CN117467715A - 多步酶法同时制备d-谷氨酸及l-谷胱甘肽的工艺 - Google Patents

多步酶法同时制备d-谷氨酸及l-谷胱甘肽的工艺 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及多步酶法同时制备D‑谷氨酸及L‑谷胱甘肽的工艺。本发明以廉价的L‑谷氨酸为原料，通过L‑谷氨酸异构酶制备D/L‑谷氨酸，然后利用谷胱甘肽连接酶一方面拆分D‑谷氨酸的同时生产商业化的谷胱甘肽产品，由于两个产品化学性质差异比较大，因此能比较容易地分离。该制备方案比较简洁，容易工业化，两个产品很好的分摊了生产成本，因此具有很高的竞争优势。

Description

多步酶法同时制备D-谷氨酸及L-谷胱甘肽的工艺
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及多步酶法同时制备D-谷氨酸及L-谷胱甘肽的工艺。
背景技术
D-谷氨酸是革兰氏阴性菌如大肠埃希菌和铜绿假单胞菌细胞壁中的肽聚糖的重要组成部分，体内试验表明在皮肤屏障功能受损时，D-谷氨酸能抑制Ca2+向KC细胞内流入并促进细胞间脂质的生成，加快屏障功能恢复；与此同时，D-谷氨酸还能恢复屏障，减少皱纹和皮肤粗糙的形成，D-谷氨酸具有维持皮肤稳态的生理功能，可以应用于皮肤健康与美容。此外，D-谷氨酸是一种重要的手性化合物，是细菌细胞壁肽聚糖的重要组成部分；同时，D-谷氨酸是许多药物、生物活性物质以及聚合体的重要前体和手性中间体，可与多种金属形成配合物，在超分子化学中也得到了广泛应用。D-谷氨酸在新药研究、有机合成、多肽合成以及脂类衍生物新材料合成等领域的应用逐渐受到关注，其被广泛用于生产半合成抗体、激素、生物活性多肽和化学杀虫剂。L-谷胱甘肽则能帮助保持正常的免疫系统功能，并具有抗氧化作用、整合解毒作用，同时它还可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。因此，开发廉价生产D-谷氨酸以及L-谷胱甘肽的规模化生产工艺具有重要的应用价值。
现有的D-组氨酸制备方法：
市面上D-谷氨酸的制备方法有化学法，譬如利用L-谷氨酸作为原料，经酯化、消旋、拆分、水解等步骤最终得到D-谷氨酸；也有一种化学-酶法先利用保加利亚乳杆菌制备L-谷氨酸脱羧酶(GAD)，然后利用化学法消旋L-谷氨酸成D/L-谷氨酸，最后利用GAD将L-谷氨酸分解；还有一种酶法制备D-谷氨酸的方法，先利用L-谷氨酸消旋酶将L-谷氨酸转化成D/L-谷氨酸，然后利用L-谷氨酸脱羧酶将D/L-谷氨酸转化成gama-氨基丁酸和D-谷氨酸，最后进行分离。
如上所述，当今报道的D-谷氨酸制备还是基于传统的化学拆分法，该方法路线长，收率低；或利用D/L脯氨酸为原料，利用工程菌或L-谷氨酸脱羧酶转化L-谷氨酸，然而该方法收率偏低从而导致价格偏贵。
发明内容
有鉴于此，本发明提供的多步酶法同时制备D-谷氨酸及L-谷胱甘肽的工艺，利用廉价原料一次性制备D-谷氨酸及L-谷胱甘肽。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了组合物，包括L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酸异构酶和谷胱甘肽连接酶。
在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物还包括三磷酸腺苷。
在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物还包括多聚磷酸激酶和多聚磷酸盐；
所述多聚磷酸盐包括偏六磷酸盐；
所述L-谷氨酸异构酶为来源于幽门杆菌的L-谷氨酸异构酶；
所述谷胱甘肽连接酶为来源于口腔链球菌的谷胱甘肽连接酶；
所述多聚磷酸激酶为来源于土壤杆菌的多聚磷酸激酶。
在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物中：
所述L-谷氨酸异构酶具有：
(1)、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或
(2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或
(3)、与如(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；
所述谷胱甘肽连接酶具有：
(4)、如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或
(5)、如(4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或
(6)、与如(4)或(5)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；
所述多聚磷酸激酶具有：
(7)、如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或
(8)、如(7)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(7)的相同或相似；或
(9)、与如(7)或(8)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；
所述多个为2个至10个。
本发明还提供了上述组合物在制备D-谷氨酸和/或L-谷胱甘肽中的应用。
本发明还提供了D-谷氨酸和/或L-谷胱甘肽中的制备方法，基于上述组合物制备。
在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法包括：取L-谷氨酸与L-谷氨酸异构酶混合，获得D/L-谷氨酸，再取L-半胱氨酸、L-甘氨酸、谷胱甘肽连接酶与所述D/L-谷氨酸混合，获得D-谷氨酸和/或L-谷胱甘肽。
在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法中：
所述L-谷氨酸和L-谷氨酸异构酶的量的关系为：每200mM的L-谷氨酸与2000U的L-谷氨酸异构酶混合；
所述D/L-谷氨酸、所述L-半胱氨酸和所述L-甘氨酸的摩尔比为212:110:105；
所述D/L-谷氨酸和所述谷胱甘肽连接酶的量的关系为：每212mM的L-谷氨酸与2000～3000U的L-谷氨酸异构酶混合。
在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法包括如下步骤：
步骤(1)：取L-谷氨酸、可接受的辅料和缓冲液混合，调节pH至8.0，再与L-谷氨酸异构酶混合，反应，调节pH至2.0，去除沉淀，调节pH至7.0，除杂，获得D/L-谷氨酸；
步骤(2)：取缓冲液、L-半胱氨酸、L-甘氨酸、可接受的辅料和步骤(2)所述的D/L-谷氨酸混合，调节pH至8.0，再与谷胱甘肽连接酶、可接受的辅料混合，反应，调节pH至2.0，去除沉淀，调节pH至7.0，除杂，获得D-谷氨酸和/或L-谷胱甘肽。
在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法中：
所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液；和/或
步骤(1)所述的辅料包括磷酸吡哆醛；和/或
步骤(2)所述的辅料包括三磷酸腺苷单钠盐、偏六磷酸钠、EnzMix和/或多聚磷酸激酶。
在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法中：
步骤(1)中所述L-谷氨酸和所述L-谷氨酸异构酶的量的关系为：每200mM的L-谷氨酸与2000U的L-谷氨酸异构酶反应；和/或
步骤(1)中所述磷酸吡哆醛和所述L-谷氨酸异构酶的量的关系为：每0.5mM的磷酸吡哆醛与2000U的L-谷氨酸异构酶反应；和/或
步骤(1)所述缓冲液的浓度为100mM；和/或
步骤(1)所述反应的温度为30℃；和/或
步骤(1)所述反应的pH值为pH 7.5～8.5；和/或
步骤(1)所述反应的时间为3小时；和/或
步骤(2)中所述D/L-谷氨酸、所述L-半胱氨酸和所述L-甘氨酸的摩尔比为212:110:105；和/或
步骤(2)中所述D/L-谷氨酸和所述谷胱甘肽连接酶的量的关系为：每212mM的L-谷氨酸与2000～3000U的谷胱甘肽连接酶反应；和/或
步骤(2)中所述三磷酸腺苷单钠盐、所述偏六磷酸钠和所述多聚磷酸激酶的量的关系为：每220mM的三磷酸腺苷单钠盐、70mM的偏六磷酸钠与2000～3000U的多聚磷酸激酶反应；和/或
步骤(2)中所述L-谷氨酸异构酶与所述多聚磷酸激酶的酶活力单位的比例为2000U:4000U；和/或
步骤(2)所述缓冲液的浓度为100mM；和/或
步骤(2)所述反应的温度为30℃；和/或
步骤(2)所述反应的pH值为pH 7.0～9.0；和/或
步骤(2)所述反应的时间为3小时。
本发明的多步酶法同时制备D-谷氨酸及L-谷胱甘肽的工艺有如下效果：
本发明以廉价的L-谷氨酸为原料，通过L-谷氨酸异构酶制备D/L-谷氨酸，然后利用谷胱甘肽连接酶一方面拆分D-谷氨酸的同时生产商业化的谷胱甘肽产品，由于两个产品化学性质差异比较大，因此能比较容易地分离。该制备方案比较简洁，容易工业化，两个产品很好的分摊了整个生产成本，因此具有很高的竞争优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例2反应3小时的反应液HPLC检测；
图2示谷胱甘肽HPLC测试图谱；
图3示谷胱甘肽质谱测试图谱；
图4示D-谷氨酸分离纯化后HPLC测试图谱；
图5示实施例中使用的酶的SDS-PAGE胶图。
具体实施方式
本发明公开了多步酶法同时制备D-谷氨酸及L-谷胱甘肽的工艺，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明结合利用L-谷氨酸异构酶以及特定的L-氨基酸连接酶能有效完全转化D-谷氨酸以及谷胱甘肽两个产品的生产，从而进一步降低其生产价格，因此该方案具有很强的市场竞争力。
本发明利用多酶两阶段完成，一是利用L-谷氨酸异构酶将L-谷氨酸原料转化成D/L-谷氨酸；然后利用L-氨基酸连接酶将L-谷氨酸转化成谷胱甘肽而保留D-谷氨酸。后一步转化可以利用PPKC1酶对ATP进行循环再生。
本发明D-谷氨酸酶制备路线：
本发明以廉价大宗品L-谷氨酸、L-半胱氨酸以及L-甘氨酸作为起始原料，先利用L-谷氨酸异构酶得相应的消旋体D/L-谷氨酸。再以D/L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-甘氨酸为原料，利用谷胱甘肽合成酶GSHSyn将三个L-型氨基酸连接成三肽谷胱氨酸(GSH)，同时保留未反应的D-谷氨酸可以通过后续简单的分离纯化获得。本发明路线简洁，反应体系中的ATP采用PPKC1酶循环再生则可以进一步节省成本；整个制备过程不仅可以定量得到所需的D-谷氨酸，同时还得到等当量的谷胱甘肽，该三肽具有抗氧化、解毒等作用。
本发明所用酶相关信息如下：
L-谷氨酸异构酶(GluRac)：来源于幽门杆菌(Helicobacter pylori，Uniprot ID：Q9ZLT0)；
谷胱甘肽连接酶(GSHSyn)：来源于口腔链球菌(Streptococcus oralis，UniprotID：A0A139RNY3)；
多聚磷酸激酶(PPKC1)：来源于土壤杆菌(Agrobacterium vitis，Uniprot ID：A0A109CMM8)。
表1
表2
本发明涉及的酶的发酵生产：
本发明所需的酶都是通过公司合成相应基因后构建在特定的表达质粒上再通过大肠杆菌发酵生产制得；其具体包含以下步骤：将以上酶所对应的基因进行序列优化后再下单到通用生物公司合成(安徽滁州)，再引进NdeI/XhoI酶切位点并亚克隆到pET 28a表达载体上。确认序列正确的质粒转入E.coli(BL21)感受态细胞进行平板培养(擎科生物)以及单克隆小量液体培养，蛋白表达正确的菌最终进行逐级放大液体培养。其具体包含单菌落转入5ml含50μM卡那霉素的LB培养液中(37℃)进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250ml含同样抗菌素的LB培养液中，同样生长到对数期时转入5L培养发酵罐里进行培养并进行最终的蛋白表达。在5L发酵罐培养中，当细胞OD～20时加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)25℃诱导蛋白表达6小时，最后高速离心收集细胞(4000rpm，20min)获得酶过量表达湿细胞30～40g。取少量细胞先与三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)缓冲液(50mM，pH 8.0)在冰盆上混合均匀，然后利用冻融法破碎细胞、高速离心除细胞壁后清液跑SDS-PAGE凝胶电泳(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定蛋白表达。蛋白表达正确的菌体细胞用以进行下一步催化实验，具体来说，将剩余细胞与Tris.HCl缓冲液(50mM，pH8.0)在低温混合均匀(以～10克湿细胞：200ml缓冲液混合)，然后进行低温高压破碎细胞壁，高速离心(16000rpm，45min)除细胞壁后获得含酶清液备用(得到的酶活力在1000～1500U/ml，U是室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量)。LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。
本发明涉及的酶的混合固定化：
往上述收集的粗酶清液中缓慢加入硫酸铵固体至蛋白固体析出(30％～60％w/v硫酸铵:缓冲液)，该蛋白固体通过高速离心(10000rpm，10分钟)收集后缓慢溶解到25mM pH8.0的Tris缓冲液中(缓冲液A)，然后在50倍体积的缓冲液A中透析(两次，每次间隔4小时)除去酶溶液里的含硫酸铵，最后透析液上样DEAE Seplite FF(西安蓝晓公司)阴离子交换柱(NaCl在缓冲液梯度洗脱：0～1N NaCl)得到初纯化的GSHSyn、PPKC1酶液；以上酶利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)按活性单位1:2以下面的方法一次性混合固定：10,000U纯化混合酶溶解在10L 50mM pH 8.0的磷酸钾(缓冲液B)溶液中，随后加入30～50mM苯氧乙酸以及5公斤LX-1000EP环氧树脂，25℃搅拌12小时后过滤出固定化酶，最后用清水及缓冲液B各洗两次后低温保存待用，固定化酶初始活力具有87％～94％的液体酶活力。
D-谷氨酸制备所涉及酶活力数据如表3所示：
表3
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：以L-谷氨酸为原料，GluRac异构酶制备谷氨酸消旋体(D/L-谷氨酸)
在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入29.4克L-谷氨酸(200mM)，120毫克磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate，PLP，0.5mM)；然后将反应液pH调回8.0。接着加入2000U GluRac酶启动反应，维持反应体系在30℃，pH 7.5～8.5搅拌3个小时反应达到平衡。将反应液pH调到2.0沉淀蛋白并离心除去，待溶液pH调回7.0后直接上样D201阴离子交换树脂除盐与PLP，最后粗产品利用反渗透膜浓缩备用(D-谷氨酸转化率53％)。
实施例2：用D/L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-甘氨酸为原料，连接酶GSHSyn制备谷胱甘肽与D-谷氨酸
用实施例1制备的D/L-谷氨酸作为原料，在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入31.2克D/L-谷氨酸(212mM)，13.3克L-半胱氨酸(110mM)、7.9克L-甘氨酸(105mM)以及117克三磷酸腺苷单钠盐(ATP，220mM)，然后调节反应液体系pH至8.0，最后加入连接酶GSHSyn3000U；在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，3小时后通过HPLC检测到原料基本反应完全。反应液相图谱见图1。然后调节溶液pH到2.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去，然后将反应溶液pH调至7.0后直接上样D201阴离子交换树脂除去二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐，然后利用200Da滤膜分离D-谷氨酸和谷胱甘肽，最后对两个产品分别浓缩、结晶(乙醇与水的混合溶剂里结晶)分别得到白色D-谷氨酸固体12.6克(收率81％)，谷胱甘肽23.6克(收率77％)。将纯品谷胱甘肽送样质谱和液相测试确认，结果见图2、3。同理，将D-谷氨酸固体送样液相测试确认，结果见图4。
实施例3：用D/L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-甘氨酸为原料，连接酶GSHSyn制备谷胱甘肽与D-谷氨酸(采用ATP再生系统)
与上述实施例2类似，在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入31.2克D/L-谷氨酸(212mM)，13.3克L-半胱氨酸(110mM)，7.9克L-甘氨酸(105mM)以及2.5克三磷酸腺苷单钠盐(ATP，5mM)，42.5克偏六磷酸钠(Pi6，70mM)，然后调节反应液体系pH至8.0，最后加入连接酶GSHSyn 2000U，PPKC1 4000U；在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，3小时后通过HPLC检测到原料基本反应完全。然后调节溶液pH到2.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去，然后将反应溶液pH调至7.0后直接上样D201阴离子交换树脂除去二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐，然后利用200Da滤膜分离D-谷氨酸和谷胱甘肽，最后对两个产品分别浓缩、结晶(乙醇与水的混合溶剂里结晶)分别得到白色D-谷氨酸固体14.2克(收率86％)，谷胱甘肽25.4克(收率83％)。
实施例4：用D/L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-甘氨酸为原料，连接酶GSHSyn制备谷胱甘肽与D-谷氨酸(采用固定化酶策略)
与上述实施例3类似，在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入31.2克D/L-谷氨酸(212mM)，13.3克L-半胱氨酸(110mM)，7.9克L-甘氨酸(105mM)以及2.5克三磷酸腺苷单钠盐(ATP，5mM)，42.5克偏六磷酸钠(Pi6，70mM)，然后调节反应液体系pH至8.0，最后加入固定化EnzMix 5000U；在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，6小时后通过HPLC检测到原料基本反应完全。然后过滤回收固定化酶，然后将反应溶液pH调至7.0后直接上样D201阴离子交换树脂除去二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐，然后利用200Da滤膜分离D-谷氨酸和谷胱甘肽，最后对两个产品分别浓缩、结晶(乙醇与水的混合溶剂里结晶)分别得到白色D-谷氨酸固体9.2克(收率79％)，谷胱甘肽24.8克(收率81％)。固定化EnzMix使用6次收活力保持原始活力的85％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.组合物，其特征在于，包括L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酸异构酶和谷胱甘肽连接酶。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包括三磷酸腺苷。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，还包括多聚磷酸激酶和多聚磷酸盐；
所述多聚磷酸盐包括偏六磷酸盐；
所述L-谷氨酸异构酶为来源于幽门杆菌的L-谷氨酸异构酶；
所述谷胱甘肽连接酶为来源于口腔链球菌的谷胱甘肽连接酶；
所述多聚磷酸激酶为来源于土壤杆菌的多聚磷酸激酶。
4.如权利要求1至3任一项所述的组合物在制备D-谷氨酸和/或L-谷胱甘肽中的应用。
5.D-谷氨酸和/或L-谷胱甘肽中的制备方法，其特征在于，基于如权利要求1至3任一项所述的组合物制备。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括：取L-谷氨酸与L-谷氨酸异构酶混合，获得D/L-谷氨酸，再取L-半胱氨酸、L-甘氨酸、谷胱甘肽连接酶与所述D/L-谷氨酸混合，获得D-谷氨酸和/或L-谷胱甘肽。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括：
所述L-谷氨酸和L-谷氨酸异构酶的量的关系为：每200mM的L-谷氨酸与2000U的L-谷氨酸异构酶混合；
所述D/L-谷氨酸、所述L-半胱氨酸和所述L-甘氨酸的摩尔比为212:110:105；
所述D/L-谷氨酸和所述谷胱甘肽连接酶的量的关系为：每212mM的L-谷氨酸与2000～3000U的L-谷氨酸异构酶混合。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)：取L-谷氨酸、可接受的辅料和缓冲液混合，调节pH至8.0，再与L-谷氨酸异构酶混合，反应，调节pH至2.0，去除沉淀，调节pH至7.0，除杂，获得D/L-谷氨酸；
步骤(2)：取缓冲液、L-半胱氨酸、L-甘氨酸、可接受的辅料和步骤(2)所述的D/L-谷氨酸混合，调节pH至8.0，再与谷胱甘肽连接酶、可接受的辅料混合，反应，调节pH至2.0，去除沉淀，调节pH至7.0，除杂，获得D-谷氨酸和/或L-谷胱甘肽。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，包括：
所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液；和/或
步骤(1)所述的辅料包括磷酸吡哆醛；和/或
步骤(2)所述的辅料包括三磷酸腺苷单钠盐、偏六磷酸钠、EnzMix和/或多聚磷酸激酶。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，包括：
步骤(1)中所述L-谷氨酸和所述L-谷氨酸异构酶的量的关系为：每200mM的L-谷氨酸与2000U的L-谷氨酸异构酶反应；和/或
步骤(1)中所述磷酸吡哆醛和所述L-谷氨酸异构酶的量的关系为：每0.5mM的磷酸吡哆醛与2000U的L-谷氨酸异构酶反应；和/或
步骤(1)所述缓冲液的浓度为100mM；和/或
步骤(1)所述反应的温度为30℃；和/或
步骤(1)所述反应的pH值为pH 7.5～8.5；和/或
步骤(1)所述反应的时间为3小时；和/或
步骤(2)中所述D/L-谷氨酸、所述L-半胱氨酸和所述L-甘氨酸的摩尔比为212:110:105；和/或
步骤(2)中所述D/L-谷氨酸和所述谷胱甘肽连接酶的量的关系为：每212mM的L-谷氨酸与2000～3000U的谷胱甘肽连接酶反应；和/或
步骤(2)中所述三磷酸腺苷单钠盐、所述偏六磷酸钠和所述多聚磷酸激酶的量的关系为：每220mM的三磷酸腺苷单钠盐、70mM的偏六磷酸钠与2000～3000U的多聚磷酸激酶反应；和/或
步骤(2)中所述L-谷氨酸异构酶与所述多聚磷酸激酶的酶活力单位的比例为2000U:4000U；和/或
步骤(2)所述缓冲液的浓度为100mM；和/或
步骤(2)所述反应的温度为30℃；和/或
步骤(2)所述反应的pH值为pH 7.0～9.0；和/或
步骤(2)所述反应的时间为3小时。
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