CN109576200A - 一种产谷氨酸消旋酶的重组菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种产谷氨酸消旋酶的重组菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产谷氨酸消旋酶的重组菌及其构建方法和应用，属于生物技术领域，所述重组菌包含藤黄轮丝链霉菌HY61的谷氨酸消旋酶基因MurI，载体为pET32a，宿主菌为E.coli BL21(DE3)，进而利用重组菌发酵的谷氨酸消旋酶催化L‑谷氨酸消旋生产DL‑谷氨酸，反应完成后，经过滤、脱色、等电结晶、抽虑、干燥得DL‑谷氨酸产品。本发明生产方法原料易得，生产工艺简单，反应条件温和，降低了DL‑谷氨酸的生产成本。

Description

一种产谷氨酸消旋酶的重组菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种产谷氨酸消旋酶的重组菌及其构建方法和应用，属于生物 技术领域。
背景技术
DL-谷氨酸主要用作食品鲜味料，也用作生化试剂和发酵用原料，也是氨基 酸类药。同时DL-谷氨酸亦是拆分合成D-谷氨酸的重要原料。近年来，随着科学 研究的深入和各种新药的开发，人们对非天然氨基酸的重要性有了深入的认识， DL-谷氨酸将在医药、食品、饲料及化工等领域广泛应用，市场前景良好。
目前DL-谷氨酸主要以化学合成法进行制备，一种是在酸性或碱性条件下以 水杨醛为催化剂高温高压催化消旋合成，另一种是在高温高压下脱水并消旋为 DL-焦谷氨酸，再在酸性条件下水解为DL-谷氨酸。反应条件剧烈，反应时间长、 能耗高，废水量大环境不友好。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种产谷氨酸消旋酶的重组菌及其构建 方法和应用，所述方法通过构建一种产谷氨酸消旋酶的重组菌，利用该重组菌 生产谷氨酸消旋酶，并利用所述谷氨酸消旋酶生产DL-谷氨酸的方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种产谷氨酸消旋酶的重组菌，所述重组菌包含藤黄轮丝链霉菌HY61的 谷氨酸消旋酶基因MurI，载体为pET32a，宿主菌为E.coli BL21(DE3)；
所述重组菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)克隆藤黄轮丝链霉菌HY61的谷氨酸消旋酶基因MurI，其核苷酸序列 如SEQ IDNo.1所示；
(2)将SEQ ID No.1所示核苷酸序列与载体pET32a双酶切并连接，筛选阳 性克隆得到重组载体pET32a-MurI；
(3)将重组载体pET32a-MurI转化到宿主菌E.coli BL21(DE3)中，得到产谷 氨酸消旋酶的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET32a-MurI。
本发明还提供利用所述重组菌发酵生产谷氨酸消旋酶及酶法转化L-谷氨酸 生产DL-谷氨酸的方法，具体步骤如下：
(1)将构建的重组菌接入LB斜面培养基，37℃培养14～24h；
(2)将斜面培养基培养的重组菌接种于LB液体种子培养基，37℃、200r/min 振荡培养6～12h；
(3)发酵罐中装入发酵培养基，种子液以5～10％种量接入发酵培养基，初始 转速200r/min，初始通气流量为1.5L/min，维持溶氧值在20％以上，调节pH值稳 定在7.0，37℃培养6～10h后降温至24～30℃表达；发酵过程中维持葡萄糖浓 度在3～5g/L；发酵结束后8000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水 洗涤菌体两次。所述菌体中包含有谷氨酸消旋酶。
本发明还提供利用上述步骤生产的谷氨酸消旋酶转化L-谷氨酸生产DL-谷 氨酸的方法，具体步骤如下：将菌体投入转化液中进行转化，其转化条件为： 配制浓度为100～200g/L L-谷氨酸溶液，调节pH为7.0，加入湿菌体至湿菌体的 终浓度为L-谷氨酸溶液浓度的1/20～1/10，湿菌体的终浓度单位为g/L，温度30～ 40℃，在发酵罐上转化生产DL-谷氨酸，发酵过程中不断取样测定反应体系的 旋光度，至旋光度为零时反应结束；发酵液用陶瓷膜过滤去除菌体细胞，超滤 膜过滤去除蛋白，升温至50～70℃，加入10g/L的粉末活性炭，60～80r/min搅拌 脱色20～40min，过滤去除碳粉，调节pH至3.0～3.2，并降温至10～15℃结晶， 抽滤并烘干晶体称重，测定晶体的旋光度。
进一步，所述的LB斜面培养基的成分及终浓度：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5g/L，氨苄西林100mg/L，琼脂20g/L；LB斜面培养基的制备方 法：调节斜面培养基的pH7.0～7.2，然后121℃高压蒸汽灭菌20min。
进一步，所述的LB液体种子培养基的成分及终浓度：酵母浸粉5g/L，蛋白 胨10g/L，NaCl 5g/L，氨苄西林100mg/L；LB液体种子培养基的制备方法： 调节斜面培养基的pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
进一步，所述的发酵培养基的成分及终浓度：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L， 酵母浸粉12g/L，，MgSO4 5g/L，KH2PO4 10g/L，(NH4)2SO4 5g/L，丁二酸2g/L； 发酵培养基的制备方法：调节斜面培养基的pH7.2～7.4，121℃高压蒸汽灭菌20 min。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明采用酶法生产DL-谷氨酸，常压反应无需高温高压，对设备的要求低， 生物酶催化反应专一性强，产物单一没副产物，同时本发明所述的生产方法所 使用的原料廉价易得，使得整体生产成本较低。本发明经过简单的过滤、脱色、 结晶就可以拿到合格的产品，无需精制提纯，其生产工艺简单易行，产品化学 纯度高，比旋光度为零，制造成本低。
具体实施方式
为阐明对本项发明特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本发 明做进一步阐述。
实施例1：工程菌构建
藤黄轮丝链霉菌菌株HY61，分离自烟台海域海底沉积物，保藏于中国普通 微生物菌种保藏管理中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日 期为2017年12月13日，分类命名为藤黄轮丝链霉菌(Streptomyces luteoverticillatus)，保藏编号为：CGMCC No.15060。
通过对藤黄轮丝链霉菌HY61进行全基因组测序获得MurI基因序列(SEQ IDNo.1)，根据该序列设计含有Nco I酶切位点的上游引物F-MurI：5′ -accatggctgtgaagatcgcgctcatcgac-3′，和含有Xho I酶切位点的下游引物R-MurI： 5′-tctcgagtcaggagcgcgcggcgctcacg-3′。通过细菌基因组DNA提取试剂盒提取得 到藤黄轮丝链轮丝菌基因组DNA，并以该基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR 反应体系包括10×ExTaqbuffer(Mg2+Plus)5μL，dNTPs mixture 4.0μL， TaKaRa ExTaq 0.5μL，模板1.0μL，上下游引物各1.0μL，用dd H2O补足至50 μL。PCR反应参数为：94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环后， 72℃延伸10min。PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶检测，并用AxyPrep DNA凝 胶回收试剂盒纯化目标DNA片段。用Nco I和Xho I分别酶切载体pET32a及MurI 片段，然后用DNA连接酶将MurI片段与载体连接并转化E.coli DH5α。阳性克 隆利用菌落PCR和酶切鉴定验证正确后，获得pET32a-MurI重组质粒，该重组质 粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得含有谷氨酸消旋酶的重组菌。
实施例2利用重组菌发酵生产谷氨酸消旋酶及酶法转化L-谷氨酸生产DL- 谷氨酸
(1)将构建的基因工程菌接入LB斜面培养基37℃培养16h；
(2)接1环斜面菌种于LB液体种子培养基，37℃、200r/min振荡培养6h；
(3)5L发酵罐中装入3.0L培养基，种子液以5％种量接入发酵培养基，初始 转速200r/min，初始通气流量为1.5L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流 量，以维持溶氧值在20％以上，用25％氨水调节pH值稳定在7.0，37℃培养7h 降温至30℃表达。发酵过程中流加500g/L的葡萄糖溶液维持葡萄糖浓度在3-5g/L。 发酵结束后8000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次， 该菌体中含有谷氨酸消旋酶。
(4)将菌体投入转化液中进行转化，其转化条件为：配制100g/L L-谷氨酸溶 液2L，NaOH调节pH为7.0，加入湿菌体10g，温度30℃，在3L自控发酵罐上转 化生产DL-谷氨酸，反应1h旋光度降为零。陶瓷膜过滤去除菌体细胞，超滤膜过 滤去除蛋白，升温至50℃，加入10g/L的粉末活性炭，60r/min搅拌脱色40min， 过滤去除碳粉，硫酸调节pH至3.0，并降温至10℃结晶，抽滤并烘干晶体称重， 得DL-谷氨酸179g，纯度为99.5％，旋光度为零。
实施例3利用重组菌发酵生产谷氨酸消旋酶及酶法转化L-谷氨酸生产DL- 谷氨酸
(1)将构建的基因工程菌接入LB斜面培养基37℃培养15h；
(2)接1环斜面菌种于LB液体种子培养基，37℃、200r/min振荡培养8h；
(3)5L发酵罐中装入3.0L培养基，种子液以7％种量接入发酵培养基，初始 转速200r/min，初始通气流量为1.5L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流 量，以维持溶氧值在20％以上，用25％氨水调节pH值稳定在7.0，37℃培养7h 降温至28℃表达。发酵过程中流加500g/L的葡萄糖溶液维持葡萄糖浓度在3-5g/L。 发酵结束后8000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次。
(4)将菌体投入转化液中进行转化，其转化条件为：配制150g/L L-谷氨酸溶 液2L，NaOH调节pH为7.0，加入湿菌体15g，温度30℃，在3L自控发酵罐上转 化生产DL-谷氨酸，反应2h旋光度降为零。陶瓷膜过滤去除菌体细胞，超滤膜过 滤去除蛋白，升温至60℃，加入10g/L的粉末活性炭，60r/min搅拌脱色30min， 过滤去除碳粉，硫酸调节pH至3.0，并降温至10℃结晶，抽滤并烘干晶体称重， 得DL-谷氨酸271.2g，纯度为99.2％，旋光度为零。
实施例4利用重组菌发酵生产谷氨酸消旋酶及酶法转化L-谷氨酸生产DL- 谷氨酸
(1)将构建的基因工程菌接入LB斜面培养基37℃培养16h；
(2)接1环斜面菌种于LB液体种子培养基，37℃、200r/min振荡培养8h；
(3)5L发酵罐中装入3.0L培养基，种子液以7％种量接入发酵培养基，初始 转速200r/min，初始通气流量为1.5L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流 量，以维持溶氧值在20％以上，用25％氨水调节pH值稳定在7.0，37℃培养6h 降温至26℃表达。发酵过程中流加500g/L的葡萄糖溶液维持葡萄糖浓度在3-5g/L。 发酵结束后8000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次。
(4)将菌体投入转化液中进行转化，其转化条件为：配制200g/L L-谷氨酸溶 液2L，NaOH调节pH为7.0，加入湿菌体20g，温度33℃，在3L自控发酵罐上转 化生产DL-谷氨酸，反应2.5h旋光度降为零。陶瓷膜过滤去除菌体细胞，超滤膜 过滤去除蛋白，升温至60℃，加入10g/L的粉末活性炭，60r/min搅拌脱色40min， 过滤去除碳粉，硫酸调节pH至3.0，并降温至12℃结晶，抽滤并烘干晶体称重， 得DL-谷氨酸365.3g，纯度为99.6％，旋光度为零。
序列表
<110> 鲁东大学
<120> 一种产谷氨酸消旋酶的重组菌及其构建方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 798
<212> DNA
<213> 藤黄轮丝链霉菌HY61(Streptomyces luteoverticillatusHY61)
<400> 1
gtgaagatcg cgctcatcga ctccggaaac ggcctgctgg cagcggccgc cgccgtgcgc 60
cggctgcgcc ccgacgccga tctggtcctc tcctccgacc cggccagcat gccgtggggc 120
ccccgcaccc ccgaggacct cacccggcac gccctggcct gcgcccgcgc ggccgccgcg 180
caccggcccg acgcgctgat cgtggcctgc aacacggcct cggtccacgc gctggaggcc 240
atacgcgccg agctggagcc gggcctcccc gtcatcggga ccgtcccggc gatcaagccg 300
gcggcggccg acggcggacc cgtcgccatc tgggccaccc ccgccaccac cggcagcccc 360
taccagcgcg ggctgatccg cgacttcgcc gccggggtcg aggtcaccga ggtgccctgc 420
cccggtctcg ccgacgccgt ggagcacgcc gacgcggacg ccatcgccgc cgcggtgcgc 480
gccgccgccg ccaacacgcc ggccgatgtg cgcggcctcg tcctgggctg cacccactac 540
gagctggtcg ccgagcgcat ccgcgccgcc gtcgccgaga tccagacgcc cggcgccccg 600
ccggtggagc tgtacggctc cgccacggcc gtggccaccc aggcgctgcg ccgcgccggt 660
accgagcccg accccggcgc cgcgcccacg ggccgtgtga ccgtgctgct caccggtcgc 720
gagggggagc tgggggcggc ttcgctcggc tacgccgagg gccgttcgct cggtgccgtg 780
agcgccgcgc gctcctga 798

Claims (7)

1.一种产谷氨酸消旋酶的重组菌，其特征在于所述重组菌包含藤黄轮丝链霉菌HY61的谷氨酸消旋酶基因MurI，载体为pET32a，宿主菌为E.coli BL21(DE3)。
2.权利要求1所述重组菌的构建方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
(1)克隆藤黄轮丝链霉菌HY61的谷氨酸消旋酶基因MurI，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
(2)将SEQ ID No.1所示核苷酸序列与载体pET32a双酶切并连接，筛选阳性克隆得到重组载体pET32a-MurI；
(3)将重组载体pET32a-MurI转化到宿主菌E.coli BL21(DE3)中，得到产谷氨酸消旋酶的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET32a-MurI。
3.利用权利要求1或2所述重组菌发酵生产谷氨酸消旋酶的方法，所述方法具体步骤如下：
(1)将构建的重组菌接入LB斜面培养基，37℃培养14～24h；
(2)将斜面培养基培养的重组菌接种于LB液体种子培养基，37℃、200r/min振荡培养6～12h；
(3)发酵罐中装入发酵培养基，种子液以体积比5～10％种量接入发酵培养基，初始转速200r/min，初始通气流量为1.5L/min，维持溶氧值在20％以上，调节pH值稳定在7.0，37℃培养6～10h后降温至24～30℃表达；发酵过程中维持葡萄糖浓度在3～5g/L；发酵结束后8000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次。
4.利用权利要求3所述步骤生产的谷氨酸消旋酶转化L-谷氨酸生产DL-谷氨酸的方法，具体步骤如下：将菌体投入转化液中进行转化，其转化条件为：配制浓度为100～200g/L L-谷氨酸溶液，调节pH为7.0，加入湿菌体至湿菌体的终浓度为L-谷氨酸溶液浓度的1/20～1/10，湿菌体的终浓度单位为g/L，温度30～40℃，在发酵罐上转化生产DL-谷氨酸，发酵过程中不断取样测定反应体系的旋光度，至旋光度为零时反应结束；发酵液用陶瓷膜过滤去除菌体细胞，然后用超滤膜过滤去除蛋白，升温至50～70℃，加入10g/L的粉末活性炭，60～80r/min搅拌脱色20～40min，过滤去除碳粉，使用硫酸调节pH至3.0～3.2，并降温至10～15℃结晶，抽滤并烘干晶体称重，并测定晶体的旋光度。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的LB斜面培养基的成分及终浓度：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，氨苄西林100mg/L，琼脂20g/L；LB斜面培养基制备方法：调节斜面培养基的pH7.0～7.2，然后121℃高压蒸汽灭菌20min。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的LB液体种子培养基的成分及终浓度：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，氨苄西林100mg/L；制备方法：调节斜面培养基的pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的发酵培养基的成分及终浓度：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉12g/L，MgSO4 5g/L，KH2PO4 10g/L，(NH4)2SO4 5g/L，丁二酸2g/L；发酵培养基的制备方法：调节斜面培养基的pH7.2～7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min。
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