CN102634504B - 微生物中酶活性的诱导和稳定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在酶或能产生所述酶的微生物中诱导所需活性的方法。本发明进一步涉及稳定在微生物中的活性的方法。在具体实施方式中，本发明提供了用于诱导和稳定腈水合酶活性、酰胺酶活性和天冬酰胺酶I活性的方法。本发明进一步提供包含具有被诱导和/或被稳定的活性的酶或者微生物的组合物。

Description

微生物中酶活性的诱导和稳定
本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/US2007/061315，中国国家申请号为200780011311.6，申请日为2007年1月30日，发明名称为“微生物中酶活性的诱导和稳定”。
技术领域
本发明主要涉及培育用于酶产生的微生物的方法和包含具有经诱导和/或稳定的活性的酶或微生物的组合物。更具体而言，本发明涉及通过使用特定的生长培养基来诱导微生物中所需酶活性的方法，以及涉及在酶或能产生所述酶的微生物内稳定所需活性的方法。
背景技术
长期以来，微生物及其酶在各种产品的制备中用作生物催化剂。酵母在糖至醇的发酵中的作用是立即可以想到的例子。近年来，对微生物及其酶在通常被认为是不符合酶用途的商业活动中的应用的兴趣日益增长。一个例子是微生物在工业加工，尤其是在废物处理中的应用。
含腈化合物广泛用于各种商业应用。例如，腈用在许多具有商业用途的化合物的合成中，所述化合物包括胺、酰胺、脒、羧酸、酯、醛、酮、亚胺和杂环化合物。腈也可用作溶剂、除草剂，以及用在去污剂和防腐剂的合成中。一种商业上更重要的腈是丙烯腈，其用在丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸纤维、共聚物树脂和腈橡胶的生产中。
在腈的生产中产生的废物流经常含有高浓度的危险性含氮化合物。例如，所述废物流可含有腈，诸如乙腈、丙烯腈、琥珀腈和富马腈。此外，这样的废物流还可含有危险性化合物，如氰化物、丙烯酰胺、丙烯醛和氰醇。由于危险性废物通常不能合法地排放到环境中，因此在商业生产过程中，处理废物流以除去或治理一种或多种危险性组分的方法是重要的。
已完成一种用于处理氮废物流的方法，其采用某些微生物将腈化合物转化为其相应的酰胺或酸。例如美国专利号3,940,316和美国专利号4,001,081公开了使用腈水合酶微生物由丙烯腈生产丙烯酰胺。
通常，腈转化微生物在涉及腈水合酶和酰胺酶的两步反应中降解脂肪族腈。在第一步中，腈水合酶催化所述腈(或氰醇)水解为相应的酰胺(或羟基酸)。在第二步中，酰胺酶催化所述酰胺水解为相应的酸或羟基酸。相似的是，一些微生物已显示出通过腈水解酶的作用直接将芳香族腈转化为其相应的酸从而降解这些腈。
由于起初的报道证明了丙烯腈转化为丙烯酰胺的生物转化的潜在商业用途，因此，在所述腈的微生物降解中所涉及的酶已受到显著关注。手性酸的酶法制备(诸如由氰醇前体得到羟基酸)的可能性也已成为该领域内颇受关注的焦点。尽管有很有前景的结果，但是以上讨论的腈水合酶/酰胺酶转化的多种潜在应用依然未得到完全开发。
微生物及其酶的日益增加的用途的另一个例子是天冬氨酸的形成。天冬酰胺酶I是催化天冬酰胺水解为天冬氨酸的酶，如下所示：
HOOCCHNH2CONH2+H2O→HOOCCHNH2CH2COOH+NH3
天冬酰胺酶I可在细菌、植物和很多动物中找到；然而由于人白细胞不具有所必需的天冬酰胺合成酶，所以所述细胞不能生成天冬酰胺。因此已发现天冬酰胺酶I可有效治疗人恶性白血病。白血病细胞通常具有低水平的天冬酰胺合成酶，所述酶有时候完全缺失。因此，白血病细胞通常需要外界来源的天冬酰胺。由于天冬酰胺酶I将天冬酰胺转化为天冬氨酸，因此向患有白血病的患者施用天冬酰胺酶I进一步限制了所述癌细胞的天冬酰胺的可供来源，并且起到使得所述细胞变弱的作用，使其更容易受到化疗的影响。因此，通常作为联合疗法的一部分与化疗剂一起向白血病患者施用天冬酰胺酶I。
在这样的治疗中所使用的天冬酰胺酶I目前获自大肠杆菌(E.coli)(以异四聚体的形式)和欧文氏菌(Erwinia)(以同四聚体的形式)，但这些来源各自具有缺点。例如，获自大肠杆菌的天冬酰胺酶I不如获自欧文氏菌的天冬酰胺酶I有效。然而，与使用大肠杆菌相比，使用欧文氏菌产生天冬酰胺酶I更加困难。此外，这些来源可导致在所分离的酶中存在不利的革兰氏阴性毒素。因此，存在以下需求，即由各种微生物提高天冬酰胺酶I的产生，并避免同时产生有害的革兰氏阴性毒素。
稳定性，是实用性生物催化剂的关键因素，已成为在许多商业应用中使用腈水合酶和/或酰胺酶的重要障碍。虽然固定和化学稳定剂是公认的提高酶稳定性的方法，但目前的固定和稳定技术仍需要进一步的发展。因此，在本领域中仍存在对在各种微生物中，尤其是在能产生在含腈化合物的降解中有用的酶的微生物中，诱导高水平的酶活性的方法的需求。此外，还存在对提高含腈化合物降解中的关键酶的稳定性的方法的需求。
发明内容
本发明主要涉及在微生物中诱导和稳定酶活性的方法。本发明特别地采用产生腈水合酶的微生物来诱导产生大量有用的酶。例如，在某些实施方式中，本发明提供了用于诱导产生来自腈降解微生物的腈水合酶(尤其是比先前可能水平更高的水平)、天冬酰胺酶I和酰胺酶的方法。在其他实施方式中，本发明提供了提高诸如腈水合酶、天冬酰胺酶I和酰胺酶等各种酶的稳定性的方法。本发明还提供了能随时间流逝而保持商业有用水平的酶活性的生物解毒催化剂(尤其是加入了酶，如腈水合酶和酰胺酶)。所述生物解毒催化剂具体的特征在于，所述生物催化剂的酶活性，正如此处所描述，可受其环境的诱导和稳定。
本发明的具体特征在于，此处所公开的方法可用于诱导其水平和稳定性在实际生物解毒催化剂中均有用的酶活性。本发明的特征还在于诱导较高水平的天冬酰胺酶I的能力，所述天冬酰胺酶I来自包括(但不局限于)革兰氏阳性微生物在内的微生物；以及提高这些天冬酰胺酶I活性的稳定性的能力。
本发明特别有利之处在于，能实现所述微生物的诱导和稳定，而无需将诸如丙烯腈等危险性腈排放到环境中。先前，认为在某些微生物中诱导特定酶活性需要加入化学诱导剂。例如，在紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)和绿针假单胞菌(Pseudomonas chloroaphis)中的腈水合酶活性的诱导中，通常必须补充危险化学品，如乙腈、丙烯腈和丙烯酰胺等。然而，仅根据本发明，已惊奇地发现，在产生腈水合酶的微生物中的高酶活性可通过使用诸如含有酰胺基的氨基酸及其衍生物等无危险性培养基添加剂进行诱导和稳定。更具体而言，根据本发明，天冬酰胺、谷氨酰胺或其组合可用作诱导剂，而完全排除了诸如乙腈、丙烯腈和丙烯酰胺等危险化学品。因此，本发明有利地提供了用于产生商业有用的酶和微生物的更安全方法，以及它们在其他方法中的用途，如用于废物流的解毒。
在优选实施方式中，正如此处所述，本发明采用经改进的培养基、固定和稳定技术，可以显著提高许多酶和能产生所述酶的微生物的产量和稳定性。例如，通过使用包含含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培养基可以提高诱导和稳定作用。
在一个方面，本发明包括产生腈水合酶的微生物的培育方法。本发明优先包括在包含一种或多种含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培养基中培养所述微生物。在具体实施方式中，所述产生腈水合酶的微生物包括来自红球菌属(genus Rhodococcus)的细菌。在优选实施方式中，所述含有酰胺基的氨基酸选自由天冬酰胺、谷氨酰胺或其组合组成的组。
在其他实施方式中，本发明提供了在产生腈水合酶的微生物中诱导所需酶活性的方法。优选的是，所述方法包括在包含一种或多种含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培养基中培养所述产生腈水合酶的微生物。在具体实施方式中，通过所述方法诱导的酶活性包括腈水合酶活性、酰胺酶活性或天冬酰胺酶I活性。本发明的方法可进一步包括其他处理步骤，诸如回收具有所需酶活性的经培养的微生物，回收具有所需活性的酶，将所述微生物或来自所述微生物的细胞附加(affix)在基质上，以及交联来自所述微生物的细胞。
在更多其他实施方式中，本发明特别提供了用于在酶或能产生所述酶的微生物中稳定所需活性的方法。在一个实施方式中，这样的方法包括将所述酶，或者能产生所述酶的微生物，与一种或多种含有酰胺基的氨基酸相接触。
在本发明的其他实施方式中，所述酶，或能产生所述酶的微生物可以被固定。所述固定可发挥将所述酶、微生物或细胞附加在基质上以有助于使处理简便的作用。在其他实施方式中，这样的固定可实际上发挥稳定所诱导的活性，从而延长所述诱导的活性能被利用的时间的作用。所述固定可包括所述酶、微生物或细胞对基质的表面附着。作为另外一种选择，所述固定可包括将所述酶、微生物或细胞至少部分地俘获在所述基质中，或者通过将细胞与诸如戊二醛交联而固定。这有利地使得具有受诱导活性的固定材料(例如催化剂)以如下的方式存在，即促进所述催化剂与目标材料的反应，并且促进所需产物的回收而同时将所述催化剂保持在反应培养基中并且处于反应模式中。
在具体实施方式中，所述基质包括聚合材料，优选为选自由藻酸盐和含有酰胺基的聚合物组成的组。本发明也可包括其他基质材料。根据本发明的稳定的活性的特征优先在于，相对于初始活性而言，保持特定活性百分比。例如，在一个实施方式中，所述酶或所述能产生所述酶的微生物的所需活性经稳定使得在约25℃的温度至少30天的时间以后，所需活性保持在由所述酶或所述能产生所述酶的微生物所表现出来的初始活性的至少约50％的水平。
在更多其他实施方式中，本发明提供了用于制备具有特定酶活性的酶或微生物的方法。例如，在一个实施方式中，本发明提供了用于制备具有腈水合酶活性的酶或微生物的方法。具体而言，所述方法包括通过在包含一种或多种含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培养基中培养所述微生物从而诱导所述微生物中的腈水合酶活性，并回收所述具有腈水合酶活性的酶或微生物。在其他实施方式中，本发明提供了用于制备具有天冬酰胺酶I活性或酰胺酶活性的酶或微生物的方法。
本发明的特征还在于在微生物中多重诱导酶活性的能力，从而使得所述微生物或其产生的酶能降解多种化合物。因此，在一个实施方式中，本发明的方法包括通过在包含一种或多种含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培养基中培养微生物从而在所述微生物中诱导对多种含腈化合物的腈水合酶活性。可选的是，所述方法进一步包括回收具有降解多种含腈化合物的腈水合酶活性的所述酶和微生物。当然，在其他实施方式中，本发明提供了多重诱导其他类型活性的方法。
在另一方面，本发明提供了在本发明的方法中以及对于生产诸如生物过滤器等各种设备特别有用的新型组合物。在一个实施方式中，本发明的组合物包含：(a)包含一种或多种含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的营养培养基；(b)一种或多种产生酶的微生物；和(c)一种或多种酶。优选的是，所述酶选自由腈水合酶、酰胺酶、天冬酰胺酶I及其组合组成的组。在其他实施方式中，所述一种或多种微生物包括选自由红球菌属(genus Rhodococcus)、短杆菌属(genus Brevibacterium)及其组合组成的组的细菌。在优选实施方式中，所述一种或多种微生物可至少部分地固定在基质上。
附图说明
参考以下附图对本发明进行具体描述；然而，提供的这些附图仅仅描述本发明的优选实施方式，而本发明并非局限于此。
图1是在根据本发明的一个方法的一个实施方式中，由在藻酸钙中固定所提供的对腈水合酶活性的稳定作用的图解描述；
图2是在根据本发明的一个方法的一个实施方式中，由在聚丙烯酰胺中固定所提供的对腈水合酶活性的稳定作用的图解描述；
图3是在根据本发明的一个方法的另一个实施方式中，由在硬化的、聚乙烯亚胺交联的藻酸钙或聚丙烯酰胺中固定所提供的对腈水合酶活性的稳定作用的图解描述；
图4是根据本发明的一个方法由通过戊二醛交联的固定所提供的对腈水合酶活性的稳定作用的图解描述；以及
图5是根据本发明的一个实施方式在用天冬酰胺诱导的红球菌(Rhodococcus sp.)DAP 96253细胞中天冬酰胺酶I活性的图解描述。
具体实施方式
现在参考本发明的具体实施方式以及特别地参考随之提供的各种附图，在下文中对本发明进行更完整的描述。实际上，本发明可以以许多不同的形式实施，而不应当理解为局限于此处所阐述的实施方式；更确切地说，提供这些实施方式使得本公开能满足适用的法律要求。正如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”、“所述”包括了复数形式的指代物。
本发明源自于以下令人惊奇的发现，即通过将含有酰胺基的氨基酸或其衍生物加入到包含特定酶或能产生这些酶的微生物的培养物或者组合物中，可诱导和稳定特定酶活性。此外，通过诸如附加、俘获和交联等固定方法可实现进一步的稳定。在具体实施方式中，提供了用于诱导高水平的来自腈降解微生物(包括产生腈水合酶的微生物)的腈水合酶和酰胺酶和提高所述腈水合酶的稳定性的方法。
此处描述的本发明的方法还提供了其他方法，这些方法可用于通过将所述腈部分转化为酰胺和/或酸从而对含有腈化合物的组合物进行解毒。这些方法也可以用于从诸如由制造和生产设备产生的废物流等各种组合物中除去不需要的腈化合物。
本发明通常提供了用于培养微生物(优先为诱导特异性酶活性)的方法。优选的是，所述方法包括在包含一种或多种含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培养基中培养所述微生物。在优选的实施方式中，所述含有酰胺基的氨基酸选自由天冬酰胺、谷氨酰胺、其衍生物，或其组合组成的组。例如，所述含有酰胺基的氨基酸可包括天然形式的天冬酰胺、无水天冬酰胺、天冬酰胺一水合物，天然形式的谷氨酰胺、无水谷氨酰胺和/或谷氨酰胺一水合物，每种均为L-异构体或DL-异构体的形式。
所述含有酰胺基的氨基酸或其衍生物在所述培养基中的浓度可根据所希望的最终培养结果而变化。例如，可为了产生具有特异性酶活性的微生物的目的而进行培养。在另外的实施方式中，可为了从所述经过培养的微生物中形成和收集特异性酶的目的而进行培养。在又一些实施方式中，可为了形成和收集具有相同或不同活性和功能的多种酶的目的而进行培养。
基于所述培养基或混合物的总重量，加入到所述生长培养基或混合物中的所述含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的量通常可最高达约10,000ppm(即约1重量％)。然而，本发明特别有利之处在于，可通过加入甚至更少的量而诱导酶活性。例如，在某些实施方式中，所述含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的浓度在约50ppm～约5,000ppm，约100ppm～约3,000ppm，约200ppm～约2,000ppm，约250ppm～约1500ppm，约500ppm～约1250ppm或约500ppm～约1000ppm的范围。
优选的是，将所述含有酰胺基的氨基酸或其衍生物加入到全营养培养基中。适合的全营养培养基通常是能向微生物提供其生长所需的必要营养的生长培养基，其最低限度包括碳和/或氮源。一种可用的培养基的具体例子是可商购获得的R2A琼脂培养基，其通常由琼脂、酵母提取物、示蛋白胨(proteose peptone)、酪蛋白水解物、葡萄糖、可溶性淀粉、丙酮酸钠、磷酸氢二钾和硫酸镁构成。可以用于本发明的液体全营养培养基的另一个例子是酵母提取物麦芽提取物琼脂(YEMEA)，其由葡萄糖、麦芽提取物和酵母提取物(但特别是不包括琼脂)。当然，在本领域中可用的任何全营养培养基均可用于本发明，以上描述的培养基仅仅是为了举例目的。
在其他实施方式中，本发明的方法可包括使用其他的添加剂加入到所述全营养培养基。通常，根据本发明有用的其他添加物或营养物是可有助于细胞生长更好、细胞量更大或者加速生长的那些添加物或营养物。例如，在一个实施方式中，所述营养完全的培养基可包括所述全营养培养基中已存在的所有碳水化合物源以外的碳水化合物源。
如上所述，大多数培养基通常含有一些含量的碳水化合物(例如葡萄糖)；然而，根据本发明，有用的是包括其他的碳水化合物源。提供的过量碳水化合物的类型可取决于所需的培养物产量。例如，在一些具体实施方式中，已发现加入诸如麦芽糖或麦芽糊精等碳水化合物提供了改善的天冬酰胺酶I的诱导。
在另一实施方式中，钴或其盐能加入到所述混合物或培养基中。例如，向所述培养基中加入钴(例如氯化钴)可特别有利于增加由所述经培养的微生物所产生的酶的质量。在某些实施方式中，钴或其盐可加入到所述培养基中，从而使得所述钴浓度量最高至约100ppm。优选的是，钴以约5ppm～约100ppm，约10ppm～约75ppm，约10ppm～约50ppm或约10ppm～约25ppm的浓度存在。
在另一些实施方式中，尿素或其盐可加入到所述混合物或培养基中。在某些实施方式中，尿素或其盐可加入到所述培养基中，从而使得尿素浓度量最高至约10g/L。优选的是，尿素以约5g/L～约100g/L，约10g/L～约75g/L，约10g/L～约50g/L或约10g/L～约25g/L的浓度存在。在具体实施方式中，尿素以约7.5g/L的浓度存在。
所述培养基也可包括其他成分而不背离本发明。例如，其他合适的培养基成分可包括商业添加剂，诸如棉籽蛋白、麦芽糖、麦芽糊精和其他商业碳水化合物。
本发明的特征特别在于能实现酶和能产生所述酶的微生物的诱导和稳定而不需要危险性的腈。如之前所指出，诸如腈水合酶活性等许多类型的酶活性的诱导传统上包括腈的补充，所述腈诸如乙腈、丙烯腈和琥珀腈等。此外，如果需要多重诱导(即，在单个酶中诱导活性以降解两种类型以上的腈)，通常需要包括两种类型以上的危险性腈。本发明特别地来自于使用含有酰胺基的氨基酸及其衍生物，这是由于酶诱导剂不需要危险化学品以促进单个或多重酶诱导。具体而言，本发明有益之处在于，通过在所述培养基或混合物中使用含有酰胺基的氨基酸或其衍生物，可以使多重诱导成为可能。再次可见，这是非常令人吃惊的，因为之前在所述培养基中要求有多重腈化合物以诱导对两种以上腈化合物的酶活性。然而，本发明通过使用完全安全的含有酰胺基的氨基酸实现了该特别有用的特征。因此，本发明对制备具有降解多种含腈化合物的活性的酶或微生物特别有用。此外，本发明的方法提供了对各种腈或酰胺，诸如具有单个C≡N部分、二腈(含有两个C≡N部分的化合物)或具有多个腈部分的化合物(例如丙烯醛氰醇)进行解毒的能力。这些酶或微生物在此处指被多重诱导。
虽然本发明不再需要危险性化学品用于酶活性诱导，但并没有排除使用这样的其他诱导剂。例如，在具体实施方式中，一种或多种腈可用于协助特异活性的形成。例如，补充有琥珀腈和钴的培养基可用于诱导天冬酰胺酶I活性。然而，腈的使用对于天冬酰胺酶I活性的诱导并非必须。更确切的是，尽管根据本发明，腈和其他危险性化学品的使用的确是不优选的，但是在具体实施方式中，如此使用也是可能的。
根据本发明可培养各种微生物以供使用。通常，能产生具有此处所述的有用活性的酶的任何微生物可用在本发明中。在特定实施方式中，根据本发明有用的微生物包括能产生腈水合酶的微生物。
如此处所使用，产生腈水合酶的微生物意指在通常被认为能产生腈水合酶的同时，还能产生一种或多种其他酶的微生物。如此处进一步描述，大多数微生物能产生多种酶，这样的产生通常由所述微生物的环境所决定。由此，尽管根据本发明而使用的微生物以产生腈水合酶的微生物进行公开，但这样的用语仅仅是指已知的这些微生物产生腈水合酶的能力，而并非限制所述微生物仅产生腈水合酶。相反，根据本发明有用的产生腈水合酶的微生物是至少能产生腈水合酶(即能产生腈水合酶或者产生腈水合酶和一种或多种其他酶)的微生物。
在本领域内已知大量产生腈水合酶的微生物。例如，属于诺卡氏菌属(Nocardia)[参见日本专利申请号54-129190]、红球菌属(Rhodococcus)[参见日本专利申请号2-470]、根瘤菌属(Rhizobium)[参见日本专利申请号5-236977]、克雷伯氏菌属(Klebsiella)[参见日本专利申请号5-30982]、气单胞菌属(Aeromonas)[参见日本专利申请号5-30983]、农杆菌属(Agrobacterium)[参见日本专利申请号8-154691]、芽孢杆菌属(Bacillus)[参见日本专利申请号8-187092]、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)[参见日本专利申请号8-56684]和假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌是可根据本发明使用的产生腈水合酶的微生物的非限制性例子。
此外，根据本发明有用的微生物的具体例子包括但不限制于诺卡氏菌属中的种(Nocardia sp.)、红球菌属中的种(Rhodococcus sp.)、紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)、克雷伯氏菌属中的种(Klebsiella sp.)、气单胞菌属中的种(Aeromonassp.)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、黄黄色杆菌(Xanthobacter flavas)、流黑欧文氏菌(Erwinia nigrifluens)、肠杆菌属中的种(Enterobacter sp.)、链霉菌属中的种(Streptomyces sp.)、根瘤菌属中的种(Rhizobium sp.)、百脉根瘤菌(Rhizobium loti)、豌豆根杆菌(Rhizobium legminosarum)、Rhizobium merioti、季也蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种(Klebsiellapneumoniae subsp.pneumoniae)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chloroaphis)、红串假单胞菌(Pseudomonas erythropolis)、酮戊二酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum)、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)和嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)。在特别优选的实施方式中，根据本发明使用的微生物包括红球菌属中的种(Rhodococcus sp.)DAP 96253和DAP 96255和紫红红球菌DAP 96622。
在其他实施方式中，根据本发明有用的微生物也可包括转化体。具体而言，所述转化体可以是其中插入和表达了从已知包括腈水合酶基因的微生物克隆的腈水合酶基因的任何宿主。例如，美国专利号5,807,730公开了使用大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主用作MT-10822菌株(FERM BP-5785)。当然，可根据本发明使用其他类型的基因工程细菌，只要所述细菌能产生如本文所述对本发明有用的一种或多种酶。
在所给出的属内，并非所有的种表现出相同类型的酶活性和/或产生。因此，可能的是通常已知包括能表现出所希望的活性的属中有一种或多种通常不表现所需活性的种。因此，在更多实施方式中，宿主微生物可包括并不具体已知具有所需活性但来自于已知具有能产生所需活性的特定菌株的属的细菌菌株。可向这样的菌株转移能用于引起所需活性的一个或多个基因。这样的菌株的非限制性例子包括马红球菌(Rhodococcus equi)和圆红球菌(Rhododoccus globerulus)PWD1。
正如此处所使用的，酶活性通常指酶在诸如将一种化合物转化为另一种化合物的过程中作为催化剂的能力。同样，此处所指的所需活性可包括由一种或多种微生物活性表达的一种或多种酶的活性。
在某些实施方式中，活性可用每质量的酶或细胞的“单位”来表示(通常基于细胞的干重，例如，单位/mg cdw)。“单位”通常指在限定的一组条件下，作为时间的函数，将特定含量的化合物转化为不同的化合物的能力。在具体实施方式中，1“单位”的腈水合酶活性可指在pH 7.0，30℃的温度下每分钟每毫克细胞(干重)将1μmol的丙烯腈转化为其对应的酰胺的能力。相似地，1单位的酰胺酶活性可指在pH 7.0，30℃的温度下每分钟每毫克细胞(干重)将1μmol的丙烯酰胺转化为其对应的酸的能力。此外，1单位的天冬酰胺酶I活性可指在pH 7.0，30℃的温度下每分钟每毫克细胞(干重)将1μmol的天冬酰胺转化为其对应的酸的能力。
在优选实施方式中，本发明的特征特别在于诱导出比使用先前已知的方法可能得到的活性更高的所需活性的能力。例如，在一个实施方式中，本发明能在产生腈水合酶的微生物中诱导腈水合酶活性，所述腈水合酶活性高于或等于在相同微生物中用含腈化合物诱导产生的活性。在优选实施方式中，所产生的腈水合酶活性高于在相同微生物中用含腈化合物诱导产生的活性。例如，根据本发明的方法产生的腈水合酶活性可比在相同微生物中用含腈化合物诱导产生的活性高至少5％。优选的是，根据本发明的方法产生的腈水合酶活性比在相同微生物中用含腈化合物诱导产生的活性高至少10％、至少12％或者至少15％。
根据本发明有用的微生物可从已知来源(诸如以上所述)选择或者可包括新分离的微生物。在本发明的一个实施方式中，通过在含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的混合物的存在下生长菌株，适用于本发明的微生物可被分离并被鉴定为有用的微生物菌株。所述微生物可以从已知的来源分离或者选择或者得到，或者可以根据在本发明的多重诱导后将腈混合物或腈与酰胺化合物的混合物或酰胺混合物解毒为相应的酰胺和/或酸的能力而从未来来源进行筛选。在此处提供的公开的教导下，进行测试以根据本发明确定所述微生物是否有用对于本领域技术人员而言仅仅是常规试验的问题。例如，在一项测试中，通过游离氨的检测可确定腈水合酶或酰胺酶的存在。参见Fawcett，J.K.和Scott，J.E.，1960，″A Rapid and Precise Method for the Determination ofUrea″，J.Clin.Pathol.13：156-159，在此引入作为参考。
本发明有利地提供了用于培养微生物，尤其是产生腈水合酶的微生物的方法。在某些实施方式中，本发明涉及用于在诸如产生腈水合酶的微生物等微生物中诱导所需酶活性的方法。优先的是，所述方法包括在包含一种或多种含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培养基中培养产生腈水合酶的微生物。在一个实施方式中，本发明提供了使用补充有含有酰胺基的氨基酸或其衍生物(优选包括天冬酰胺、谷氨酰胺或其组合)的培养基从而用于诱导腈解毒活性的方法。更具体而言，所述方法包括在所述培养基中培养所述微生物，并且可以收集所培养的微生物或者由所述微生物产生的酶。
根据可用于得到最佳生物量的方法可培养和收获所述微生物。在某些实施方式中，诸如当在琼脂板上进行培养时，所述微生物可培养至少约24小时，但通常少于六天。当在发酵罐中培养时，所述微生物优选在极限培养基中培养约1小时～约48小时，约1小时～约20小时或者约16小时～约23小时。如果需要更大的生物量，所述微生物可在所述发酵罐中培养更长的时间。在所述发酵阶段结束时，所培养的微生物通常通过例如刮擦、离心、过滤或本领域内已知的任何其他方法进行收集和浓缩。
在具体实施方式中，可在进一步指定的条件下培养所述微生物。例如，优选在约3.0～约11.0的pH，更优选为约6.0～约8.0的pH进行培养。进行培养的温度优选为约4℃～约55℃，更优选为约15℃～约37℃。此外，所溶解的氧压优先为约0.1％～100％，优选为约4％～约80％，并更优选为约4％～约30％。通过以环境空气、纯氧、过氧化物和/或其他能释放氧气的组合物的形式供应氧气，可以监测所溶解的氧压并将其保持在所需范围内。
根据本发明还可以将微生物生长和酶活性诱导的步骤分开。例如，根据本发明可以在不含有诱导酶活性所必需的添加物的第一培养基中生长一种或多种微生物。这可被称为所述微生物的生长阶段。在第二阶段(即，诱导阶段)，可将所培养的微生物转移到含有诱导酶活性所必需的添加物的第二培养基中。这样的第二培养基将优先包含所述含有酰胺基的氨基酸或其衍生物，正如此处所描述。
相类似的是，所述诱导添加物可在所需微生物的培养过程中的任意时刻加入。例如，在所述微生物的开始培养之前，所述培养基中可添加含有酰胺基的氨基酸或其衍生物。作为另外一种选择，所述微生物可以在培养基上培养预定的时间从而培育所述微生物，而在一个或多个预定时刻加入含有酰胺基的氨基酸或其衍生物从而在所述微生物中诱导所需活性。此外，可以在所述微生物的生长完成以后将所述含有酰胺基的氨基酸或其衍生物加入到所述生长培养基中(或者加入到包含之前生长好的微生物的单独混合物中)以诱导所需活性。
如上所述，本发明的方法特别有利于诱导所需的酶活性。包括此处所描述在内的许多类型的微生物能产生各种具有各种活性的酶。正如在本领域内通常所理解的，在微生物培养中诱导的酶活性的类型可根据所使用的微生物菌株、所使用的培育方法和与生长培养基一起使用的添加物而变化。令人惊奇的是，本发明可以通过使用含有酰胺基的氨基酸或其衍生物来诱导各种酶活性。在优选实施方式中，本发明提供了选自由腈水合酶、酰胺酶和天冬酰胺酶I组成的组的一种或多种酶的诱导。在具体实施方式中，可通过在包含一种或多种含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培养基中培养一种或多种来自于红球菌属的细菌从而诱导这些酶。
在具体实施方式中，本发明能同时诱导腈水合酶和酰胺酶。这特别有利于工业应用，如含腈废物流的处理。该处理要求将腈转化为酰胺的第一处理和将酰胺转化为酸的第二处理。同时产生腈水合酶和酰胺酶的能力将不再需要分别制备所述酶并且基本允许进行单一处理步骤。
在其他实施方式中，本发明特别提供了天冬酰胺酶I活性的诱导。令人惊奇的是，已发现在添加了含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培养基中，在紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)，DAP 96622(革兰氏阳性)、或红球菌属中的种(Rhodococcus sp.)，DAP 96253(革兰氏阳性)中诱导天冬酰胺酶I活性。根据本发明的该实施方式也可以优先地使用红球菌属的其他菌株。其他能产生天冬酰胺酶I的菌株包括绿针假单胞菌(ATCC 43051)(革兰氏阳性)、绿针假单胞菌(ATCC 13985)(革兰氏阳性)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)(ATCC 47072)(革兰氏阳性)和酮戊二酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum)(ATCC 21533)(革兰氏阳性)，因此，本发明的有利之处还在于能在革兰氏阳性菌中诱导天冬酰胺酶I活性。
一旦根据此处所描述的方法进行诱导，已收获的微生物的所需活性(例如腈水合酶、酰胺酶或天冬酰胺酶I活性)能有利地被稳定。用于处理废水的酶的商业用途，以及各种酶的其他商业用途通常受到所诱导的活性的不稳定性的限制。例如，在25℃温度，新鲜细胞通常在24小时内失去其初始活性的至少50％。因此，当将细胞用作催化剂时，所述细胞必须在需要时进行制备而不能被保存以供将来使用。腈水合酶活性可通过加入含腈化合物而稳定；然而，这再次使得必须使用不利的危险化学品。本发明同样解决了这个问题。例如，具有诱导的腈水合酶活性的细胞可根据本发明进行稳定，而无需危险化学品，这使得所述细胞能具有可用的酶活性长达一年的时间。因此，本发明稳定了酶或者能产生这些酶的微生物，使得所诱导活性的实际活性得以延长，大大超过通常的可用活性时间。
在一个实施方式中，通过加入一种或多种含有酰胺基的氨基酸或其衍生物提供如此的稳定。所述含有酰胺基的氨基酸或其衍生物可在培养所述微生物时加入到所述微生物中，或者可加入到包含已诱导酶活性的微生物、细胞或亚单元酶的混合物中。如先前描述的任何含有酰胺基的氨基酸或其衍生物可用于根据本发明的该实施方式使诱导的活性稳定。
在其他实施方式中，根据本发明，通过固定所培养的微生物或源自其的细胞能提供稳定。例如，收获自所述微生物的细胞、收获自所述微生物的酶或者所述经诱导的微生物自身可固定到基质上作为稳定所述经诱导的活性的手段。在某些实施方式中，所述酶、细胞或微生物至少部分地埋在所述基质中。
通常可用于附加细胞、酶或微生物的任何基质都可根据本发明来使用。在一个实施方式中，所述基质包括藻酸(alginate)或其盐。藻酸是具有分别以(1-4)-连接的β-D-甘露糖醛酸(M)和其C-5差向异构体α-L-古洛糖醛酸(G)残基的均聚嵌段的线性共聚物，所述均聚嵌段以不同顺序或嵌段共价地相连在一起。所述单体可出现在连续G残基(G嵌段)、连续M残基(M嵌段)、交替M和G残基(MG嵌段)的均聚嵌段中或者无规嵌段中。在优选实施方式中，藻酸钙用作所述基质。特别优选的是已用聚乙烯亚胺交联形成硬化藻酸钙基质的藻酸钙。该固定技术的进一步描述可在Bucke，C.(1987)，″Cell Immobilization in Calcium Alginate″，Methods in Enzymology，第135卷，B部分(K.Mosbach编辑)第175-189页中找到，在此以参考的方式引入。使用聚乙烯亚胺交联的藻酸钙的固定的稳定作用在图1中进行图示，将在以下实施例2中进一步描述。
在另一实施方式中，所述基质包含含有酰胺基的聚合物。任何包含一个或多个酰胺基团的聚合物可根据本发明而使用。在一个优选实施方式中，所述基质包括聚丙烯酰胺聚合物。使用丙烯酰胺的固定的稳定作用在图2中图示，将在以下实施例3中进一步描述。
根据本发明，通过交联可进一步实现稳定。例如，由经诱导的微生物收获的细胞可化学交联形成细胞凝集体。在一个优选实施方式中，由经诱导的微生物收获的细胞用戊二醛进行交联。例如，细胞能悬浮在去离子水和戊二醛的混合物中，随后加入聚乙烯亚胺直到完成最大絮凝。所述已交联的细胞(通常为许多细胞形成的颗粒形式)可通过简单的过滤进行收获。该技术的进一步描述在Lopez-Gallego，等，″EnzymeStabilization by Glutaraldehyde Crosslinking of Absorbed Proteins on Aminated Supports″，J.Biotechnol.119：70-75中提供，将其在此以参考的方式引入。戊二醛交联的稳定作用在图4中图示，将在以下实施例5中进一步描述。
在另一实施方式中，所述微生物可装入胶囊中或者被固定，而不是被允许保持经典的布朗运动。如此的固定有助于所述微生物的收集、保持和再使用，并且通常包括将所述微生物附加至基质。如上所述，如此的附加也能促进所述微生物的稳定，或者可仅仅有助于方便处理所述经诱导的微生物或酶。
可通过通常认为可用于微生物的固定的任何方法诸如吸附、静电结合和共价结合等固定所述微生物。通常，所述微生物固定在能有助于从混合物或溶液(诸如解毒反应混合物)中回收所述微生物的固体载体上。合适的固体载体包括但不限于颗粒活性炭、混合料、木质残余物产品(例如木片、木材、木块、破碎的垫料或树)、金属或金属氧化物颗粒(例如氧化铝、钌、氧化铁)、离子交换树脂、DEAE纤维素、聚合物、陶瓷珠子、交联聚丙烯酰胺珠子、方块(cube)、金属小球或其他凝胶形式、藻酸盐珠子、κ-角叉菜胶方块，以及由于固有磁性而能从所述水溶液中回收的固体颗粒。所述催化剂的形状是可变的(原因在于所述颗粒体的所需动力学性质与能影响催化剂活性的体积/表面积关系相结合)。在优选实施方式中，受诱导的微生物被固定在已用聚乙烯亚胺交联的藻酸盐珠子上或者固定在聚丙烯酰胺类型的聚合物中。
在具体实施方式中，本发明提供了通过将腈转化为相应酰胺或酸而对腈混合物进行解毒的方法。在一个实施方式中，所述方法包括将腈降解微生物的培养物施加到腈混合物中，并用含有酰胺基的氨基酸的混合物或其衍生物对所述微生物进行足够长时间的多重诱导从而将所述腈转化为相应的酰胺。作为另外一种选择，所述方法包括将多重诱导的微生物施加于腈混合物足够长的时间从而将所述腈转化为相应的酰胺。
当将所述微生物施加于废物流时，所述微生物可以是正在生长(活跃分裂)或静息(非活跃分裂)的。当所述方法要求必须施用生长活跃的微生物的培养物时，所述施用条件优选为支持或维持细菌生长。当所述方法要求必须施用非活跃分裂的微生物的培养物时，所述施用条件优选为支持酶活性。
在具体实施方式中，本发明可用于处理来自于具有废物的生产厂的废物流，所述废物通常含有高浓度的腈、氰醇或其他能进行酶降解的化学品。例如，本发明提供了解毒方法以对来自腈生产厂的水性废物流中的腈化合物的混合物或腈与酰胺化合物的混合物进行解毒。此外，本发明能用于处理丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)生产中的废物流，其中丙烯腈用在所述ABS的生产中。
本发明还提供了能用于对在诸如空气、蒸汽、气溶胶和水或水溶液等流出物中的腈化合物的混合物、腈与酰胺化合物的混合物和酰胺化合物的混合物进行解毒的生物过滤器中。例如，如果存在挥发性腈化合物，可从发现有所述挥发物的固体或水溶液中除去所述挥发物，并且应当进行各步骤以将所述挥发物俘获在生物过滤器中。一旦被俘获，所述挥发物可按照本文所述，利用微生物的纯培养物或提取物进行解毒。
本发明还提供了多种试剂盒，所述试剂盒包含已被多重诱导的微生物的培养物，所述微生物能对腈化合物的混合物、腈与酰胺化合物的混合物或酰胺化合物的混合物进行解毒。所述微生物可以是活跃分裂的微生物或者冻干的微生物，并能直接加入到含有所述腈和/或酰胺化合物的水溶液中。在优选实施方式中，所述试剂盒包含受诱导的冻干样品。所述微生物也可如此处所述固定在固体载体上。其他试剂盒组分可包括，例如，本文所述的用于诱导所述微生物的多种诱导添加物的混合物，以及诸如小瓶、包装组件等其他试剂盒组件，这对于本领域技术人员而言是已知的。
实施例
现在将具体参考多个实施例对本发明进行描述。以下实施例并非旨在限制本发明，而仅是提供示例性实施方式。
实施例1
对腈水合酶和酰胺酶进行诱导
使用多种类型的诱导剂(1000ppm)对在红球菌(Rhodococcus sp.)DAP 96253菌株中的腈水合酶活性和酰胺酶活性的诱导进行了评价。在含有10ppm钴和7.5g/L尿素并添加有丙烯腈、天冬酰胺或谷氨酰胺的YEMEA培养基中培养三份不同的样品。对每份样品中的特异性腈水合酶活性和特异性酰胺酶活性进行评价，结果提供在下表1中，活性以单位/mg cdw(cell dry weight，细胞干重)提供。一单位的腈水合酶活性指在pH 7.0，30℃的温度下每分钟每毫克细胞(干重)将1μmol的丙烯腈转化为其对应的酰胺的能力。一单位的酰胺酶活性指在pH 7.0，30℃的温度下每分钟每毫克细胞(干重)将1μmol的丙烯酰胺转化为其对应的酸的能力。
表1
从表1可以看出，天冬酰胺或谷氨酰胺作为腈水合酶活性的诱导剂的能力超过了丙烯腈诱导该活性的能力。此外，使用谷氨酰胺作为诱导剂使得酰胺酶活性比使用丙烯腈所得的酰胺酶活性高大约37％，而相比于丙烯腈，天冬酰胺提供了约高74％的活性。
实施例2
使用藻酸钙固定来稳定腈水合酶活性
进行测试以对在所述培养基中使用天冬酰胺诱导腈水合酶的细胞的相对稳定性进行评价。使用单独标准培养基或者使用添加了天冬酰胺的标准培养基培养红球菌属(Rhodococcus sp.)DAP 96253菌株。从所述培养物中回收细胞并将其固定在藻酸钙珠子(2～3mm直径)上。为准备所述珠子，制备了25g的4％藻酸钙溶液(在24ml的5mM TRIS-HCl(pH 7.2)中的1g藻酸钙)，将25mg的偏高碘酸钠溶解其中(在25℃搅拌1小时或者直至所有藻酸盐溶解)。将待固定的细胞在50mM TRIS-HCl中悬浮，至50ml的终体积，而在搅拌下将所述细胞溶液加入到所述藻酸盐混合物中。通过将所述混合物通过27G皮下注射用针头挤出到500ml的0.1M CaCl2中形成珠子。将所述珠子在所述CaCl2溶液中固化1小时，并用水进行洗涤。
制备了四份样品用于评价：样品1-与没有用天冬酰胺培养的细胞一起形成珠子，但将天冬酰胺加入到包含所述珠子的混合物中；样品2-与用天冬酰胺培养的细胞一起形成珠子，并将天冬酰胺加入到包含所述珠子的混合物中；样品3-与用天冬酰胺培养的细胞一起形成珠子，并将丙烯腈和乙腈的混合物加入到包含所述珠子的混合物中；和样品4-与用丙烯腈和乙腈培养的细胞一起形成珠子，并将天冬酰胺加入到含有珠子的混合物中。在样品3～4中，丙烯腈和乙腈以各自为500ppm的浓度加入。在样品1～4中的每一份中，天冬酰胺以1000ppm加入。
所固定的细胞保持约150小时的时间，并定期评价剩余的腈水合酶活性。测试结果图示在图1中。为评价经稳定的活性，测试了相当量的细胞，将0时刻的相当量等分试样的全细胞的活性设为100％。将相当量等分试样的催化剂在适宜的温度下进行温育。在恰当的时间，从温育中取出整份等分试样并测定酶活性。对于最初10小时，每2小时对样品进行评价。第10～60小时，每4小时对样品进行评价，随后每12小时对样品进行评价。
如图1所见，诱导细胞在藻酸钙中的固定提供了与使用危险性的含腈化合物实现的稳定水平非常相似的腈水合酶活性的稳定，并且没有缺点(例如，健康和规章问题)。
实施例3
使用聚丙烯酰胺固定来稳定腈水合酶活性
进行测试以对在所述培养基中使用天冬酰胺诱导腈水合酶的细胞的相对稳定性进行评价。使用添加了天冬酰胺的标准培养基来培养红球菌属(Rhodococcus sp.)DAP96253菌株。从所述培养物中回收细胞并固定在交联聚丙烯酰胺方块(2.5mm×2.5mm×1mm)上。制备聚丙烯酰胺溶液，并加入所需加载量的细胞。将所述含有细胞的聚丙烯酰胺交联形成凝胶，并切割为所述的方块。没有向所述聚丙烯酰胺加入其他已知的稳定剂。制备了两份样品以用于进行评价：样品1-具有低细胞负载量的方块(用每40mL的细胞悬浮液中含有1g细胞的悬浮液进行制备)；样品2-具有高细胞负载量的方块(用每40mL的细胞悬浮液中含有4g细胞的悬浮液进行制备)。
所固定的细胞保持约150天的时间，并定期评价剩余的腈水合酶活性。测试结果图示在图2中。为评价经稳定的活性，测试了相当量的细胞，将0时刻的相当量等分试样的全细胞的活性设为100％。将相当量等分试样的催化剂在适宜的温度下进行温育。在恰当的时间，从温育中取出整份等分试样并测定酶活性。对于最初10小时，每2小时对样品进行评价。第10～60小时，每4小时对样品进行评价。从第5天至第40天，每12小时对样品进行评价。从第40天至第576天，平均每10天对样品进行评价。
如图2所见，用聚丙烯酰胺稳定的细胞在诱导后保持活性长达150小时。此外，以低浓度负载的聚丙烯酰胺固定细胞在诱导后约45小时依然表现出初始活性的50％，以高浓度负载的聚丙烯酰胺固定细胞在诱导后约80小时依然表现出初始活性的50％。
实施例4
用藻酸钙或聚丙烯酰胺固定来稳定腈水合酶活性
进行测试以对在所述培养基中使用天冬酰胺诱导腈水合酶的细胞的相对稳定性进行评价。所述测试特别比较了聚丙烯酰胺或藻酸钙中的固定所提供的稳定性。使用添加了天冬酰胺的标准培养基来培养红球菌属(Rhodococcus sp.)DAP 96622菌株以诱导腈水合酶活性。从培养物中回收细胞以用于固定。
通过采用实施例3中描述的方法将所述天冬酰胺诱导细胞固定在聚丙烯酰胺方块(2.5mm×2.5mm×1mm)中从而制备测试样品1。作为比较，用丙烯腈独立诱导的细胞也固定在聚丙烯酰胺方块中以进行评价。
通过采用实施例2中描述的方法将所述天冬酰胺诱导细胞固定在藻酸钙珠子(2～3mm直径)中从而制备测试样品2。作为比较，采用实际含腈废水(称为NSB/WWCB)作为诱导添加物制备一份样品。采用含有存在于丙烯腈制造废物流中占主导的腈和酰胺的合成混合物(也包括硫酸铵并特别地不包括氰化氢)(称为FC w/AMS w/o HCN)作为诱导剂制备第二比较样品。
所固定的细胞保持约576天的时间，并定期评价剩余的腈水合酶活性。测试结果图示在图3中。为评价经稳定的活性，测试了相当量的细胞。将0时刻的相当量等分试样的全细胞的活性设为100％。相当量等分试样的催化剂在适宜的温度下进行温育。在恰当的时间，从温育中取出整份等分试样并测定酶活性。对于最初10小时，每2小时对样品进行评价。第10～60小时，每4小时对样品进行评价。从第5天至第40天，每12小时对样品进行评价。从第40天至第576天，平均每10天对样品进行评价。
实施例5
使用戊二醛固定来稳定腈水合酶活性
进行测试以对在所述培养基中使用天冬酰胺诱导腈水合酶活性的细胞的相对稳定性进行评价。所述测试特别比较了通过戊二醛交联进行固定而提供的稳定性。使用添加了天冬酰胺的标准培养基来单独培养红球菌属(Rhodococcus sp.)DAP 96253菌株和紫红红球菌DAP 96622菌株以诱导腈水合酶活性。从所述培养物中回收细胞并将其如此处所述用戊二醛交联。
所固定的细胞保持约576天的时间，并定期评价剩余的腈水合酶活性。测试结果图示在图4中。为评价经稳定的活性，测试了相当量的细胞。将0时刻的相当量等分试样的全细胞的活性设为100％。相当量等分试样的催化剂在适宜的温度下进行温育。在恰当的时间，从温育中取出整份等分试样并测定酶活性。对于最初10小时，每2小时对样品进行评价。第10～60小时，每4小时对样品进行评价。从第5天至第40天，每12小时对样品进行评价。从第40天至第576天，平均每10天对样品进行评价。
如图4所见，相比于以上描述的其他稳定方法，通过戊二醛交联固定的两个菌株表现出或多或少更小的初始活性。然而，通过戊二醛交联固定的两个菌株表现出优异的长期稳定性，在576天后保持多达约65％的活性。
实施例6
天冬酰胺和谷氨酰胺对产生腈水合酶的微生物的生长的作用
评价了各种产生腈水合酶的微生物的相对生长。所有菌株均在含有7.5g/L的尿素和10ppm钴(以氯化钴提供)并添加有天冬酰胺(ASN)、谷氨酰胺(GLN)或者同时有天冬酰胺和谷氨酰胺的YEMEA培养基上生长。加入3.8mM的天冬酰胺和谷氨酰胺。生长温度在26℃～30℃范围内。通过视觉观察对生长进行评价，并以以下等级进行评级：(-)指没有可检测的生长；(+/-)指几乎没有生长；(+)指很少生长；(++)指良好的生长；(+++)指非常好的生长；而(++++)指优异的生长。结果提供在下表2中。
表2
实施例7
天冬酰胺和谷氨酰胺对腈水合酶和酰胺酶产生的作用
评价了在各种产生腈水合酶的微生物中腈水合酶产生和酰胺酶产生的诱导。所有菌株均在含有7.5g/L的尿素和10ppm钴(以氯化钴提供)并添加有天冬酰胺(ASN)、谷氨酰胺(GLN)或者同时有天冬酰胺和谷氨酰胺的YEMEA培养基上生长。加入3.8mM的天冬酰胺和谷氨酰胺。作为比较，也测试了没有添加物的酶产生。生长温度在26℃～30℃范围内。评价了以每mg细胞干重中的单位计的腈水合酶水平，结果提供在表3中。评价了以每mg细胞干重中的单位计的酰胺酶水平，结果提供在表4中。
表3
表4
实施例8
天冬酰胺和谷氨酰胺对天冬酰胺酶I产生的作用
评价了在各种产生腈水合酶的微生物中天冬酰胺酶I产生的诱导。所有菌株均在含有7.5g/L的尿素和10ppm钴(以氯化钴提供)并添加有天冬酰胺(ASN)、谷氨酰胺(GLN)或者同时有天冬酰胺和谷氨酰胺的YEMEA培养基上生长。加入3.8mM的天冬酰胺和谷氨酰胺。作为比较，评价了添加丙烯腈(AN)、丙烯酰胺(AMD)或丙烯腈和丙烯酰胺的酶产生。生长温度在26℃～30℃范围内。评价了以每mg细胞干重中的单位计的天冬酰胺酶I水平，结果提供在表5中。
表5
实施例9
在红球菌属(Rhodococcus sp.)DAP 96253细胞中天冬酰胺酶I活性的诱导
使用两相培养基(作为20升发酵的接种体来源)培育红球菌属(Rhodococcus sp.)DAP 96253。向改进的R2A培养基(含有取代了示蛋白胨3(PP3)的棉籽水解物)中补充加入培养基/碳水化合物(或者YEMEA、葡萄糖或者麦芽糖)。在时刻t＝10h开始以1000μl/min的连续速率加入天冬酰胺(0.15M溶液)。在发酵过程结束时，产生了每毫克细胞干重中159单位的丙烯腈特异性腈水合酶，每毫克细胞干重中22单位的酰胺酶和16g/l充满细胞的湿重(cell packed wet weight)。产生的各种酶的量提供在表5中。由此处可见，由所述DAP 96253细胞产生了每毫克细胞干重中159单位的腈水合酶、22单位的丙烯酰胺酶和16单位的天冬酰胺酶I。
实施例10
培养基组成对红球菌属(Rhodococcus sp.)DAP 96253细胞中天冬酰胺酶I产生的作用
进行测试以评价根据所使用的诱导剂对天冬酰胺酶I活性的作用。具体而言，采用天冬酰胺、谷氨酰胺、琥珀腈和异戊腈作为诱导剂(每种均以1000ppm加入)进行测试。从表6可以看到，天冬酰胺能诱导24.6单位/mg细胞干重的天冬酰胺酶I活性。谷氨酰胺或琥珀腈也表现出诱导天冬酰胺酶I活性的能力。当向YEMEA中加入麦芽糖时得到更高的天冬酰胺酶I活性。当与葡萄糖或者麦芽糖组合时，在培养基中包括钴(5～50ppm)也能导致提高。
表6
受益于在前文描述中所呈现的教导，本发明所属领域内的技术人员会想到此处所阐述的本发明的许多改进和其他实施方式。因此，应当理解本发明并不局限于所公开的具体实施方式，改进和其他实施方式也意欲包括在所附权利要求的范围内。尽管此处采用了具体的术语，它们也仅是以普遍和描述性的意义进行使用，而并非是为了限制的目的。

Claims (5)

1.一种用于稳定腈水合酶的方法，所述方法包括以有效量的交联剂使能产生所述腈水合酶的微生物与戊二醛交联，从而使得在25℃的温度至少30天的时间以后，活性保持在由所述腈水合酶或所述能产生所述腈水合酶的微生物所表现出来的初始活性的至少50％的水平，其中，所述微生物包括选自由红球菌属DAP 96253菌株和紫红红球菌DAP 96622菌株及其组合的细菌。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括使基质固定所述微生物。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述基质选自由藻酸盐和含有酰胺基的聚合物组成的组。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述含有酰胺基的聚合物包括聚丙烯酰胺。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述交联剂包含戊二醛。
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