CN104152498A - 一种酶法生产α-酮戊二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种酶法生产α-酮戊二酸的方法，分别合成glr基因和daao基因，构建表达载体pET24a-glr的构建和表达载体pET24a-daao；表达载体pET24a-glr和表达载体pET24a-daao分别双酶切后连接，构建双表达载体pET24a-glr-daao转入大肠杆菌，制备同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌；在发酵罐中加入该工程菌的湿菌体至水中，然后加入L-谷氨酸、过氧化氢酶，最后用氢氧化钠调pH，制备出反应体系进行反应；将反应结束的反后应体系中转化出的α-酮戊二酸进行分离纯化；本发明成本低，转化率和产物浓度高，转化率达到84%以上，更适合工业应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产α-酮戊二酸的方法，具体的说是酶法生产α-酮戊二酸的方法。
背景技术
α-酮戊二酸（α-Ketoglutaric acid）是细胞糖代谢的一种关键物质，参与了很多的细胞生化代谢途径，包括三羧酸循环、氨基酸和蛋白质代谢等。α-酮戊二酸在工业上用途广泛，可作为膳食补充剂、用于合成一些杂环化合物的组件，作为人类和动物氧化应激反应的保护剂、与其他物质配合能够提高运动员成绩和促进康复等。
α-酮戊二酸生产方法有多种，如化学合成法，微生物发酵法、酶促转化法等。化学合成法以琥珀酸和草酸二乙酯为原料经化学反应制备，由于成本过高、污染严重而被淘汰。微生物发酵法主要以诱变育种获得的荧光假单胞菌、解脂耶氏酵母等微生物以甘油、矿物油或菜籽油等原料发酵获得，该方法产量高、转化率高，是目前国外用的较多的一种方法，但该方法的缺陷在于发酵副产物较多，尤其是会有较多丙酮酸产生，而丙酮酸和α-酮戊二酸性质较为接近，给后续的分离纯化工作带来很大的困难，导致收率降低，纯化成本过高等问题。酶促转化法主要目前报道的有以L-谷氨酸为底物，利用L-谷氨酸氧化酶催化形成α-酮戊二酸，该反应结束后，体系中主要产物为α-酮戊二酸，副产物氧气和水易于除去，分离纯化工艺简单，纯化收率高。但L-谷氨酸氧化酶在常用的大肠杆菌宿主中表达困难，活性不高，提高了发酵的成本。
发明内容
本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种酶法生产α-酮戊二酸的方法，利用谷氨酸消旋酶将L-谷氨酸转化为D-谷氨酸，然后利用高活性的D-氨基酸氧化酶将生成的D-谷氨酸进一步转化为α-酮戊二酸，从而有效的避免了L-谷氨酸氧化酶发酵成本过高的难题，同时也避免了发酵法产物分离纯化困难的缺陷，有利于工业化生产。
一种酶法生产α-酮戊二酸的方法，以L-谷氨酸为底物，经谷氨酸消旋酶催化，将L-谷氨酸转化为DL-谷氨酸混旋物；混旋物中的D-谷氨酸与反应体系中的氧气和水在D-氨基酸氧化酶催化下生成α-酮戊二酸、氨和过氧化氢；随着D-谷氨酸的被消耗，L-谷氨酸在消旋酶的作用下持续生成DL-谷氨酸，直至全部转化为D-谷氨酸，并最终形成α-酮戊二酸；反应过程中生成的α-酮戊二酸在过氧化氢存在下易发生脱羧反应生成丁二酸，因此，反应体系需加入过氧化氢酶，以便将反应生成的过氧化氢水解成水和氧气，避免α-酮戊二酸被氧化。
一种酶法生产α-酮戊二酸的方法，其具体生产方法的步骤为：
步骤一、同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建
(1)、表达载体pET24a-glr的构建
a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于枯草芽孢杆菌IFO 3336编码谷氨酸消旋酶的glr基因序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI，起始密码子由TTG改为ATG后，进行全基因合成，合成的glr基因具体序列如SEQ ID NO：1；
b、将合成的glr基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；
c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的glr基因片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；
d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得glr表达载体pET24a-glr；
(2)、表达载体pET24a-daao的构建
a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于变异三角酵母CBS4095菌株中编码D-氨基酸氧化酶的基因daao序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI后，进行全基因合成，合成的daao基因具体序列如SEQ ID NO：2；
b、将合成的daao基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；
c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的daao片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；
d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得daao表达载体pET24a-daao；
(3)、同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建
a、将构建好的表达载体pET24a- daao，用BglII和HindIII双酶切，回收包含了T7启动子、核糖体结合位点和daao基因编码序列的片段，纯化备用；
b、构建好的表达载体pET24a-glr，用BamHI和HindIII双酶切，纯化，利用BglII和BamHI同尾酶的特性与上述a中所准备好的基因片段连接，得到连接后基因片段，备用；
c、将上述连接后基因片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子并测序鉴定；抽提质粒获得glr和daao双表达载体pET24a-glr-daao；
d、将双表达载体pET24a-glr-daao转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌；
步骤二、D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因工程菌的培养
将上述步骤一所制备的同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌进行培养，培养的过程中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，最后收集菌体，得到同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌，备用；所述同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌培养方法为：
(1)、步骤一所述同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌单菌落接种到LB液体培养基中，置于37℃过夜培养，得到基因工程菌种子培养液；
(2)、将所培养的基因工程菌种子培养液分别接种到TB培养基中，接种量为TB培养基体积的2%；然后置于37℃培养5小时左右，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度0.2mmol/L，降温至25℃继续培养20小时左右，培养结束，离心收集同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌。
步骤三、以L-谷氨酸为原料，转化生产α-酮戊二酸
在发酵罐中加入同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌湿菌体至水中，湿菌体的质量为水质量的3-5%，然后加入L-谷氨酸至终浓度90-100g/L，再加入过氧化氢酶至浓度为100万-400万单位/升，最后用氢氧化钠调pH至7.5-8.2，即制备出转化体系；水浴保持反应体系在30-40℃，通气搅拌反应，即将反应体系中的L-谷氨酸转化为α-酮戊二酸；检测反应体系中α-酮戊二酸的含量；色谱柱：HILIC色谱柱 4.6*250*5；流动相：PH3.3-3.5的质量浓度为3%磷酸二氢:水=1:3；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；波长：205。
步骤四、α-酮戊二酸的分离纯化
将反应体系中转化出的α-酮戊二酸进行分离纯化即生产出α-酮戊二酸，具体操作方法为：反应结束后，将反应液12000rpm离心10min；取上清液，在上清液中加入其质量0.5%的活性炭，搅拌脱色30分钟，收集滤液进行减压浓缩，加入上清液质量2.5%的晶种，缓慢搅拌冷却至室温结晶4小时以上，抽滤收集晶体；抽滤得到的晶体，40℃真空干燥，得到α-酮戊二酸。
有益效果是：
1、本发明提供的酶法生产α-酮戊二酸的方法，初始原料为L-谷氨酸，价格便宜。反应结束后，生成的氨、水、氧气易于除去，对产品的分离纯化没有干扰，水相体系中只剩下α-酮戊二酸，易于分离，有助于提高产品纯度和收率，降低分离成本。本发明的通过谷氨酸消旋酶将廉价原料L-谷氨酸转化为D-谷氨酸，利用高活性的D-氨基酸氧化酶将D-谷氨酸转化为α-酮戊二酸，避免了L-谷氨酸氧化酶活性过低导致的转化反应慢的缺陷。
2、本发明提供的酶法生产α-酮戊二酸的方法，所需的谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶均可通过构建大肠杆菌基因工程菌，然后通过发酵大量制备，相对易得和廉价。所述反应为“一锅煮”式，底物和所有酶同时加入开始反应，直接得到终产物α-酮戊二酸，中间无需分离提纯。工艺成本低，转化率和产物浓度高，转化率达到84%以上，并且没有副产物影响，该工艺方法适合工业应用。
附图说明
图1是本发明酶法生产α-酮戊二酸的方法的反应原理图。
具体实施方式
一种酶法生产α-酮戊二酸的方法，以L-谷氨酸为底物，经谷氨酸消旋酶催化，将L-谷氨酸转化为DL-谷氨酸混旋物；混旋物中的D-谷氨酸与反应体系中的氧气和水在D-氨基酸氧化酶催化下生成α-酮戊二酸、氨和过氧化氢；随着D-谷氨酸的被消耗，L-谷氨酸在消旋酶的作用下持续生成DL-谷氨酸，直至全部转化为D-谷氨酸，并最终形成α-酮戊二酸；反应过程中生成的α-酮戊二酸在过氧化氢存在下易发生脱羧反应生成丁二酸，因此，反应体系需加入过氧化氢酶，以便将反应生成的过氧化氢水解成水和氧气，避免α-酮戊二酸被氧化。
一种酶法生产α-酮戊二酸的方法，其具体生产方法的步骤为：
步骤一、同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建
(1)、表达载体pET24a-glr的构建
a、根据GenBank: AB003685.1所述的来自于枯草芽孢杆菌IFO 3336编码谷氨酸消旋酶的glr基因序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI，起始密码子由TTG改为ATG，全基因合成，其具体序列如SEQ ID NO：1，即：
CATatggaacaaccaataggagtcattgattccggggttggcggtttaaccgttgcgaaggaaatcatgagacagctacctaaagaaaatattatctacgtcggggatacgaaacggtgtccttatggtccgcgccctgaagaagaggtgcttcaatatacgtgggagctgacgaattatttactcgaaaaccaccacatcaaaatgctcgtgatcgcctgtaatacagcaacagcgatcgctttggatgacatccagcgcagcgtcggcataccggtggtcggagtcatccagcctggtgcgagagcagcgataaaagtgacggataatcagcatatcggtgtcatcggcacagagaatacgattaagagcaatgcatacgaagaagcgcttttggcattaaaccctgatttgaaggttgaaaaccttgcctgcccgctgcttgtgccttttgtggaaagcgggaagtttctcgacaaaacagcagacgagattgttaaaacctcgctgtatccgttaaaagacacatcaattgattcgctgattttaggctgcacccattaccctattttaaaagaagccattcaaagatatatgggagagcacgtaaacattatttcgtccggcgatgaaacagcccgggaagtcagcacaattctctcttataaagggctgctgaaccagtctccgattgccccggatcatcagttcctgacaacaggggcgcgtgatcagtttgcaaaaatcgcagacgattggtttggccatgaagtcgggcatgtggaatgtatctcactgcaagaaccgattaaaagatagGGATCC
b、将合成的glr基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；
c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的glr基因片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；
d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得glr表达载体pET24a-glr；
(2)、表达载pET24a-daao的构建
a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于变异三角酵母CBS4095菌株中编码D-氨基酸氧化酶的基因daao序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI，全基因合成，其具体序列如SEQ ID NO：2，即CATatggctaaaatcgttgttattggtgccggtgttgccggtttaactacagctcttcaacttcttcgtaaaggacatgaggttacaattgtgtccgagtttacgcccggtgatcttagtatcggatatacctcgccttgggcaggtgccaactggctcacattttacgatggaggcaagttagccgactacgatgccgtctcttatcctatcttgcgagagctggctcgaagcagccccgaggctggaattcgactcatcagccaacgctcccatgttctcaagcgtgatcttcctaaactggaagttgccatgtcggccatctgtcaacgcaatccctggttcaaaaacacagtcgattctttcgagattatcgaggacaggtccaggattgtccacgatgatgtggcttatctagtcgaatttcgttccgtttgtatccacaccggagtctacttgaactggctgatgtcccaatgcttatcgctcggcgccacggtggttaaacgtcgagtgaaccatatcaaggatgccaatttactacactcctcaggatcacgccccgacgtgattgtcaactgtagtggtctctttgcccggttcttgggaggcgtcgaggacaagaagatgtaccctattcgaggacaagtcgtccttgttcgaaactctcttccttttatggcctccttttccagcactcctgaaaaagaaaatgaagacgaagctctatatatcatgacccgattcgatggtacttctatcattggcggttgtttccaacccaacaactggtcatccgaacccgatccttctctcacccatcgaatcctgtctagagccctcgaccgattcccggaactgaccaaagatggccctcttgacattgtgcgcgaatgcgttggccaccgtcctggtagagagggcggtccccgagtagaattagagaagatccccggcgttggctttgttgtccataactatggtgccgccggtgctggttaccaatcctcttacggcatggctgatgaagctgtttcttacgtcgaaagagctcttactcgtccaaacctttagGGATCC
b、将合成的daao基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；
c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的daao片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；
d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得daao表达载体pET24a-daao；
(3)、同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建
a、将构建好的表达载体pET24a- daao，用BglII和HindIII双酶切，回收包含了T7启动子、核糖体结合位点和daao基因编码序列的片段，纯化备用；
b、构建好的表达载体pET24a-glr，用BamHI和HindIII双酶切，纯化，利用BglII和BamHI同尾酶的特性与上述a中所准备好的基因片段连接，得到连接后基因片段，备用；
c、将上述连接后基因片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子并测序鉴定；抽提质粒获得glr和daao双表达载体pET24a-glr-daao；
d、将双表达载体pET24a-glr-daao转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌；
步骤三、D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因工程菌的培养
将上述步骤一所制备的同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌进行培养，培养的过程中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，最后收集菌体，得到同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌，备用；所述同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌培养方法为：
(1)、步骤一所述同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌单菌落接种到LB液体培养基中，置于37℃过夜培养，得到基因工程菌种子培养液；
(2)、将所培养的基因工程菌种子培养液分别接种到TB培养基中，接种量为TB培养基体积的2%；然后置于37℃培养5小时左右，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度0.2mmol/L，降温至25℃继续培养20小时左右，培养结束，离心收集同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌。
步骤四、以L-谷氨酸为原料，转化生产α-酮戊二酸
在发酵罐中加入同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌湿菌体至水中，湿菌体的质量为水质量的3-5%，然后加入L-谷氨酸至终浓度90-100g/L，再加入过氧化氢酶至浓度为100万-400万单位/升，最后用氢氧化钠调pH至7.5-8.2，即制备出转化体系；水浴保持反应体系在30-40℃，通气搅拌反应，即将反应体系中的L-谷氨酸转化为α-酮戊二酸；检测反应体系中α-酮戊二酸的含量；色谱柱：HILIC色谱柱 4.6*250*5；流动相：PH3.3-3.5的质量浓度为3%磷酸二氢:水=1:3；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；波长：205。
步骤五、α-酮戊二酸的分离纯化
将反应体系中转化出的α-酮戊二酸进行分离纯化即生产出α-酮戊二酸，具体操作方法为：反应结束后，将反应液12000rpm离心10min；取上清液，在上清液中加入其质量0.5%的活性炭，搅拌脱色30分钟，收集滤液进行减压浓缩，加入上清液质量2.5%的晶种，缓慢搅拌冷却至室温结晶4小时以上，抽滤收集晶体；抽滤得到的晶体，40℃真空干燥，得到α-酮戊二酸。
所述的LB液体培养基的组成成份：按重量百分比LB液体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、3%的氯化钠，余量为水。
所述TB培养基的组成成份：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油4g/L，磷酸二氢钾17mmol/L，磷酸氢二钾72mmol/L。
以下实施例中的试剂均为常用试剂，可从市场购买得到，所述的过氧化氢酶购买自生工生物(上海)股份有限公司。
实施例1
步骤一、同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建
(1)、表达载体pET24a-glr的构建
a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于枯草芽孢杆菌IFO 3336编码谷氨酸消旋酶的glr基因序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI，起始密码子由TTG改为ATG后，进行全基因合成，合成的glr基因具体序列如SEQ ID NO：1；
b、将合成的glr基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；
c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的glr基因片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；
d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得glr表达载体pET24a-glr；
(2)、表达载体pET24a-daao的构建
a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于变异三角酵母CBS4095菌株中编码D-氨基酸氧化酶的基因daao序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI后，进行全基因合成，合成的daao基因具体序列如SEQ ID NO：2；
b、将合成的daao基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；
c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的daao片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；
d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得daao表达载体pET24a-daao；
(3)、同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建
a、将构建好的表达载体pET24a- daao，用BglII和HindIII双酶切，回收包含了T7启动子、核糖体结合位点和daao基因编码序列的片段，纯化备用；
b、构建好的表达载体pET24a-glr，用BamHI和HindIII双酶切，纯化，利用BglII和BamHI同尾酶的特性与上述a中所准备好的基因片段连接，得到连接后基因片段，备用；
c、将上述连接后基因片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子并测序鉴定；抽提质粒获得glr和daao双表达载体pET24a-glr-daao；
d、将双表达载体pET24a-glr-daao转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌；
步骤二、D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因工程菌的培养
将上述步骤一所制备的同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌进行培养，培养的过程中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，最后收集菌体，得到同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌，备用；
步骤三、以L-谷氨酸为原料，转化生产α-酮戊二酸
在发酵罐中加入同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌湿菌体至水中，湿菌体的质量为水质量的4%，然后加入L-谷氨酸至终浓度95g/L，再加入过氧化氢酶至浓度为150万单位/升，最后用氢氧化钠调pH至8.0，即制备出转化体系；水浴保持反应体系在35℃，通气搅拌反应，即将反应体系中的L-谷氨酸转化为α-酮戊二酸；利用高效液相色谱检测反应体系中α-酮戊二酸含量为84.5g/L，转化率达到84.5%；
步骤四、α-酮戊二酸的分离纯化
将反应体系中转化出的α-酮戊二酸进行分离纯化即生产出α-酮戊二酸。最后得到产品纯度为99%，纯化收率80%。
实施例2
步骤一、同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建
(1)、表达载体pET24a-glr的构建
a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于枯草芽孢杆菌IFO 3336编码谷氨酸消旋酶的glr基因序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI，起始密码子由TTG改为ATG后，进行全基因合成，合成的glr基因具体序列如SEQ ID NO：1；
b、将合成的glr基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；
c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的glr基因片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；
d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得glr表达载体pET24a-glr；
(2)、表达载体pET24a-daao的构建
a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于变异三角酵母CBS4095菌株中编码D-氨基酸氧化酶的基因daao序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI后，进行全基因合成，合成的daao基因具体序列如SEQ ID NO：2；
b、将合成的daao基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；
c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的daao片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；
d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得daao表达载体pET24a-daao；
(3)、同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建
a、将构建好的表达载体pET24a- daao，用BglII和HindIII双酶切，回收包含了T7启动子、核糖体结合位点和daao基因编码序列的片段，纯化备用；
b、构建好的表达载体pET24a-glr，用BamHI和HindIII双酶切，纯化，利用BglII和BamHI同尾酶的特性与上述a中所准备好的基因片段连接，得到连接后基因片段，备用；
c、将上述连接后基因片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子并测序鉴定；抽提质粒获得glr和daao双表达载体pET24a-glr-daao；
d、将双表达载体pET24a-glr-daao转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌；
步骤二、D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因工程菌的培养
将上述步骤一所制备的同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌进行培养，培养的过程中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，最后收集菌体，得到同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌，备用；
步骤三、以L-谷氨酸为原料，转化生产α-酮戊二酸
在发酵罐中加入同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌湿菌体至水中，湿菌体的质量为水质量的3%，然后加入L-谷氨酸至终浓度90g/L，再加入过氧化氢酶至浓度为400万单位/升，最后用氢氧化钠调pH至7.5，即制备出转化体系；水浴保持反应体系在30℃，通气搅拌反应，即将反应体系中的L-谷氨酸转化为α-酮戊二酸；利用高效液相色谱检测反应体系中α-酮戊二酸含量为128.5g/L，转化率达到85.6%。
步骤四、α-酮戊二酸的分离纯化
将反应体系中转化出的α-酮戊二酸进行分离纯化即生产出α-酮戊二酸；最后得到产品纯度为98%，纯化收率72%。
实施例3
步骤一、同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建
(1)、表达载体pET24a-glr的构建
a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于枯草芽孢杆菌IFO 3336编码谷氨酸消旋酶的glr基因序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI，起始密码子由TTG改为ATG后，进行全基因合成，合成的glr基因具体序列如SEQ ID NO：1；
b、将合成的glr基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；
c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的glr基因片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；
d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得glr表达载体pET24a-glr；
(2)、表达载体pET24a-daao的构建
a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于变异三角酵母CBS4095菌株中编码D-氨基酸氧化酶的基因daao序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI后，进行全基因合成，合成的daao基因具体序列如SEQ ID NO：2；
b、将合成的daao基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；
c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的daao片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；
d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得daao表达载体pET24a-daao；
(3)、同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建
a、将构建好的表达载体pET24a- daao，用BglII和HindIII双酶切，回收包含了T7启动子、核糖体结合位点和daao基因编码序列的片段，纯化备用；
b、构建好的表达载体pET24a-glr，用BamHI和HindIII双酶切，纯化，利用BglII和BamHI同尾酶的特性与上述a中所准备好的基因片段连接，得到连接后基因片段，备用；
c、将上述连接后基因片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子并测序鉴定；抽提质粒获得glr和daao双表达载体pET24a-glr-daao；
d、将双表达载体pET24a-glr-daao转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌；
步骤二、D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因工程菌的培养
将上述步骤一所制备的同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌进行培养，培养的过程中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，最后收集菌体，得到同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌，备用；
步骤三、以L-谷氨酸为原料，转化生产α-酮戊二酸
在发酵罐中加入同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌湿菌体至水中，湿菌体的质量为水质量的5%，然后加入L-谷氨酸至终浓度100g/L，再加入过氧化氢酶至浓度为100万单位/升，最后用氢氧化钠调pH至8.2，即制备出转化体系；水浴保持反应体系在40℃，通气搅拌反应，即将反应体系中的L-谷氨酸转化为α-酮戊二酸；利用高效液相色谱检测反应体系中α-酮戊二酸含量为85.2g/L，转化率达到85.5%；
步骤四、α-酮戊二酸的分离纯化
将反应体系中转化出的α-酮戊二酸进行分离纯化即生产出α-酮戊二酸；最后得到产品纯度为98%，纯化收率75%。
本发明所用的大肠杆菌BL21（DE3）菌株为常用菌种，可通过市场购买得到。
本发明提供的酶法生产α-酮戊二酸的方法，所述谷氨酸消旋酶选自，但不限于：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）来源的谷氨酸消旋酶、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）来源的谷氨酸消旋酶、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）来源的谷氨酸消旋酶、大肠杆菌（Escherichia coli）来源的谷氨酸消旋酶、乳酸菌（Lactobacillus）来源的谷氨酸消旋酶、溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）来源的谷氨酸消旋酶、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）来源的谷氨酸消旋酶。
所述D-氨基酸氧化酶选自，但不限于：变异三角酵母(Trigonopsis variabilis) 来源的D-氨基酸氧化酶、轮枝菌（Verticillium luteoalbum）来源的D-氨基酸氧化酶、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)来源的D-氨基酸氧化酶、近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)来源的D-氨基酸氧化酶、红冬孢酵母(Rhodotorula gracilis)来源的D-氨基酸氧化酶或猪肾来源的D-氨基酸氧化酶。
所述过氧化氢酶为宿主大肠杆菌自身的过氧化氢酶或额外添加市售工业级的过氧化氢酶。
SEQUENCE LISTING
<110> 洛阳华荣生物技术有限公司
<120> 一种酶法生产α-酮戊二酸的方法
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggaacaac caataggagt cattgattcc ggggttggcg gtttaaccgt tgcgaaggaa 60
atcatgagac agctacctaa agaaaatatt atctacgtcg gggatacgaa acggtgtcct 120
tatggtccgc gccctgaaga agaggtgctt caatatacgt gggagctgac gaattattta 180
ctcgaaaacc accacatcaa aatgctcgtg atcgcctgta atacagcaac agcgatcgct 240
ttggatgaca tccagcgcag cgtcggcata ccggtggtcg gagtcatcca gcctggtgcg 300
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attaagagca atgcatacga agaagcgctt ttggcattaa accctgattt gaaggttgaa 420
aaccttgcct gcccgctgct tgtgcctttt gtggaaagcg ggaagtttct cgacaaaaca 480
gcagacgaga ttgttaaaac ctcgctgtat ccgttaaaag acacatcaat tgattcgctg 540
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cacgtaaaca ttatttcgtc cggcgatgaa acagcccggg aagtcagcac aattctctct 660
tataaagggc tgctgaacca gtctccgatt gccccggatc atcagttcct gacaacaggg 720
gcgcgtgatc agtttgcaaa aatcgcagac gattggtttg gccatgaagt cgggcatgtg 780
gaatgtatct cactgcaaga accgattaaa agatagggat cc 822
<210> 2
<211> 1076
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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gatatacctc gccttgggca ggtgccaact ggctcacatt ttacgatgga ggcaagttag 180
ccgactacga tgccgtctct tatcctatct tgcgagagct ggctcgaagc agccccgagg 240
ctggaattcg actcatcagc caacgctccc atgttctcaa gcgtgatctt cctaaactgg 300
aagttgccat gtcggccatc tgtcaacgca atccctggtt caaaaacaca gtcgattctt 360
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Claims (5)
1.一种酶法生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于：其生产方法包括以下步骤：
步骤一、同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建
(1)、表达载体pET24a-glr的构建
a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于枯草芽孢杆菌IFO 3336编码谷氨酸消旋酶的glr基因序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI，起始密码子由TTG改为ATG后，进行全基因合成，合成的glr基因具体序列如SEQ ID NO：1；
b、将合成的glr基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；
c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的glr基因片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；
d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得glr表达载体pET24a-glr；
(2)、表达载体pET24a-daao的构建
a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于变异三角酵母CBS4095菌株中编码D-氨基酸氧化酶的基因daao序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI后，进行全基因合成，合成的daao基因具体序列如SEQ ID NO：2；
b、将合成的daao基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；
c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的daao片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；
d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得daao表达载体pET24a-daao；
(3)、同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建
a、将构建好的表达载体pET24a- daao，用BglII和HindIII双酶切，回收包含了T7启动子、核糖体结合位点和daao基因编码序列的片段，纯化备用；
b、构建好的表达载体pET24a-glr，用BamHI和HindIII双酶切，纯化，利用BglII和BamHI同尾酶的特性与上述a中所准备好的基因片段连接，得到连接后基因片段，备用；
c、将上述连接后基因片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子并测序鉴定；抽提质粒获得glr和daao双表达载体pET24a-glr-daao；
d、将双表达载体pET24a-glr-daao转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌；
步骤二、基因工程菌的培养
将上述步骤一所制备的同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌进行培养，培养的过程中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，最后收集菌体，得到同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌，备用；
步骤三、以L-谷氨酸为原料，转化生产α-酮戊二酸
在发酵罐中加入同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌湿菌体至水中，湿菌体的质量为水质量的3-5%，然后加入L-谷氨酸至终浓度90-100g/L，再加入过氧化氢酶至浓度为100万-400万单位/升，最后用氢氧化钠调pH至7.5-8.2，即制备出反应体系；水浴保持反应体系在30-40℃，通气搅拌反应，即将反应体系中的L-谷氨酸转化为α-酮戊二酸；检测反应体系中α-酮戊二酸的含量；
步骤四、α-酮戊二酸的分离纯化
将反应体系中转化出的α-酮戊二酸进行分离纯化即生产出α-酮戊二酸。
2.如权利要求1所述的酶法生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于：所述同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌培养方法为：
(1)、步骤一所述同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌单菌落接种到LB液体培养基中，置于37℃过夜培养，得到基因工程菌种子培养液；
(2)、将所培养的基因工程菌种子培养液分别接种到TB培养基中，接种量为TB培养基体积的2%；然后置于37℃培养5小时左右，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度0.2mmol/L，降温至25℃继续培养20小时左右，培养结束，离心收集同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌。
3.如权利要求1所述的酶法生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于：反应体系中α-酮戊二酸含量利用高效液相色谱进行检测。
4.如权利要求3所述的酶法生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于：α-酮戊二酸的高效液相色谱检测条件为：色谱柱：HILIC色谱柱 4.6*250*5；流动相：PH3.3~3.5的质量浓度为3%磷酸二氢:水=1:3；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；波长：205。
5.如权利要求1所述的酶法生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于：α-酮戊二酸的具体分离纯化方法为：反应结束后，将反应液12000rpm离心10min；取上清液，在上清液中加入其质量0.5%的活性炭，搅拌脱色30分钟，收集滤液进行减压浓缩，加入上清液质量2.5%的晶种，缓慢搅拌冷却至室温结晶4小时以上，抽滤收集晶体；抽滤得到的晶体，40℃真空干燥，得到α-酮戊二酸。
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