CN112852897A

CN112852897A - 一种酶法制备d-谷氨酸的方法

Info

Publication number: CN112852897A
Application number: CN202110290569.6A
Authority: CN
Inventors: 曾帅; 李晚军; 肖雪; 范明
Original assignee: Mianyang Shengshi Health Technology Co ltd
Current assignee: Mianyang Shengshi Health Technology Co ltd
Priority date: 2021-03-18
Filing date: 2021-03-18
Publication date: 2021-05-28

Abstract

本发明公开了一种酶法制备D‑谷氨酸的方法，包括以下步骤：S1、以L‑谷氨酸钠为底物，加入谷氨酸消旋酶使其反应生成DL‑谷氨酸钠；S2、加入L‑谷氨酸脱羧酶，使DL‑谷氨酸钠分解成γ‑氨基丁酸和D‑谷氨酸，控制pH值为2‑4，析出D‑谷氨酸晶体。本发明利用谷氨酸消旋酶，L‑谷氨酸脱羧酶，以L‑谷氨酸钠为底物，制备D‑谷氨酸，基于简单的方法，即可制备D‑谷氨酸，具有环境污染小，生物安全性好，设备简单的优点，有利于工业化大生产D‑谷氨酸及其衍生物。

Description

一种酶法制备D-谷氨酸的方法

技术领域

本发明涉及酶催化技术领域，具体涉及一种酶法制备D-谷氨酸的方法。

背景技术

D-谷氨酸是一种重要的手性化合物，是细菌细胞壁肽聚糖的重要组成部分，在不同的动物、植物、微生物中也担任着重要的生理角色，是许多药物、生物活性物质以及聚合体的重要前体和中间体,同时也可作为食品添加剂，被广泛应用于生产半合成抗体、激素、生物活性多肽和化学杀虫剂。D-谷氨酸的结构式如下：

目前D-谷氨酸的制备方法主要有化学法和化学法-酶法和酶法等。

例如，翟立海等(应有化工，2006，35(4)：313-315)利用L-谷氨酸和甲醇在催化剂氯化氢下反应生成L-谷氨酸-γ-甲酯，在加入D-酒石酸和水杨醛，得到D-谷氨酸酯-D-酒石酸盐，在酸性水溶液中水解，经分离纯化得到D-谷氨酸。这些方法虽然操作简单，但反应条件苛刻，易生成副产物，同时大量有机溶剂的使用还会造成环境污染。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酶法制备D-谷氨酸的方法，解决现有制备D-谷氨酸的方法反应条件苛刻、易生成副产物，且污染环境的问题。

本发明通过下述技术方案实现：

一种酶法制备D-谷氨酸的方法，包括以下步骤：

S1、以L-谷氨酸钠为底物，加入谷氨酸消旋酶使其反应生成DL-谷氨酸钠；

S2、加入L-谷氨酸脱羧酶，使DL-谷氨酸钠分解成γ-氨基丁酸和D-谷氨酸，控制pH值为2-4，析出D-谷氨酸晶体。

本发明的具体合成路线如下：

本发明所述γ-氨基丁酸和D-谷氨酸在水中的溶解度不同，利用两者在水中溶解度不同的差异，在pH 2-4析出D-谷氨酸晶体。

本发明为纯酶法制备D-谷氨酸，不但具有反应条件温和，酶的专一性强，不易产生副产物，生产的产物手性纯度高等优点，而且还采用廉价易得的L-谷氨酸钠为原料，以可大量制得的克隆表达蛋白为催化剂进行转化，以等电点结晶的方式进行产品的分离，这些优点导致生产过程中成本较低，有利于大批量的工业制备。

通过本发明所述方法制得的D-谷氨酸，产物的含量能达到99.5％以上，光学纯度>99.5％。

进一步地，谷氨酸消旋酶、L-谷氨酸脱羧酶和L-谷氨酸钠的用量比为：5-10：20-50：100-400。

进一步地，步骤S1中，控制pH值为6-9，步骤S2中，脱羧时控制pH值为5-8。

进一步地，步骤S1中，控制pH值为7-8，步骤S2中，脱羧时控制pH值为5-7。

进一步地，整个制备过程，反应温度为20-40℃，反应时间24-48h。

进一步地，整个制备过程，反应温度为30-40℃。

进一步地，通过消旋反应制备成DL-谷氨酸钠后，通过膜分离设备去除谷氨酸消旋酶，再进行步骤S2。

进一步地，谷氨酸消旋酶和L-谷氨酸脱羧酶均是经过发酵、离心收集的湿菌体。

进一步地，谷氨酸消旋酶酶活力为3000-5000U/g，所述L-谷氨酸脱羧酶酶活力为500-1000U/g。

进一步地，将获得的湿菌体经细胞破碎得到粗酶液进行使用。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明首次提出了纯酶法制备D-谷氨酸，为D-谷氨酸的合成提供了新方法。

2、通过本发明所述方法制得的D-谷氨酸，产物的含量能达到99.5％以上，光学纯度>99％。

3、本发明所述方法原料廉价易得、不使用有机溶剂，反应条件温和、不易产生副产物，产品易分离，纯度高，且具有成本低的优点。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为实施例1的光学纯度图谱；

图2为实施例2的光学纯度图谱；

图3为实施例3的光学纯度图谱；

图4为实施例4的光学纯度图谱；

图5为实施例5的光学纯度图谱；

图6为实施例6的光学纯度图谱；

图7为实施例7的光学纯度图谱；

图8为对比例1的光学纯度图谱。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1：

一种酶法制备D-谷氨酸的方法：

在5ml反应瓶中加入1g L-谷氨酸钠，用1mol/L氢氧化钠将溶液pH值调至7.5，再加入30mg谷氨酸消旋酶湿菌体，在37℃下反应7h，升温至80℃，离心去除菌体，用1mol/L硫酸溶液将pH值调至5，加入0.13mg PLP，1mg六水氯化镁，再加入150mg L-谷氨酸脱羧酶湿菌体，在磁力搅拌反应10小时后，升温至80℃，离心去除菌体，用1mol/L硫酸溶液将pH值调至3，析出D-谷氨酸晶体，抽滤，冰水洗涤，烘干，送样检测含量及光学纯度，含量＝99.9％，光学纯度＝99.91％；D-谷氨酸收率为33％，本实施例的光学纯度图谱如图1所示。

实施例2：

一种酶法制备D-谷氨酸的方法：

在50ml反应瓶中加入15g L-谷氨酸钠，用2mol/L氢氧化钠将溶液pH值调至8，再加入250mg谷氨酸消旋酶湿菌体，在37℃下反应7h，升温至80℃，保温10min，离心去除菌体，用2mol/L硫酸溶液将pH值调至5，加入1.3mg PLP，10mg六水氯化镁，再加入2g L-谷氨酸脱羧酶湿菌体，在37℃下反应10小时后，升温至80℃，保温10min，离心去除菌体，用2mol/L硫酸溶液将pH值调至3，析出D-谷氨酸晶体，抽滤，冰水洗涤，烘干，送样检测含量及光学纯度，含量＝99.8％，光学纯度＝99.83％；D-谷氨酸收率为34％，本实施例的光学纯度图谱如图2所示。

实施例3：

一种酶法制备D-谷氨酸的方法：

在500ml反应瓶中加入150g L-谷氨酸钠，用4mol/L氢氧化钠将溶液pH值调至8，再加入3g谷氨酸消旋酶湿菌体，在37℃下反应10h，升温至80℃，保温10min，离心去除菌体，用4mol/L硫酸溶液将pH值调至5.5，加入20mg PLP，150mg六水氯化镁，再加入25g L-谷氨酸脱羧酶湿菌体，在37℃下反应10小时后，升温至80℃，保温10min，离心去除菌体，用4mol/L硫酸溶液将pH值调至3.3，析出D-谷氨酸晶体，抽滤，冰水洗涤，烘干，送样检测含量及光学纯度，含量＝99.9％，光学纯度＝99.93％；D-谷氨酸收率为36％，本实施例的光学纯度图谱如图3所示。

实施例4：

一种酶法制备D-谷氨酸的方法：在500ml反应瓶中加入190g L-谷氨酸钠，用4mol/L氢氧化钠将溶液pH值调至8，再加入4g谷氨酸消旋酶湿菌体，在37℃下反应10h，升温至80℃，保温30min，离心去除菌体，用4mol/L硫酸溶液将pH值调至5.5，加入20mg PLP，150mg六水氯化镁，再加入20g L-谷氨酸脱羧酶湿菌体，在37℃下反应10小时后，升温至80℃，保温30min，离心去除菌体，用4mol/L硫酸溶液将pH值调至3.3，析出D-谷氨酸晶体，抽滤，冰水洗涤，烘干，送样检测含量及光学纯度，含量＝99.9％，光学纯度＝99.9％；D-谷氨酸收率35％，本实施例的光学纯度图谱如图4所示。

实施例5：

一种酶法制备D-谷氨酸的方法：

在1L反应瓶中加入380g L-谷氨酸钠，用4mol/L氢氧化钠将溶液pH值调至8，再加入8g谷氨酸消旋酶湿菌体，在37℃下反应12h，升温至80℃，保温30min，离心去除菌体，用4mol/L硫酸溶液将pH值调至5.5，加入40mg PLP，300mg六水氯化镁，再加入20g L-谷氨酸脱羧酶湿菌体，在37℃下反应13小时后，升温至80℃，保温30min，离心去除菌体，浓缩至D-谷氨酸含量在200-300g/L，用4mol/L硫酸溶液将pH值调至3.3，析出D-谷氨酸晶体，抽滤，冰水洗涤，烘干，送样检测含量及光学纯度，含量＝99.9％，光学纯度＝99.8％；D-谷氨酸收率37％，本实施例的光学纯度图谱如图5所示。

实施例6：

一种酶法制备D-谷氨酸的方法：

在1L反应瓶中加入400g L-谷氨酸钠，用4mol/L氢氧化钠将溶液pH值调至8，再加入8g谷氨酸消旋酶湿菌体，在40℃下反应12h，升温至80℃，保温30min，离心去除菌体，用4mol/L硫酸溶液将pH值调至5.5，加入30mg PLP，250mg六水氯化镁，再加入20g L-谷氨酸脱羧酶湿菌体，在37℃下反应13小时后，升温至80℃，保温30min，离心去除菌体，浓缩至D-谷氨酸含量在200-300g/L，用4mol/L硫酸溶液将pH值调至3.3，析出D-谷氨酸晶体，抽滤，冰水洗涤，烘干，送样检测含量及光学纯度，含量＝100％，光学纯度＝99.89％；D-谷氨酸收率39％，本实施例的光学纯度图谱如图6所示。

实施例7：

一种酶法制备D-谷氨酸的方法：

在5L反应器中加入2Kg L-谷氨酸钠，用6mol/L氢氧化钠将溶液pH值调至8，再加入35g谷氨酸消旋酶湿菌体，在40℃下反应12h，升温至80℃，保温1h，离心去除菌体，用4mol/L硫酸溶液将pH值调至5.5，加入130mg PLP，1g六水氯化镁，再加入100g L-谷氨酸脱羧酶湿菌体，在37℃下反应15小时后，升温至80℃，保温30min，离心去除菌体，浓缩至D-谷氨酸含量在200-250g/L，用6mol/L硫酸溶液将pH值调至3.22，析出D-谷氨酸晶体，抽滤，冰水洗涤，烘干，送样检测含量及光学纯度，含量＝99.9％，光学纯度＝99.98％；D-谷氨酸收率40％，本实施例的光学纯度图谱如图7所示。

对比例1：

一种酶法制备D-谷氨酸的方法：

在1L反应瓶中加入400g L-谷氨酸钠，用4mol/L氢氧化钠将溶液pH值调至8，再加入5g谷氨酸消旋酶湿菌体，在40℃下反应12h，升温至80℃，保温30min，离心去除菌体，用4mol/L硫酸溶液将pH值调至5.5，加入30mg PLP，250mg六水氯化镁，再加入10g L-谷氨酸脱羧酶湿菌体，在37℃下反应13小时后，升温至80℃，保温30min，离心去除菌体，浓缩至D-谷氨酸含量在200-300g/L，用4mol/L硫酸溶液将pH值调至3.3，析出D-谷氨酸晶体，抽滤，冰水洗涤，烘干，送样检测含量及光学纯度，含量＝99.6％，光学纯度＝72.93％；说明在S2中反应所需L-谷氨酸脱羧酶酶量不足，导致L-谷氨酸未全部反应完全，本实施例的光学纯度图谱如图8所示。

由对比例1可以看出：

改变L-谷氨酸脱羧酶用量，导致DL-谷氨酸中L-谷氨酸反应不完全，最后得到的产品光学纯度不高，里面含L-谷氨酸杂质。

谷氨酸含量检测方法：取本品约0.25g，精密称定，加沸水50mL使溶解，放冷，加溴麝香草酚蓝指示液5滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液由黄色变为蓝绿色，每1mL氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于14.71mg的谷氨酸。

D-谷氨酸光学纯度检测方法如表1所示：

表1

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种酶法制备D-谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种酶法制备D-谷氨酸的方法，其特征在于，所述谷氨酸消旋酶、L-谷氨酸脱羧酶和L-谷氨酸钠的用量比为：5-10：20-50：100-400。

3.根据权利要求1所述的一种酶法制备D-谷氨酸的方法，其特征在于，步骤S1中，控制pH值为6-9，步骤S2中，脱羧时控制pH值为5-8。

4.根据权利要求3所述的一种酶法制备D-谷氨酸的方法，其特征在于，步骤S1中，控制pH值为7-8，步骤S2中，脱羧时控制pH值为5-7。

5.根据权利要求1所述的一种酶法制备D-谷氨酸的方法，其特征在于，整个制备过程，反应温度为20-40℃，反应时间24-48h。

6.根据权利要求5所述的一种酶法制备D-谷氨酸的方法，其特征在于，整个制备过程，反应温度为30-40℃。

7.根据权利要求1所述的一种酶法制备D-谷氨酸的方法，其特征在于，通过消旋反应制备成DL-谷氨酸钠后，通过膜分离设备去除谷氨酸消旋酶，再进行步骤S2。

8.根据权利要求1所述的一种酶法制备D-谷氨酸的方法，其特征在于，所述谷氨酸消旋酶和L-谷氨酸脱羧酶均是经过发酵、离心收集的湿菌体。

9.根据权利要求8所述的一种酶法制备D-谷氨酸的方法，其特征在于，所述谷氨酸消旋酶酶活力为3000-5000U/g，所述L-谷氨酸脱羧酶酶活力为500-1000U/g。

10.根据权利要求8所述的一种酶法制备D-谷氨酸的方法，其特征在于，将获得的湿菌体经细胞破碎得到粗酶液进行使用。