背景技术
γ-氨基丁酸(GABA)是广泛存在动物、植物和微生物中的一种功能性非蛋白质天然氨基酸，是脊椎动物中枢神经系统中的一种重要的抑制性神经递质，具有镇静、抗惊厥、增进食欲,促进消化、抗氧化等功能，对动物的抗热应激能力、繁殖性能、激素分泌、胴体品质有显著影响。随着对GABA研究的逐渐深入,其功能已经在各个领域得到了广泛的应用，尤其在食品及畜牧业中，对富含GABA的食品、饲料的开发及在动物生产中的应用已成为国内外研究的热点之一，因此，对GABA的研究具有较广阔的前景。在哺乳动物体内GABA只存在于神经组织中，由谷氨酸脱羧酶(Glutamatedecarboxylase，GAD)转化谷氨酸而成。研究发现，乳酸菌、大肠杆菌以及曲霉菌等都是具有GAD活性的微生物菌种。
目前，制备GABA的方法主要包括化学合成法和生物合成法，生物合成法又包括植物富集法和微生物发酵法。化学合成法常用的有两种：一种是以邻苯二甲酰亚氨钾和γ-氯丁氰在180℃反应，产物与浓硫酸回流水解，再经结晶提纯而得；另外一种是以吡咯烷酮作为原料，经碳酸氢铵、氢氧化钙水解制得。最近，杨东元等采用一种新的方法，是以γ-丁内酯为起始原料，经氯化酯化反应生成4-氯丁酸甲酯，再经氨解和皂化反应制得GABA，总收率达57.9％。运用化学合成法生产GABA虽然反应迅速，产品纯度高，但是在生产过程使用了危险溶剂，脱除产品中的有毒成分比较复杂且反应条件苛刻、能耗大、成本大，其主要被应用于化工领域，在食品和医药领域中应用仍存在一定的安全隐患。
大肠杆菌谷氨酸脱羧酶能催化L-谷氨酸裂解为GABA和二氧化碳。植物富集主要是转化途径谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化转化合成GABA，是植物组织对外界条件应激代谢所生成，虽然天然产物提取法在操作上简单易行，但由于植物富集的GABA含量较低且分离提取比较困难，所以不适合规模化生产。而微生物发酵法中谷氨酸脱羧酶(glutamatedecar-boxylase，GAD)是特异性的GABA合成酶，是GABA生物合成的限速酶。GAD已经被发现存在于多种细菌和真核微生物。大肠杆菌、曲霉菌、酵母菌、乳酸菌等微生物己被研究用于GABA规模化生产。谷氨酸脱羧酶能催化L-谷氨酸裂解为GABA和二氧化碳，为提高生产量研究者渐渐开始将研究重点转向GABA限速酶－－谷氨酸脱羧酶(GAD)。通过克隆谷氨酸脱羧酶基因并导入其它菌株来表达，以这种方式来提高发酵产GABA的能力。使GABA的产量最终可达到2.41g/l。而大肠杆菌谷氨酸脱羧酶(GAD)的最适pH过低，为3.8-4.5，酶分子在pH高于6.0时易发生解聚而失活，这限制了它的工业应用。由于工业生产GABA所用底物为L-谷氨酸钠，该物质呈中性偏碱，为了达到L-谷氨酸脱羧酶最适pH条件，生产时必须向反应体系中加入大量的盐酸或硫酸，这一方面造成了额外的原料成本和后续的废水处理成本，另一方面，酸性反应条件对于生产设备的腐蚀性大大增加，加速设备老化，降低了生产设备的使用寿命，也增加了额外的成本。因此，在保持谷氨酸脱羧酶活性的基础上，提高其pH适应性成为工业生产的迫切需要。
因此，本发明公开了一种酸性稳定的谷氨酸脱羧酶(GAD)的pH稳定性向中性范围偏移的突变体，将来源于植物乳杆菌GB01-21谷氨酸脱羧酶的谷氨酸脱羧酶编码基因进行定点突变，其特征在于所述定点突变的基因工程谷氨酸脱羧酶氨基酸序列相对于天然的谷氨酸脱羧酶氨基酸序列的第89位的谷氨酸E分别突变为精氨酸R或丙氨酸A。本发明所述的谷氨酸脱羧酶突变体分别在pH6.5时的相对酶活由原来的38％提高至72％或84％，在中性pH范围内的酶活稳定性显著提高。本发明所得的谷氨酸脱羧酶突变体更加适合工业化的生产需求，为高效合成γ-氨基丁酸奠定了基础。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种pH稳定性向中性范围偏移的谷氨酸脱羧酶突变体(GAD)。是将来源于植物乳杆菌GB01-21谷氨酸脱羧酶第91位的谷氨酸E进行定点突变，分别突变为精氨酸R或丙氨酸A，将含突变后基因的重组质粒pET28a-lpgad转化进入大肠杆菌中进行表达，得到谷氨酸脱羧酶分别在pH6.5时的相对酶活由原来的38％提高至72％或84％的突变体。
编码所述突变后谷氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。
所述突变是将第91位的谷氨酸E分别突变为精氨酸R或丙氨酸A。
获得所述突变体的方法，是以质粒pET28a-lpgad为模版，设计引物，通过PCR进行定点突变得到含有突变后基因的重组质粒pET28a-lpgadER，将pET28a-lpgadEA转化大肠杆菌中表达。
获得所述突变体的方法，具体是：
(1)突变表达载体的构建
通过分析谷氨酸脱羧酶的3D结构，确定91位的谷氨酸E为目的突变为点，设计突变实验，将该位点的谷氨酸分别突变为精氨酸R或丙氨酸A。
以质粒pET28a-lpgadE为模板，根据待突变的氨基酸位点来设计PCR点突变引物，通过重叠延伸PCR进行扩增，得到突变基因；之后分别与pET28a和pXMJ19载体连接分别获得的重组质粒pET28a-lpgadEX和pXMJ19-lpgadEX(X为突变后的氨基酸)；然后将此重组质粒分别转化到E.coliBL21和谷氨酸棒杆菌C.glutamicum13032菌株获得重组菌株，提取质粒进行测序。
(2)含突变体的基因工程菌的获得
制备E.coliBL21(DE3)感受态，将pET28a-lpgadEX的连接液加入120μL的E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，筛选转化子，并提取质粒测序验证。
制备C.glutamicum13032感受态，将pXMJ19-lpgadEX的连接液加入120μL的C.glutamicum13032感受态细胞中，筛选转化子，并提取质粒测序验证。
(3)谷氨酸脱羧酶活力测定
酶活测定方法：酶促反应总体积为500μL，取490μL0.2M的不同pH(3.0～7.0)的缓冲液，其中含有0.01mMPLP、100mML-谷氨酸钠，加入10μL酶液，在反应之前分别把缓冲液和酶液在40℃下预热5min，然后混匀，在40℃下反应30min，最后迅速煮沸终止反应，离心，用5％三氯乙酸(TCA)稀释5倍，在4℃冰箱沉淀蛋白3h左右，然后用HPLC检测。
(4)重组菌发酵生产突变GABA
将斜面保藏的菌种培养12h进行活化，再以5％的接种量接入500ml摇瓶(装液量为100ml)种子培养基中培养24h得到种子液，按10％的接种量将培养好的种子液接入5L全自动发酵罐，先于37℃、250r/min培养至OD600为0.6，再向其中添加乳糖至终浓度为1g/L，同时在线控制pH6.8流加葡萄糖，30℃，诱导发酵14h至OD600为13.6。将培养好的菌体进行离心收集，双蒸水洗涤三次，用乙酸-乙酸钠缓冲液悬浮菌体，在优化后的转化条件下，以50g/L的投料量进行分批投料，，转化24h，反应结束后转化液离心取上清，加入15％的三氯乙酸终止反应，取1ml进行适当稀释后氨基酸自动分析仪测得转化液中产物GABA的浓度。以重组大肠杆菌合成的谷氨酸脱羧酶进行转化时，GABA产量达到260g/L,产率为99.6％；以重组谷氨酸棒杆菌合成的谷氨酸脱羧酶进行转化时，GABA产量达到116g/L,产率为99.5％。
重组菌摇瓶种子培养基(g/L)：葡萄糖1.0，蛋白胨3.0，玉米浆1.5，NaCl0.3，K2HPO40.1，MgSO47H2O0.05。在pH6.5～7.0、121℃下灭菌10min。
重组菌发酵培养基(g/L)：葡萄糖5.0，蛋白胨10，玉米浆7.5，NaCl0.5，K2HPO40.1，MgSO47H2O0.05，L-谷氨酸1.0，生物素2×10-5。pH6.5～7.0、121℃下灭菌10min。
本发明通过定点突变改造谷氨酸脱羧酶基因，将谷氨酸脱羧酶第91位由谷氨酸E分别突变为精氨酸R或丙氨酸A，所得的谷氨酸脱羧酶突变体分别在pH6.5时的相对酶活由原来的38％提高至72％或84％，在中性pH范围内的酶活稳定性显著提高。本发明所得的谷氨酸脱羧酶突变体更加适合工业化的生产需求，为高效合成γ-氨基丁酸奠定了基础。
具体实施方式
实施例1突变表达质粒的构建及重组菌株的获得
根据NCBI中植物乳杆菌植物乳杆菌GB01-21全基因组核酸序列3254376bp中的lpgad基因序列，设计谷氨酸脱羧酶编码基因的两头引物引物，再根据待突变的氨基酸位点来设计PCR点突变中间引物：
利用重叠延伸PCR体外扩增获得突变基因。
用于定点突变的引物为：
P1：5'-GAC(GGATCC)ATGGCAATGTTATACGGTAA-3'(BamHI)
P2：5'-GGC(GCGGCCGC)TCAGTGTGTGAATAGGTATT-3'(NotI)
gadE91Rprimer1：5'-CGACAAATCTCGGTACCCCCGCACGGCCGA-3'
gadE91Rprimer2：5'-TCGGCCGTGCGGGGGTACCGAGATTTGTCG-3'
gadE91Aprimer1：5'-CGACAAATCTGCGTACCCCCGCACGGCCGA-3'
gadE91Aprimer2：5'-TCGGCCGTGCGGGGGTACGCAGATTTGTCG-3'
提取植物乳杆菌GB01-21染色体为模板
PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸120s,30个循环；72℃延伸5min，。将所得突变基因片段经胶回收后分别与pET-28a和pXMJ19连接，分别获得重组质粒pET28a-lpgadEX和pXMJ19-lpgadEX。
制备E.coliBL21(DE3)感受态，将pET28a-lpgadEX的连接液加入120μL的E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌。
制备C.glutamicum13032感受态，将pXMJ19-lpgadEX的连接液加入120μL的C.glutamicum13032感受态细胞中，获得重组谷氨酸棒杆菌。
实施例2突变体谷氨酸脱羧酶的表达及Ni-NTA纯化
取冻管保藏的重组子接种至含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按1％接种量转接发酵培养基，37℃培养至OD约0.6-0.8，加人IPTG至终浓度为0.5mmol/L，16℃过夜诱导表达。IPTG诱导后的菌液经超声波破碎细胞，上清液SDS-PAGE分析，检测到一条分子量约为53kDa的特异性条带，上清液测得比酶活。将过夜诱导表达的菌液于10000r/min，4℃离心15min，收集菌体，用pH7.4PBS缓冲液悬浮菌体，超声波破碎细胞，然后经0.45μm滤膜过滤，选用表达载体pET-28a(+)中含有6·His-Tag编码序列，过Ni-NTA纯化GAD，获得较纯的GAD酶蛋白。
实施例3野生酶和突变酶在不同pH下的稳定性的测定
将上一步得到的纯酶液稀释至浓度为2.5mg/mL，然后分别进行酶促反应。酶促反应总体积为500μL，取490μL0.2M的不同pH(3.0～7.0)的缓冲液，其中含有0.01mMPLP、100mML-谷氨酸钠，加入10μL酶液，在反应之前分别把缓冲液和酶液在40℃下预热5min，然后混匀，在40℃下反应30min，最后迅速煮沸终止反应，离心，用5％三氯乙酸(TCA)稀释5倍，在4℃冰箱沉淀蛋白3h左右，然后用HPLC检测。
结果显示谷氨酸脱羧酶突变体与野生型酶相比分别在pH6.5时的相对酶活由原来的38％提高至72％或84％，在中性pH范围内的酶活稳定性显著提高即有效pH作用范围拓宽。因此能够更好的运用突变体酶，在pH5.5～6.5的条件下，催化GABA的生物合成。
实施例4含突变体谷氨酸脱羧酶的重组菌转化L-谷氨酸产GABA
将斜面保藏的菌种接种至50ml(装液量为10ml)LB培养基中，于旋转式摇床中37℃、160r/min培养12h进行活化；再以5％的接种量接入500ml摇瓶(装液量为100ml)种子培养基中培养菌体，按上述条件培养24h得到种子液；按10％的接种量将培养好的种子液接入5L全自动发酵罐(装液量为3L)，先于37℃、250r/min培养至OD600为0.6，再向其中添加乳糖至终浓度为1g/L，同时在线控制pH6.6流加葡萄糖，30℃，诱导发酵12h至OD600为14。将培养好的菌体进行离心收集，双蒸水洗涤三次，用乙酸-乙酸钠缓冲液悬浮菌体，以50g/L的投料量进行分批投料，前期由于酶活水平较高，反应速率较快，投料间隔为每2h投料一次，随着反应的进行，酶活有所下降，反应速度变慢，12h后，投料时间间隔延长到4h，在转速250r/min、通气量1vvm的条件下转化24h，之后转化液离心取上清，加入15％的三氯乙酸终止反应，取1ml进行适当稀释后用氨基酸自动分析仪测得转化液中产物GABA浓度。

Claims (5)

1.一种在中性pH范围内的酶活及pH稳定性提高的谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，对植物乳杆菌GB01-21来源的谷氨酸脱羧酶编码基因进行定点突变得到；是将谷氨酸脱羧酶氨基酸序列的第89位的谷氨酸E分别突变为精氨酸R或丙氨酸A。
2.权利要求1所述突变体编码基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。
3.含有权利要求2所述基因的质粒或细胞。
4.获得权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，是以质粒pET28a-lpgad为模版，设计引物，通过PCR获得编码突变体的基因及质粒，以大肠杆菌为宿主表达谷氨酸脱羧酶突变体。
5.权利要求1或4所述谷氨酸脱羧酶突变体基因或其编码的谷氨酸脱羧酶突变体在生物合成GABA的应用。
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