CN115725520A - 一种谷胱甘肽合成酶的制备方法及催化生产谷胱甘肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种谷胱甘肽合成酶的制备方法及催化生产谷胱甘肽的方法。本发明所述方法对Listeria monocytogenes来源gshF基因序列进行优化后得到SEQ ID NO.1所示碱基序列，以此为模板构建工程菌；通过对发酵培养基的优化，最终获得了高活性的Listeria monocytogenes来源的谷胱甘肽合成酶。本发明所述方法制备得到的Listeria monocytogenes来源的谷胱甘肽合成酶催化生产谷胱甘肽效率高。

Description

一种谷胱甘肽合成酶的制备方法及催化生产谷胱甘肽的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种谷胱甘肽合成酶的制备方法及催化生产谷胱甘肽的方法。

背景技术

谷胱甘肽(glutathione,GSH)是一种含有γ-酰胺键和巯基的三肽化合物，是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸这三种氨基酸通过肽键缩合而成，化学名为γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸-甘氨酸。谷胱甘肽有还原型和氧化型两种类型，谷胱甘肽的主要活性成分是还原型谷胱甘肽。谷胱甘肽具有解毒、抗氧化、抗惊厥、抗血栓和抗动脉粥样硬化作用。由于谷胱甘肽在众多领域的运用，并且目前大多数的谷胱甘肽的原料药都依赖于进口，大大增加了谷胱甘肽的用药成本和研发经费，所以谷胱甘肽的制备备受国人的关注。谷胱甘肽的制备方法主要有溶剂提取法、发酵法、化学合成法和酶合成法。化学合成法制备GSH，是将L-Glu、L-Cys和Gly经过基团保护、缩合以及脱保护三阶段的一系列化学反应合成GSH，是谷胱甘肽早期的生产方法，生产工艺也较为成熟。但这种方法存在很多缺陷，例如反应步骤繁多，反应时间长，操作过程难度大，产生需要光学拆分的消旋体使得不易分离，谷胱甘肽纯度不高以及对环境会造成污染等。溶剂提取法主要是通过萃取和沉淀相结合的方法，从富含GSH的动植物、酵母等生物组织中提取产物，先使用适当的溶剂或者结合蛋白酶、淀粉酶处理，再进行分离和精制得到最终产物。萃取法的原料以酵母居多，一般使用的都是未经选育和遗传性改造的，因此本身产品含量就低，再通过复杂的工艺流程处理后，总收率很低，致使该方法的成本高，可推广性较差。

专利CN109593735A采用重组菌表达一种双功能谷胱甘肽合成酶，但该酶来自于蜡状芽孢杆菌，并且该专利为加入0.5％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，不仅增加了纯化负担，也不利于谷胱甘肽及ATP分子透过细胞膜壁。

李斯特菌来源的双功能谷胱甘肽合成酶由两个功能性蛋白结构域组成，催化GSH合成的两步反应，见下式。

Streptococcus pasteurianus、Streptococcus infantarius、Streptococcusagalactiae及Streptococcus thermophilus这4种不同菌种来源的双功能酶氨基酸序列相似度达79％，因为它们均为革兰氏阳性菌，同属于链球菌属。Actinobacilluspleuropneumoniae、Pasteurella multocida及Haemophilus parainfluenzae来源的双功能酶氨基酸序列同源性高于80％，可能是因为它们都为革兰氏阴性菌，属于γ-变形菌门。李斯特菌来源的GSH F与其它几株含有双功能酶的菌株同源关系较远，属于厚壁菌门。不同菌种来源的GSH F系统发育树见图1。

发明内容

本发明主要目的是提供一种谷胱甘肽合成酶的制备方法及催化生产谷胱甘肽的方法。本发明所述方法制备得到的Listeria monocytogenes来源的谷胱甘肽合成酶催化生产谷胱甘肽效率高，适用于GSH的大规模生产。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种谷胱甘肽合成酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

工程菌的构建：编码谷胱甘肽合成酶的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，表达载体为pET-28a(+)，宿主菌为：Escherichia coli BL21(DE3)。

将所述工程菌进行种子培养；

将所述工程菌进行发酵培养：将种子液接种于发酵培养基中，设定初始培养温度为30-37℃，待菌体生长至对数生长中期后加入诱导剂进行诱导，并调节温度≤30℃；

所述发酵培养基包括：甘油10-20g/L、蛋白胨8-15g/L、酵母粉5-15g/L、玉米浆5-20g/L、磷酸氢二钠10-20g/L、磷酸二氢钾1-10g/L、氯化铵1-5g/L、硫酸镁0.5-5g/L。

进一步地，所述发酵培养基由以下成分组成：甘油10g/L、蛋白胨8g/L、酵母粉12g/L、玉米浆16g/L、磷酸氢二钠12g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化铵5g/L、硫酸镁2g/L，溶剂为水。

进一步地，所述发酵培养基由以下成分组成：甘油20g/L、蛋白胨8g/L、酵母粉5g/L、玉米浆16g/L、磷酸氢二钠12g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化铵5g/L、硫酸镁0.5g/L，溶剂为水。

进一步地，当所用发酵培养基体积≥5L时，流加碳源与氮源以控制溶氧在临界氧浓度以上。

进一步地，采用氨水控制发酵液pH在6.5-8.5。

进一步地，设置初始搅拌转速为100-200r/min，当发酵液溶氧≤20％时，增加搅拌转速使溶氧维持在20％以上

本发明第二方面提供一种催化生产谷胱甘肽的方法，所述方法包括以下步骤：采用以上第一方面所述方法制备谷胱甘肽合成酶，收集发酵后的菌体；将菌体悬浮后进行高压均质破壁，将均质后的菌液加入到转化体系中进行转化。

进一步地，在500-1000bar压力下进行至少2次高压均质破壁。

进一步地，所述转化体系为：L-谷氨酸1-10g/L，L-半胱氨酸1-5g/L，L-甘氨酸0.5-5g/L，MgSO₄7H₂O 10mmol/L和ATP 10-40mmol/L。

进一步地，转化时温度为30-40℃，体系pH值控制在7.0-9.0。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

本发明所述方法对Listeria monocytogenes来源gshF基因序列进行优化后得到SEQ ID NO.1所示碱基序列，以此为模板构建工程菌；通过对发酵培养基的优化，最终获得了高活性的Listeria monocytogenes来源的谷胱甘肽合成酶。本发明所述方法制备得到的Listeria monocytogenes来源的谷胱甘肽合成酶催化生产谷胱甘肽效率高。

采用本发明所述发酵培养基在发酵罐中大量生产时，所得菌体生物量和酶活均具有较高的水平；且本发明所述培养基成分简单、成本低，适用于谷胱甘肽大规模生产。

附图说明

图1为不同菌种来源的GSH F蛋白序列系统发育树。

图2为本发明实施例1所得重组质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳图：Lane 1为质粒，Lane2为双酶切后的质粒条带，Lane M为DNA Marker。

图3为谷胱甘肽标准品HPLC色谱图。

图4为谷胱甘肽转化液HPLC色谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”、“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作以及它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

发酵所得谷胱甘肽合成酶的酶活检测：将发酵收获的菌体细胞经超声破碎后，加入终浓度为0.2mol/L Tris-HCl、40mmol/L L-Glu、40mmol/L L-Cys、40mmol/L Gly、20mmol/LMgSO₄及ATP，37℃水浴、pH8.5条件下反应10min。采用HPLC检测方法测定酶活反应液中的GSH，计算出GSH F酶活。一个酶活力单位定义为37℃条件下，每分钟催化生成1μmolGSH的酶量。

所得谷胱甘肽采用HPLC检测，具体条件为：色谱柱为C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长为190-235nm；流动相为磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠6.8g与庚烷磺酸钠2.2g，加水1000mL使溶解，用磷酸调节pH值至3.0)与甲醇以95:5的比例混合；进样体积20μL。

实施例1

一种谷胱甘肽合成酶的制备方法，包括以下步骤：

工程菌的构建：采用基因合成获得SEQ ID NO.1所示的核酸序列，然后通过多段重组的方法重组到目的载体pET-28a(+)中，得到全长构建；所述谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

连接方法如下：

处理好的目的片段与载体连接反应体系

5ul 纯化的PCR产物

5ul 酶切后载体

10ul 无缝组装MIX

以上连接液在52℃恒温环境下连接30min

转化的方法如下：

(1)将质粒浓度在100ng/μl的质粒吸取1-3μl加入到100μl的大肠杆菌感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3分钟。

(2)42℃水浴90s。

(3)冰浴中放置3分钟左右。

(4)每管中加入500-800μl 37℃预温LB培养基，37℃摇床200r/min温和振荡40min。

重组子的验证

(1)制备含相应抗性的琼脂平板。

(2)取100μl菌液,然后平铺在含有抗性的琼脂板上，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15min。

(3)倒置平板于37℃培养16h出现菌落。

(4)平板挑菌，在37℃、200r/min摇菌14h，用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液送测序。

(5)测序比对正确的质粒，用XbaI-XhoI进行双酶切，获得2378、5192两个片段。双酶切鉴定图谱如图2所示：

所用鉴定引物为：

F：GGCCCCAAGGGGTTATGCTAGT

R：GATCCCGCGAAATTAATACG

将构建成功的重组质粒在大肠杆菌BL21中进行表达，构建得到能够表达Listeriamonocytogenes来源的谷胱甘肽合成酶的工程菌。

实施例2

一种谷胱甘肽合成酶的制备方法，将活化后的实施例1构建得到的工程菌接种到LB液体培养基中进行种子培养；取甘油管接种于培养皿平板上活化菌种，培养时间24h；将培养皿平板保存于4℃冰箱；用接种环在无菌条件下挖取一环平板种子接种于种子培养基中(50mL/500mL锥形瓶)。培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH自然，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。然后将接种后的种子摇瓶在37℃、180rpm的恒温气浴摇床中培养16h得到小试发酵的种子培养液。

将培养得到的种子液按质量比3％接种到发酵培养基中，在37℃、pH 7.0条件下发酵6h，然后降温至30℃并加入0.3mmol/L的IPTG开始诱导培养，16h后结束发酵。所得谷胱甘肽酶活为216U/L。所述发酵培养基由以下成分组成：甘油10g/L、蛋白胨8g/L、酵母粉12g/L、玉米浆16g/L、磷酸氢二钠12g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化铵5g/L、硫酸镁2g/L，溶剂为去离子水。发酵所得酶活为192U/L。

将菌体在冰水浴条件下超声破壁，破壁结束后，将含有双功能合成酶的粗酶液加入转化体系中，转化体系组成为：L-谷氨酸钠2.5g/L，L-半胱氨酸1.8g/L，L-甘氨酸1.1g/L，另外添加MgSO₄7H₂O 10mmol/L及ATP 25mmol/L。控制温度在37℃，用5M氢氧化钠溶液控制pH在8.5；所得GSH浓度为3.6g/L。

实施例3

一种谷胱甘肽合成酶的制备方法，与实施例2的区别在于，所用发酵培养基不同，其它均与实施例2相同。所述发酵培养基由以下成分组成：甘油20g/L、蛋白胨8g/L、酵母粉5g/L、玉米浆16g/L、磷酸氢二钠12g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化铵5g/L、硫酸镁0.5g/L，溶剂为去离子水。

发酵所得酶活为189U/L，所得GSH浓度为2.7g/L。

实施例4

一种谷胱甘肽合成酶的制备方法，与实施例2的区别在于，所用发酵培养基不同，其它均与实施例2相同。所述发酵培养基由以下成分组成：甘油10g/L、蛋白胨15g/L、酵母粉10g/L、玉米浆10g/L、磷酸氢二钠18g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵2g/L、硫酸镁1g/L，溶剂为去离子水。

发酵所得酶活为176U/L，所得GSH浓度为2.6g/L。

实施例5

一种谷胱甘肽合成酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)工程菌的构建：与实施例1所述步骤相同。

(2)种子液培养：试管斜面种子首先经摇瓶活化扩培，用接种环挖取一环种子接种于种子培养基中，并加入50μg/mL的硫酸卡那霉素抗性筛选质粒。种子培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。在37℃、180r/min条件下培养16h。经检测种子液OD₆₀₀为3.52，镜检短杆，无杂菌。

发酵液培养：10L发酵罐初始装液量为5L。将种子液以3％的接种量接种于10L发酵罐中，发酵培养基为：甘油10g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉10g/L，玉米浆干粉10g/L，磷酸氢二钠18g/L，磷酸二氢钾3g/L，NH₄Cl 2g/L，MgSO₄ 1g/L。设定初始培养温度为37℃，搅拌转速为150r/min。随着培养的进行，菌体量不断增加，重组菌对氧的需求也在提升，当溶氧跌至20％时，增加搅拌转速以使溶氧维持在20％左右，调节通气量至1.5vvm。当OD600增长至12左右时，加入0.3mmol/L的IPTG开始诱导，并调节温度至28℃，采用氨水控制发酵液pH在7.0。继续流加碳源以控制溶氧在临界氧浓度以上。诱导培养18h，菌体OD₆₀₀达到112，湿重达158g/L，酶活为462U/L。离心收集菌体放于-20℃冰箱备用。

菌体冻融3次加入转化体系中，转化体系组成为：L-谷氨酸钠2.5g/L，L-半胱氨酸1.8g/L，L-甘氨酸1.1g/L，另外添加MgSO₄7H₂O 10mmol/L及ATP 35mmol/L。控制温度在37℃，用5M氢氧化钠溶液控制pH在8.5，转化3h结束。所得GSH浓度为4.3g/L。

实施例6

一种催化生产谷胱甘肽的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)采用实施例5所述方法制备谷胱甘肽合成酶，收集发酵后的菌体；

(2)将菌体用纯化水悬浮，然后分别在700bar压力下高压均质破壁2次，转化体系组成为：L-谷氨酸钠3.3g/L，L-半胱氨酸2.4g/L，L-甘氨酸1.5g/L，另外添加MgSO₄7H₂O10mmol/L及ATP 35mmol/L。控制温度在37℃，用5M氢氧化钠溶液控制pH在8.5，转化3h结束。所得GSH浓度为5.1g/L。谷胱甘肽HPLC检测图谱见图3、图4。

实施例7

一种催化生产谷胱甘肽的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)采用实施例5所述方法制备谷胱甘肽合成酶，收集发酵后的菌体；

(2)将菌体用纯化水悬浮，然后分别在1000bar压力下高压均质破壁3次，转化体系组成为：L-谷氨酸钠3.3g/L，L-半胱氨酸2.4g/L，L-甘氨酸1.5g/L，另外添加MgSO₄7H₂O10mmol/L及ATP 35mmol/L。控制温度在37℃，用5M氢氧化钠溶液控制pH在8.5，转化3h结束。所得GSH浓度为5.1g/L。

实施例8

一种催化生产谷胱甘肽的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)采用实施例5所述方法制备谷胱甘肽合成酶，收集发酵后的菌体；

(2)将菌体用纯化水悬浮，然后分别在500bar压力下高压均质破壁2次，转化体系组成为：L-谷氨酸钠3.3g/L，L-半胱氨酸2.4g/L，L-甘氨酸1.5g/L，另外添加MgSO₄7H₂O10mmol/L及ATP 35mmol/L。控制温度在37℃，用5M氢氧化钠溶液控制pH在8.5，转化3h结束。所得GSH浓度为4.9g/L。

对比例1

与实施例6的区别在于，进行高压均质1次，其它步骤均与实施例5相同。所得GSH浓度为3.0g/L。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种谷胱甘肽合成酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

工程菌的构建：编码谷胱甘肽合成酶的和核酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，表达载体为pET-28a(+)，宿主菌为：Escherichia coli BL21(DE3)；

将所述工程菌进行种子培养；

将所述工程菌进行发酵培养：将种子液接种于发酵培养基中，设定初始培养温度为30-37℃，待菌体生长至对数生长中期后加入诱导剂进行诱导，并调节温度≤30℃；

所述发酵培养基包括：甘油10-20g/L、蛋白胨8-15g/L、酵母粉5-15g/L、玉米浆5-20g/L、磷酸氢二钠10-20g/L、磷酸二氢钾1-10g/L、氯化铵1-5g/L、硫酸镁0.5-5g/L。

2.根据权利要求1所述谷胱甘肽合成酶的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基由以下成分组成：甘油10g/L、蛋白胨8g/L、酵母粉12g/L、玉米浆16g/L、磷酸氢二钠12g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化铵5g/L、硫酸镁2g/L，溶剂为水。

3.根据权利要求1所述谷胱甘肽合成酶的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基由以下成分组成：甘油20g/L、蛋白胨8g/L、酵母粉5g/L、玉米浆16g/L、磷酸氢二钠12g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化铵5g/L、硫酸镁0.5g/L，溶剂为水。

4.根据权利要求1所述谷胱甘肽合成酶的制备方法，其特征在于，当所用发酵培养基体积≥5L时，设置初始搅拌转速为100-200r/min，当发酵液溶氧≤20％时，增加搅拌转速使溶氧维持在20％以上。

5.根据权利要求1所述谷胱甘肽合成酶的制备方法，其特征在于，采用氨水控制发酵液pH在6.5-8.5。

6.根据权利要求1所述谷胱甘肽合成酶的制备方法，其特征在于，流加碳源以控制溶氧在临界氧浓度以上。

7.一种催化生产谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求1-6任一项所述方法制备谷胱甘肽合成酶，收集发酵后的菌体；将菌体悬浮后进行高压均质破壁，将均质后的菌液加入到转化体系中进行转化。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在500-1000bar压力下进行至少2次高压均质破壁。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述转化体系为：L-谷氨酸1-10g/L，L-半胱氨酸1-5g/L，L-甘氨酸0.5-5g/L，MgSO₄7H₂O 10mmol/L和ATP 10-40mmol/L。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，转化时温度为30-40℃，体系pH值控制在7.0-9.0。

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