CN1052508C - 制备新氨基转移酶的方法 - Google Patents

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Abstract

新的氨基转移酶，它的生长和它的应用，可以从大肠杆菌DH－1分离出一种氨基转移酶。在该酶的作用下，可以以很好的效果将谷氨酸的氨基转移，从相应的原料生产L－PPT和Y－氨基丁酸。

Description

制备新氨基转移酶的方法
L-2-氨基-4-甲基膦基丁酸(下面用L-Phosphinothricin或L-PPT表示)或它的盐是化学上容易得到的消旋体的有效成分，正如DE-OS 2939269已公开的。按照DE-OS 2717440，后者对于多种单子叶和双子叶、一年生和多年生的杂草具有很好而且广泛的除草剂效果。因为L-PPT和它的上述衍生物与消旋化合物相比功效强大约2倍，早就希望有一个方法能以简单的方式、较大量地得到L-PPT。
已知L-PPT可以通过微生物的生物转化进行生产(EP0248357)，在该专利申请中还提及，大肠杆菌DH-1具有氨基转移酶，该酶可以把相应的前物质转化成L-叔-、L-亮氨酸和L-PPT。
现已发现，大肠杆菌DH-1合成一种特殊的氨基转移酶，它对于生产L-PPT具有意外的特异性。
本发明涉及：
1.一种来自大肠杆菌DH-1的氨基转移酶，它具有：
——20,000至250,000道尔顿的分子量
——PH3.0至8.0的等电点
——PH最佳范围为5.0至10.0
——对于L-PPT，γ-氨基丁酸和谷氨酸作为氨基供体以及相应的酮化合物作为受体的底物的特异性。
2.特征如1的氨基转移酶的一种生产方法，其特征在于培养大肠杆菌DH-1并分离所说的氨基转移酶。
3.具有如特性1的氨基转移酶用作将(3-羧基-3-氧代丙基)-甲基-次膦酸转变为L-Phosphinothricin和将琥珀酸半醛转化成γ-氨基丁酸的应用。
下面将详细地说明本发明，特别是本发明的最佳实施例，此外由权利要求限定发明。
氨基转移酶是从大肠杆菌DH-1或它的突变体或变种分离的，为此，在该微生物生长的最佳营养介质中培养该微生物。微生物的培养例如在振荡烧瓶或发酵器中在需氧、振荡或搅拌下进行，需要时导入空气或氧，发酵可以在约20℃至40℃的温度下进行，25℃至37℃较好，最好在30℃至37℃。培养胨的PH范围为5至8.5之间，最好在5.5至8.0之间。在该条件下，一般在1至3天后可以看到所提及的酶的积累，氨基转移酶的合成在对数期的中间开始，在对数期的结束达到它的最高值。酶的产生可以通过HPLC分析或光度法测定活性而进行跟踪。
生产该氨基转移酶所使用的营养液含有0.2至5％、最好是0.5至2％的有机氮化合物以及无机盐，作为有机氮化合物，可考虑氨基酸、胨、此外肉提取物，碾碎的种子，例如玉米、小麦、豆类、大豆或棉的种子、酒精生产的蒸馏残渣、肉粉或酵母提取物。营养液中可以含有无机盐，例如碱或碱土金属、铁、锌或镁的氯化物、碳酸盐、硫酸盐或磷酸盐，还有铵盐和硝酸盐。
该酶可以通过经典的溶菌酶溶解硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶渗透色谱法实现其分离和纯化。
该酶的特性：分子量20,000至250,000道尔顿，25,000至100,000为好，最好是40,000至50,000道尔顿，等电点PH值为3.0至8.0，最好是3.5至5.5，特别是4.0至5.0。酶产品的最佳PH是5.0至10.0，特别是8.0至9.0。
用气相定序分析测定精制的氨基转移酶的N-末端最初33氨基酸为：Met-Asn-Ser-Asn-Lys-Glu-Leu-Met-Gln-Arg-Arg-Ser-Gln-Ala-Ile-Pro-Arg-Gly-Val-Gly-Gln-Ile-His-Pro-Ile-Phe-Ala-Asp-Arg-Ala-Glu(Thr)-Asn-Asn(Gly)。
该氨基酸序列表明与已有文献中已知的氨基转移酶没有同源性。
该氨基转移酶可以被文献已知的抑制剂O-(羧甲基)-羟胺所抑制。在标准试验条件下(例3，酶活性)被大约0.1至1μm的O-(羧甲基)-羟胺抑制50％。
测定证明，该酶对于高温出乎意料地稳定，因此在纯化时，可以利用酶在70℃连续培育10分钟，使其它的蛋白质由于热变性而与该氨基转移酶分离。
用本发明的氨基转移酶不能生产20种蛋白基因氨基酸，它仅对于(3-羧基-3-氧化丙基)-甲基次膦酸以及丁二酸半醛或它们的盐具有特异性，通过谷氨酸的氨基的转移可以由它们生产无蛋白基因氨基酸L-PPT以及γ-氨基丁酸，作为相应的酮酸酯，可以加入低级烷基(C1-C6)酯。
根据本发明，有效量的氨基转移酶以游离或固定形式加入到氨基转移过程中去，对于该酶的固定，可考虑已知的方法，例如在德国公开说明书3237341和3243591中描述的方法。已证实，使用醋酸乙烯酯和丁二烯乙烯-脲的共聚物具有实质的优点，它的表面在乙酸盐基团水解后用环氧乙烷基团进行了改进。本发明的氨基转移酶以高效率在该环氧乙烷上交链。并证明在载体上交链的酶非常稳定，并且长时间也几乎没有酶的活性损失。其优点还有该酶根据需要用少量的大约5μm的磷酸吡多醛进行再生。
氨基转移反应可以在一种pH范围约为4至12，最好在8至10范围的生理学中性溶液中进行，使得该酶没有值得注意的阴性影响。反应温度可在20°～70℃范围中变化，在较低的温度下酶反应过程增长，而在较高温度下酶会失活。酶的反应在温度为20℃至60℃时进行，30℃至60℃较好，40℃至55℃最好。
加入谷氨酸及其盐作为氨基供体，该氨基供体以一个等当量或对α-酮酸或它的酯过量加入，证明对反应是有利的。比例从1∶1至5∶1，而1∶1至2∶1已证明是合适的。向反应混合物中加入反应成分可以以水溶液或固态物质、同时或连续方式加入。
形成的产品可以由反应溶液通过已知方法经离子层析和喷雾脱水得到：
以下给出的实例是用于进一步解释发明的，所给出的百分比如果没有特别说明均以重量计
                               例    1大肠杆菌DH-1的培养
为了得到本发明的氨基转移酶，由一个冻于永久型的该菌种培养(如微生物学中通常的方式)大肠杆菌DH-1。培养首先在液态、灭菌的完全培养基中进行，生长的细菌然后在灭菌佩特利培养皿中涂在固体营养基质上，个别的菌落接着在液体介质中继续培养。
液体培养基：
酪蛋白胨                               3.5克/升
肉胨                                   3.5克/升
氯化钠                                 5.1克/升
PH                                     7.5
灭菌                                   120℃，20分钟
固体培养基：
如液体培养基的组成一样，再另加15克/升的琼脂。
为了得到本发明的氨基转移酶，在每个含有1升灭菌介质的5升的埃伦迈厄烧瓶中，于37℃用每分钟200转的搅拌器在液体介质中培养微生物。
在对数生长期结束时将培养物离心收获，在液氮中深冻并于-80℃贮存。
                               例    2从大肠杆菌DH-1中分离氨基转移酶
将深冻的微生物悬浮在2倍体积(2ml/g细菌)的缓冲剂A〔20mM磷酸缓冲液，20μM磷酸吡哆醛，10mM巯基乙醇(PH7.0)〕加1mM苯甲基磺酰氯(PMSF)中，并超声溶解，细胞碎片通过离心除去，澄清的上清液通过硫酸铵沉淀分级，所需要的氨基转移活性物是在40％到70％硫酸铵沉淀中从溶液中沉淀出并通过离心得到。在缓冲液A中重新悬浮并对50倍体积的缓冲液A进行渗析。
渗析物在1mM α-酮戊二酸(Ketoglutarat)存在下于770℃加热10分钟并将变性蛋白通过离心除去，澄清的上清液通过一个0.45μM膜过滤后加到具有季胺基团的琼脂糖的阴离子交换剂(Q-SePharose HP，Pharmacia)上，该交换剂已用缓冲剂A平衡过。未结合的蛋白通过用缓冲剂A洗液柱除去，结合的蛋白用线性梯度液(0至1.0M KCl的缓冲液A)洗提交换柱，并分组收集，氨基转移酶可以在大约0.3M KCl下从柱中提洗出来。
合并酶的活性组分，从溶液中完全沉淀体积缩小的蛋白质(80％饱和硫酸铵)，并通过一个分级范围为10-400千道尔顿的凝胶过滤柱(Ultrogel ACA 44，Serva)进行分级，凝胶过滤时的推进缓冲液是20mM嗪-N，N′-(2-乙基磺酸)，10μM磷酸吡哆醛，5mM 2-巯基乙醇，0.1M KCl(PH7.0)在凝胶过滤以后得到的酶活性成分对25mM咪唑(PH7.5)渗析，将所得到的具有相对应等电点的蛋白质在Polybuffer交换剂94(Firma Pharmacia)上用Polybuffer 74(Pharmacia)分级。本发明的氨基转移酶在PH值为4.35时从柱上提洗出来。将酶活性成分蛋白质完全地从溶液中沉淀出来(80％硫酸胺)，对缓冲剂A渗析，并在具有季铵基团的琼脂糖的高效分析阴离子交换剂(Mono Q，Pharmacia)上进行色层分析(缓冲液系统同Q-Sepharose HP)。
在该纯化步骤后，氨基转移酶已从所有的异种蛋白中分离。
                             例    3酶的特性
——分子量：大约44000道尔顿(用聚丙烯酰胺SDS-凝胶电泳法测定)
——等电点：PH4.35(在Pharmacia公司的PBE94/Polybuffer 74上通过聚焦色谱法测定)
——酶活性：酶活性的测定或是在存在α-酮戊二酸作为氨基受体的情况下，通过L-PPT的转氨基作用测定(试验1)，或通过以谷氨酸作为氨基供体由(3-羧基-3-氧代-丙基)-甲基磷酸生产L-PPT试验测定(试点2)，两个试验提供了可对比的结果，基于比较容易实施，技术不很高的试验1是适用的。试验1：在100mM Tris-(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)/10μM磷酸吡哆醛(PH7.5)中将10mM PPT，10mMα-酮戊二酸在30℃下保温30分钟。生成的谷氨酸可按照Enzymology 113卷PP 245 ff中的方法，通过以后与谷氨酸脱氨酶的反应被确定。试验2：除用10mM(3-羧基-3-氧代-丙基-甲基-次膦酸)，10μM谷氨酸代替PPT和α-酮戊二酸外，其余和试验1相同，用一种氨基酸分析仪证明生成的L-PPT。
用这些试验测得纯化蛋白质的特异酶活性为265nkat/mg蛋白质(1 katal＝每秒转变1 Mol)——这样测定酶反应的最佳PH在约9，温度约为55℃。
——这种纯化的氨基转移酶N-端最初的40个氨基酸序列经气相定序仪测定如下：Met-Asn-Ser-Asn-Lys-Glu-Leu-Met-Gln-Arg-Arg-Ser-Gln-Ala-Ile-Pro-Arg-Gly-Val-Gly-Gln-Ile-His-Pro-Ile-Phe-Ala-Asp-Arg-Ala-Glu(Thr)-Asn-Asn(Gly)-20。
                       例    4用纯化的氨基转移酶生产L-PPT。
纯化的氨基转移酶以0.1mg/ml的浓度(特别是酶活性为15U/mg的蛋白质)在50mM Tris/10μM磷酸吡哆醛(PH9.0)中与30g/l钠-(3-羧基-3-氧代-丙基)-甲基次磷酸和60g/l L-谷氨酸于55℃下保温。在0至24小时的保温时间采取样品，取样后在95℃将酶灭活10分钟，离心并将上清液在氨基酸分析仪中检查形成的L-PPT。所达到的转化率为16.6g L-PPT/升/小时。提高酶的浓度可以明显提高收率。
反应结束后，加入的α-酮酸的94.3％转变成L-PPT(28.3g/l)。
                          例    5氨基转移酶的固定
为了固定氨基转移酶，使用一种实例2部分纯化的酶成分。在该酶制剂中，氨基转移酶占总蛋白量的20％，其酶活性为76.4nkat/ml(1 kat＝1 katal＝Mol转化/秒)。
在1M磷酸钾缓冲液(PH＝8.0)中将47ml该氨基转移酶制剂加到8g聚合物载体VA-Epoxy Biosynth(Riedelde Haёn生产的一种注册商标)上并在室温下摇晃2天。在用：1.50mM磷酸钾缓冲液PH7.0，
  2.1M磷酸钾缓冲液PH8.0和
  3.50mM磷酸钾缓冲液PH7.0冲洗后获得31克湿树脂。
将树脂与10mM 2-巯基乙醇(在50mM磷酸钾缓冲液中)保温1小时使多余的环氧乙烷转化。
该载体树脂呈现1975nkat的结合酶活性(64nkat/g湿树脂)，达到55％的结合率。
在50mM磷酸钾缓冲液中(PH7.0)与0.02％叠氮化钠一起在4℃下贮存。
                               例    6用固定化氨基转移酶生产L-PPT
将例5的结合了的氨基转移酶加入到一个柱式反应器中，来生产L-PPT。为此，用固定化的氨基转移酶充填20ml的层析柱，将柱恒温于42℃，以0.5ml/分的流率从柱上泵入底物溶液(20g/l 3-羧基-3-氧代-丙基-甲基-次磷酸(Keto-PPT)/60g/l L-谷氨酸/10μM磷酸吡哆醛PH8.0)。在通过该柱后，加入的keto-PPT有90.4％转化为L-PPT。

Claims (6)

1.生产氨基转移酶的方法，其特征在于，培养大肠杆菌DH-1并且分离具有下列性质的氨基转移酶：
——分子量为20,000至250,000道尔顿，
——等电点PH值为3.0至8.0
——PH最佳范围为5.0至10.0
——对于L-PPT，γ-氨基丁酸和谷氨酸作为氨基供体以及相应的酮化合物作为受体的底物的特异性。
2.如权利要求1的方法，其特征在于，分离具有如下性质的氨基转移酶：
——分子量为25,000至100,000道尔顿，
——等电点PH值为3.5至5.5之间，
——最佳PH值在8.0至9.0的范围。
3.如权利要求1或2的方法，其特征在于，培养温度在20°至40℃之间。
4.如权利要求3的方法，其特征在于，培养温度在25°至37℃之间。
5.如权利要求1或2的方法，其特征在于，培养是在PH值为5至8.5进行的。
6.如权利要求5的方法，其特征在于，培养是在PH值为5.5至8.0进行的。
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