JPH1028592A - リゾビウム属細菌によるアクリルアミドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 培地組成の至適化により、リゾビウム属細菌
を用いたアクリルアミドの商業的生産を可能にする。 【解決手段】 炭素源として、従来より高濃度のグリセ
リンを含有する培地、好ましくは、さらに主要窒素源と
して酵母エキス、及び少量のコーンスティープリカーを
含有する培地中でリゾビウム属細菌を培養し、得られる
培養物を用いてアクリロニトリルをアクリルアミドに変
換することによるアクリルアミドの製造方法。 【効果】 上記培地はリゾビウム属細菌の大量増殖を可
能にするので、本発明の方法は、商業的規模でのアクリ
ルアミドの生物学的生産法として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リゾビウム属に属
する微生物を用いて、アクリロニトリルをアクリルアミ
ドに変換することによるアクリルアミドの製造方法に関
する。特に本発明は、主要炭素源として、高濃度のグリ
セリンを含有する培地中で培養した上記微生物を用いた
アクリルアミドの高生産方法に関する。また本発明は、
さらに窒素源として、主として酵母エキス並びに少量の
コーンスティープリカー（以下、ＣＳＬと略称する）を
含有する培地中で培養した上記微生物を用いたアクリル
アミドの高生産方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】アクリルアミドの製造方法として、硫酸
法、銅触媒法などの化学的方法の他に、近年、アクリロ
ニトリルに水を付加してアクリルアミドを生成させる酵
素活性を有する微生物を利用する方法が種々開発されて
きた。このうち、特開平５−２３６９７７号には、リゾ
ビウム属に属する微生物を用いてニトリル類を原料とし
て対応するアミド類を製造できることが開示されてい
る。しかしながら、同号の実施例に開示された培地中で
該微生物を培養しても、十分な菌体量を得ることはでき
ず、そのため、該微生物を用いて商業的生産に見合う量
のアクリルアミドを生産できるまでには至っていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、アク
リルアミド産生リゾビウム属細菌を、アクリロニトリル
をアクリルアミドに変換する酵素活性を低下させること
なく大量に増殖させることができる培地組成を決定し、
該培地を用いて上記微生物を培養し、その培養物を利用
して商業生産に見合う量のアクリルアミドを生産する方
法を提供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく該微生物のための培地組成を種々検討し
た。その結果、主要炭素源として、従来使用されてきた
よりも高濃度のグリセリンを含有する培地中で該微生物
を培養することにより、従来より大量の菌体量が得られ
ることを見出すとともに、該培養物を用いて従来より大
量のアクリルアミドを製造することに成功した。本発明
者らは、さらに研究を重ねた結果、酵母エキスの他に少
量のＣＳＬを窒素源として用いることにより、菌体生産
量をさらに増大させ、より大量のアクリルアミドを製造
することに成功して本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、炭素源として０．７
〜２％のグリセリンを含有する培地中でリゾビウム属に
属する微生物を培養し、得られる培養物を用いてアクリ
ロニトリルをアクリルアミドに変換することを特徴とす
るアクリルアミドの製造方法である。また本発明は、さ
らに培地の窒素源の７０％以上が酵母エキス、および１
〜２０％がＣＳＬであることを特徴とするアクリルアミ
ドの製造方法である。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明において使用される微生物
は、リゾビウム属（Rhizobium ）に属し、アクリロニト
リルをアクリルアミドに変換する能力を有するものであ
れば特に限定されない。リゾビウム属細菌は、グラム陰
性桿菌で、好気性の化学合成従属栄養細菌である。マメ
科植物の根と共生して根粒を形成し、窒素固定を行うこ
とでよく知られている。リゾビウム属細菌のうち、アク
リルアミド生産性のものとして、例えば、リゾビウム・
ロティ（Rhizobium loti）IAM13588, リゾビウム・レグ
ミノサーラム（Rhizobium legminosarum）IAM12609, リ
ゾビウム・メリオティ（Rhizobium melioti ）IAM12611
等の公知菌株が挙げられる。

【０００７】リゾビウム属細菌の培養は、主要炭素源と
してグリセリンを、および該微生物が同化し得る窒素源
を含有する培地中で、好ましくは好気的条件下（例え
ば、振とう培養、液内培養など）で行われる。他の炭素
源として、グルコース、フルクトース、澱粉、ラクトー
ス、アラビノース、キシロース、デキストリン、糖蜜等
を含有してもよいが、菌体の増殖を旺盛にするために
は、グリセリンを単独炭素源とすることが好ましい（但
し、窒素源として加えられる有機窒素化合物を除く）。
培地のグリセリン濃度としては、０．７〜２％の範囲で
ある。

【０００８】培地の窒素源としては、酵母エキス、ペプ
トン、グルテン粉、綿実粉、大豆粉、ＣＳＬ、乾燥酵
母、尿素、アミノ酸等の有機窒素化合物、およびアンモ
ニウム塩（硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン
酸アンモニウムなど）等の無機窒素化合物を単独、或い
は組み合わせで使用することができる。

【０００９】培地の窒素源組成の好ましい態様は、全窒
素源の７０％以上が酵母エキス、１〜２０％がＣＳＬで
ある組み合わせである。ＣＳＬは極めて安価であるの
で、窒素源としてＣＳＬを使用することは、生産コスト
の低減にも寄与する。

【００１０】炭素源および窒素源は、上に例示した化合
物の純粋な形態のものを使用する必要はない。むしろ純
度の低い物質には微量の成長因子や相当量の無機栄養素
が含まれており、使用に適している。

【００１１】アクリロニトリルをアクリルアミドに変換
する酵素を誘導するために、誘導物質、例えば、アクリ
ロニトリル等のニトリル類、或いはアクリルアミド等の
アミド類を培地に添加してもよい。また、該酵素の活性
化に要求される金属イオンを含む無機塩類、例えば、硫
酸第一鉄、塩化コバルト等を必要に応じて添加してもよ
い。

【００１２】さらに、所望により、炭酸カルシウム、リ
ン酸カリウムまたはリン酸ナトリウム、塩化カリウムま
たは塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩類を
添加することもできる。また、培地が発泡する場合、必
要に応じて液体パラフィン、高級アルコール、植物油、
ミネラル油またはシリコン等の消泡剤を添加してもよ
い。

【００１３】培地のｐＨは、通常ｐＨ６〜９、好ましく
は７〜８の範囲で適宜選択される。

【００１４】大量増殖のための培養条件としては、液内
好気性条件が好ましい。少量の培養にはフラスコまたは
ボトル中での振とうまたは表面培養が用いられる。大型
発酵タンク中で大量増殖させる場合には、まず、比較的
少量の培地でリゾビウム属細菌を培養し（前培養）、対
数増殖期にある前培養物を無菌的に大型発酵タンクに接
種することにより行うのがより効率的である。

【００１５】培養物の攪拌および通気は様々な方法で行
うことができる。攪拌は、プロペラもしくはこれに準じ
る機械的攪拌装置の使用、培養器の回転もしくは振と
う、ポンプ装置の使用または滅菌エアーを通過させるこ
と等により行うことができる。通気は培養物中に滅菌エ
アーを通過させることにより有効に行うことができる。

【００１６】培養は、通常約４〜４０℃、好ましくは約
２０〜３０℃で約１〜１０日間行われ、これらは培養条
件およびスケールに応じて適宜変更される。

【００１７】リゾビウム属細菌のアクリロニトリルをア
クリルアミドに変換する酵素は、上記の培地および培養
条件で該微生物を培養後、菌体抽出液または培地から、
例えば、硫安分画、透析、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフ
ィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロ
マトグラフィー、等電点電気泳動等の任意慣用の分離操
作を組み合わせることにより単離精製できる。

【００１８】本発明の「リゾビウム属に属する微生物を
培養し、得られる培養物を用いてアクリロニトリルをア
クリルアミドに変換することによるアクリルアミドの製
造方法」は、アクリロニトリルの存在下に該微生物を培
養し、得られる培養物から生成したアクリルアミドを回
収・精製する方法、および培養終了後の該微生物培養物
もしくは菌体、或いはそれらの処理物にアクリロニトリ
ルを接触させて、得られる反応混合物からアクリルアミ
ドを回収・精製する方法の両者を包含する。前者の場
合、基質となるアクリロニトリルは培養開始時にその全
量を添加しても、培養中に連続的または間欠的に添加し
てもよい。また、生成したアクリルアミドを培養終了後
に一括して取り出しても、培養中に連続的または間欠的
に取り出してもよい。また、後者の場合、微生物菌体ま
たは菌体もしくは培地を処理して得られる酵素（以下、
両者をまとめて生体触媒という）を固定化して用いるこ
ともできる。固定化することにより、生体触媒の反復的
および連続的使用が可能となり、また、生体触媒の安定
性が増すなどの利点がある。固定化法は、従来公知の担
体結合法、吸着法、架橋化法および包括法から生体触媒
の種類に応じて適宜選択される。担体結合法は、多孔性
高分子膜に生体触媒を共有結合させる方法で、担体とし
てはアセチルセルロース、コラーゲン、ポリビニルアル
コール等が用いられる。吸着法は、多孔性膜、たとえ
ば、ニトロセルロース等に生体触媒を非共有結合的に吸
着させる方法である。架橋化法は、グルタルアルデヒド
等の二官能性試薬を用いて生体触媒間に共有結合を導入
して不溶化させる方法である。包括法は、ポリアクリル
アミド、コラーゲン、アルギン酸、アガロース、カラギ
ーナン、寒天、感光性樹脂、ポリウレタン等の高分子ゲ
ルマトリックス中に生体触媒を閉じ込める方法である。

【００１９】さらに、固定化菌体を用いて連続または流
加培養により、アクリロニトリルをアクリルアミドに変
換することもできる。

【００２０】リゾビウム属細菌を培養し、得られる培養
物を用いてアクリロニトリルをアクリルアミドに変換す
ることによるアクリルアミドの製造方法の具体例とし
て、培養終了後の該微生物菌体にアクリロニトリルを接
触させる方法を以下に示す。

【００２１】上述の方法により培養したリゾビウム属細
菌の培養物を濾過または遠心分離して菌体を集め、これ
を水、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液等に懸濁する。緩衝液のｐＨ
は、ｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ６〜８の範囲で適宜
選択される。該懸濁液にアクリロニトリルを加えて０〜
５０℃、好ましくは０〜２５℃で１〜１０００時間静置
または攪拌して反応させる。基質となるアクリロニトリ
ルは、反応の進行に応じて逐次添加してもよい。

【００２２】反応終了後、該反応混合物を濾過または遠
心分離して菌体を除去し、得られる上清をそのままアク
リルアミド溶液として利用してもよいし、或いは任意慣
用の手段により濃縮して粉末として回収してもよい。ま
た、必要に応じてイオン交換樹脂、イオン交換膜、活性
炭等を用いてさらに純度を高めることもできる。

【００２３】

【実施例】以下に、実施例を示して本発明をより具体的
に説明するが、これらは単なる例示であって、何ら本発
明を限定するものではない。

【００２４】実施例１ アクリルアミド生産量に及ぼす
培地の炭素源組成の効果 単独炭素源（窒素源として添加される有機窒素化合物お
よび誘導物質として添加されるアクリルアミドに含まれ
る炭素を除く；以下も同様）として、１％のグルコー
ス、グリセリン、デンプンまたはデキストリンを含有
し、さらに以下の組成（表１）を有する培地をそれぞれ
調製した。

【００２５】

【表１】

【００２６】これらの培地１００ｍＬをそれぞれ５００
ｍＬ三角フラスコに入れ、アクリルアミド産生リゾビウ
ム属菌Rhizobium loti IAM-13588株を接種し、３０℃、
２３０ｒｐｍの条件下で８日間培養した。

【００２７】培養終了後、各培養物を微量採取し、適当
に希釈して６６０ｎｍに対する吸光度を測定し、予め求
めた吸光度と乾燥菌体重量（ｇ／Ｌ）との関係式より、
各培養物１Ｌあたりの乾燥菌体重量を算出し、比較した
（表２）。

【００２８】次に、該培養物を１０，０００ｒｐｍで１
０分間遠心分離して菌体を回収し、生理食塩水で洗浄
後、０．１Ｍ ＮａＨ₂ ＰＯ₄ −ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ
７．００）に懸濁した。該懸濁液に２％（ｗ／ｖ）アク
リロニトリルを添加し、５℃で３０分間静置して反応を
行わせた。反応終了後、該反応混合物を遠心分離して菌
体を除去し、得られた上清をガスクロマトグラフィーに
かけて生成したアクリルアミドを定量した。培養物１Ｌ
あたりのアクリルアミドの生産量を、グルコースを炭素
源とした場合の数値を１００とした相対値に換算し、炭
素源組成の効果を比較した（表２）。また、アクリロニ
トリルをアクリルアミドに変換する酵素の活性を、単位
時間（ｈ）に単位乾燥重量（ｇ）あたりの菌体により生
成されるアクリルアミド量（ｍｇ）として算出し、同様
にグルコースを炭素源とした場合の活性値を１００とし
た相対活性で表し、炭素源組成の効果を比較した（表
２）。

【００２９】

【表２】

【００３０】その結果、炭素源としてグリセリンを使用
した場合に、最大の菌体量が得られた。また、酵素活性
も他の炭素源を使用した時に比べて幾分高いレベルを示
した。デンプンおよびデキストリンを炭素源とすると、
菌体の増殖が著しく低下した。以上より、アクリルアミ
ド生産のためのリゾビウム属菌の培地の炭素源として
は、グリセリンの使用が最も好ましいことが示された。

【００３１】実施例２ アクリルアミドの生産量に及ぼ
す培地のグリセリン濃度の効果 次に、培地に添加するグリセリンの至適濃度の検討を行
った。単独炭素源としてグリセリンを０．４，０．５，
０．７，１，２，４または６％の濃度で含有し、それ以
外の成分は実施例１で使用した培地と同じ組成のものを
それぞれ調製し、実施例１と同様の方法で培養、アクリ
ルアミド生成反応および分析を行った。培養物１Ｌあた
りのアクリルアミド生産量および酵素活性を、グリセリ
ン濃度０．４％の培地を使用したときの数値を１００と
した相対値に換算して相互に比較した（図１）。

【００３２】その結果、従来アクリルアミド生産のため
のリゾビウム属菌の培地として使用されているグリセリ
ン濃度（０．５％以下）よりも高濃度、具体的には０．
７〜２％のグリセリンを添加することによって、菌体の
増殖能および比活性値が顕著に向上することが分かっ
た。すなわち、このグリセリン濃度範囲で培養した場合
に、アクリルアミドの生産性が大きく上昇することが示
された。

【００３３】実施例３ アクリルアミドの生産量に及ぼ
す窒素源組成の効果 窒素源（窒素源全体で培地の０．２５％を占める；但
し、誘導物質として添加するアクリルアミドに含まれる
窒素を除く）として、酵母エキスのみ、酵母エキス：Ｃ
ＳＬ＝９６：４または酵母エキス：ＣＳＬ＝８４：１６
を含有し、且つ以下の組成（表３）を有する培地をそれ
ぞれ調製した。

【００３４】

【表３】

【００３５】これらの培地を用いて、実施例１と同様の
方法で培養、アクリルアミド生成反応および分析を行っ
た。培養物１Ｌあたりのアクリルアミド生産量および酵
素活性を、酵母エキスのみを添加した培地を使用したと
きの数値を１００とした相対値に換算して相互に比較し
た（表４）。

【００３６】

【表４】

【００３７】その結果、ＣＳＬの含有量が多いほど菌体
の増殖能が著しく向上することが判明した。しかしなが
ら、酵素活性はＣＳＬの添加量を増すにしたがって、逆
に低下する傾向が認められた。したがって、アクリルア
ミドの生産性を大きく向上させるＣＳＬの至適濃度は、
全窒素源の約１〜２０％の範囲であることが示された。

【００３８】

【発明の効果】本発明のリゾビウム属細菌を用いたアク
リルアミドの製造方法は、該微生物を培養するための培
地組成、特に炭素源および窒素源の組成を改良すること
により、アクリロニトリルをアクリルアミドに変換する
酵素の活性を低下させることなく菌体の増殖能を大きく
向上させることを特徴とする。したがって本発明の方法
は、商業的規模でのアクリルアミドの生物学的生産を可
能にする点で極めて有用である。さらに本発明の方法
は、窒素源の１つとして安価なＣＳＬを使用することを
特徴とするので、より安価なアクリルアミドの生産を可
能にする。

【図面の簡単な説明】

【図１】アクリルアミドの生産量、アクリロニトリルを
アクリルアミドに変換する酵素の活性及び菌体量に及ぼ
す培地中のグリセリン濃度の効果を示す図である。培養
物１Ｌあたりのアクリルアミド生産量（◆）及び酵素活
性（▲）は、グリセリン濃度０．４％のときの数値を１
００とした相対値でそれぞれ示している。棒グラフは培
養物１Ｌあたりの乾燥菌体重量を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 谷口 浩二 福井県坂井郡金津町自由ヶ丘１丁目８番10 号 レンゴー株式会社金津化学品バイオ工 場内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 炭素源として０．７〜２％のグリセリン
   を含有する培地中でリゾビウム属に属する微生物を培養
   して、得られる培養物を用いてアクリロニトリルをアク
   リルアミドに変換することを特徴とするアクリルアミド
   の製造方法。
2. 【請求項２】 培地の窒素源の７０％以上が酵母エキ
   ス、および１〜２０％がコーンスティープリカーである
   ことを特徴とする請求項１記載のアクリルアミドの製造
   方法。