ES2217566T3

ES2217566T3 - Uso de asparaginasa de wolinella succionogenes para tratar enfermedades asociadas con la dependencia de asparagina.

Info

Publication number: ES2217566T3
Application number: ES98932727T
Authority: ES
Inventors: Donald L. Durden
Original assignee: Childrens Hospital Los Angeles
Current assignee: Childrens Hospital Los Angeles
Priority date: 1997-06-09
Filing date: 1998-06-09
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2018-06-09
Also published as: EP0988050B1; ATE265226T1; WO1998056410A1; AU752370B2; DE69823501T2; DE69823501D1; EP0988050A1; CA2295980A1; US6251388B1; WO1998056410A9; AU8254498A; US20020102251A1

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento para producir recombinantes de derivados de asparaginasa de la Wolinella succinogenes. Además, la invención se refiere a los procedimientos para modificaciones covalentes de proteínas, incluyendo asparaginasas, mediante acilación. Algunas realizaciones proporcionan el marcado epitópico del término amino de la W. succinogenes asparaginasa. Otras realizaciones se refieren a procedimientos de utilización terapéutica de la nueva forma homotetramérica del W. succinogenes asparaginasa, así como el empleo del recombinante marcado epitópicamente o no epitópicamente marcado de W. succinogenes asparaginasa (o una análogo covalentemente modificado de este) en el tratamiento terapéutico de enfermedades hematológicas malignas y no malignas y otras enfermedades en los que el empobrecimiento o eliminación de la asparagina sería eficaz o que responde a la disminución o desaparición de la asparagina así como a su utilización potencial en el tratamiento terapéuticode enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide, SIDSA y SLE.

Description

Uso de asparaginasa de Wolinella succinogenes para tratar enfermedades asociadas con la dependencia de asparagina.

Solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica prioridad frente a la solicitud de patente provisional de EE.UU. 60/049.085, presentada el 9 de junio de 1997.

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere a asparaginasa de Wolinella succinogenes nativa y acilada recombinante y sus análogos, que poseen una potente actividad in vitro e in vivo frente a enfermedades relacionadas con la dependencia de asparagina y, en particular, a composiciones que comprenden asparaginasa de Wolinella succinogenes nativa y acilada recombinante y su uso en la fabricación de medicamentos para el tratamiento de enfermedades que responden a la depleción de asparagina, incluyendo varias enfermedades hematológicas, autoinmunitarias e infecciosas.

Antecedentes de la invención

Las asparaginasas son enzimas que catalizan la desamidación de L-asparagina (actividad asparaginasa) y L-glutamina (actividad glutaminasa). Véase Cantor, P. S. & Schimmell, M. R., Enzyme Catalysis, 2ª ed., (T. Pettersonn & Y. Tacashi, eds.), Sanders Scientific Press, Nueva York pág. 219-23 (1990). La L-glutamina sirve como donante de amidas en la biosíntesis de las purinas, así como en otras reacciones de transaminación y, por tanto, desempeña un papel en el metabolismo del ADN y de los nucleótidos cíclicos.

La actividad bioquímica in vivo de la asparaginasa se documentó por primera vez en el suero de cobayas en 1922 (véase Clementi, A., La désamidation enzimatique de l'asparagina chez les differentes espèces-animales et la signification physiologique de sa presence dans l'organisme, 19 Arch. Intern. Physiol. 369 (1922)).El posterior descubrimiento de que la asparaginasa aislada de suero de cobaya era el agente activo que inhibía el crecimiento in vivo de ciertos tumores de mamíferos dependientes de asparagina, sin que se produjeran efectos perjudiciales concomitantes sobre el tejido normal (véase Broome, J. D., Evidence that the asparaginase activity of guinea pig serum is responsible for its anti-lymphoma effects, 191 Nature 1114 (1961)) sugería que esta enzima podría utilizarse como agente antineoplásico. Dado que la L-asparagina no es un aminoácido esencial, inicialmente se pensó que la asparaginasa representaba un prototipo único de quimioterapia selectiva en la que el tratamiento podría dirigirse de forma específica y selectiva contra células dependientes de asparagina. Sin embargo, a causa de los bajos niveles de asparaginasa en el suero de cobayas fue necesario desarrollar una fuente más práctica de esta enzima antineoplásica.

Posteriormente, se mostró que la asparaginasa microbiana aislada de Escherichia coli y de Erwinia carotovora actuaba como un potente agente antileucémico (véase Howard, J. B. & Carpenter, F. H., L-asparaginase from Erwinia carotovora: substrate specifity and enzymatic properties, 247 J. Biol. Chem. 1020 (1972); Campbell, H. A., y col., Two asparaginases from Escherichia coli B: their separation, purification and anti-tumor activity, 6 Biochemistry 721 (1967)), y cuando una de estas enzimas se usó en combinación con el agente quimioterapéutico vincristina y el corticosteroide prednisona para el tratamiento de leucemia humana linfoblástica aguda o indiferenciada aguda, se comunicó una tasa de remisión global del 93% (véase Ortega, J. A., y col., L-asparaginase, vincristine and prednisone for the induction of first remission in acute lymphocytic leukemia, 37 Cancer Res. 5353 (1977)).

Mientras que estas asparaginasas poseen una potente actividad antileucémica, el uso clínico de las asparaginasas microbianas mencionadas anteriormente dio como resultado un amplio intervalo de toxicidad para el huésped (por ejemplo, disfunción hepática, renal, esplénica, pancreática y coagulación sanguínea) y una inmunosupresión pronunciada (véase Ohno, R. & Hersh, E. M., Immunosuppressive effects of L-asparaginase, 30 Cancer Res. 1605 (1970)), a diferencia de la asparaginasa aislada del suero de cobaya (véase Cooney, D. A., y col., L-asparaginase and L-asparagine metabolism, 10 Ann. Rev. Pharmacol. 421 (1970)).

El estudio de los efectos del tratamiento con asparaginasa de E. coli sobre la histología del bazo y sobre las poblaciones de linfocitos reveló una reducción marcada del tamaño y la reactividad de los centros germinales esplénicos, que estaba asociado de forma concomitante con una reducción marcada de las células citoplásmicas que contienen inmunoglobulinas (inmunoblastos de células B; véase Distasio, J. A., y col., Alteration in spleen lymphoid populations associated with specific aminoacid depletion during L-asparaginase treatment, 42 Cancer Res. 252 (1982)). Además, el estudio de la subpoblación de linfocitos dentro del bazo reveló que había una reducción del 40% en el porcentaje de células de la superficie que expresan inmunoglobulinas (células B) acompañada de un aumento de la proporción de células que expresan Thy-1.2 (células T), mientras que la proporción entre las células Lit-2 y Lit-1 permaneció invariable en comparación con el grupo de animales control. Estos resultados apoyaban la hipótesis de que la glutamina o la glutamina combinada con la depleción de asparagina que inicialmente resultó de la administración de asparaginasa de E. coli, produjo una disminución marcada de las células linfocíticas del bazo de la línea de células B.

Otro importante efecto clínico adverso asociado con el tratamiento tradicional con asparaginasa microbiana es la disfunción hepática (véase Schein, P. S., y col., The toxicity of E. coli asparaginase, 29 Cancer Res. 426 (1969)). Los pacientes tratados con asparaginasa de E. coli generalmente exhiben menores niveles plasmáticos de albúmina, antitrombina III, colesterol, fosfolípidos y triglicéridos. Entre otros marcadores de disfunción y enfermedad hepáticas inducidas por asparaginasa se incluyen cambios grasos degenerativos, retraso en el aclaramiento de bromosulfoftaleína y aumento de los niveles en suero de la transaminasa oxalacética-glutámica y la fosfatasa alcalina. Aunque algunos investigadores han comunicado que dosis bajas de asparaginasa de E. coli dan como resultado pocas complicaciones hepatotóxicas, sin embargo, algunos marcadores sensibles de función hepática en algunos pacientes en tratamiento con dosis bajas todavía revelan enfermedad hepática significativa, que puede dar lugar a coagulopatía potencialmente letal (véase Crowther, D., Asparaginase and human malignant disease, 229 Nature 168 (1971)).

Los efectos hepatotóxicos de las asparaginasas microbianas pueden ser un resultado de su capacidad para hidrolizar tanto asparagina como glutamina. Una diferencia bioquímica entre las asparaginasas de E. coli y E. carotovora y la enzima derivada de cobayas es la actividad amidohidrolasa inespecífica asociada con las enzimas microbianas (véase Howard, J. B. & Carpenter, F. H., (1972) supra; Campbell, H. A., y col., (1967) supra). Por ejemplo, se ha mostrado que la asparaginasa de E. coli posee un nivel 130 veces mayor de actividad de glutaminasa en comparación con la actividad asparaginasa de Wolinella succinogenes (anteriormente clasificada como Vibrio succinogenes). Como resultado, los pacientes tratados con las asparaginasas microbianas muestran una marcada reducción de los niveles en suero de glutamina y asparagina (véase Schrek, R., y col., Effects of L-glutaminase on transformation and DNA synthesis of normal lymphocytes, 48 Acta Haematol. 12 (1972)), que puede demostrar una posible correlación entre la privación de glutamina y la toxicidad clínica inducida por asparaginasa (véase Spiers, A. D. S., y col., L-glutaminase/L-asparaginase: human pharmacology, toxicology, and activity in acute leukemia, 63 Cancer Treat. Resp. 1019 (1979). Se han evaluado los efectos hepatotóxicos de las diferentes asparaginasas y los resultados respaldan el concepto de que la depleción específica de asparagina no es significativamente hepatotóxica (véase Distasio, J. A., y col., Glutaminase-free asparaginase from Vibrio succionogenes: an antilymphoma enzyme lacking hepatotoxicity, 30 Int. J. Cancer 343 (1982)). En un estudio posterior, se estudiaron los efectos hepatotóxicos del tratamiento prolongado con asparaginasas de E. coli y E. carotovora y las toxicidades observadas se compararon con las de la asparaginasa de W. Succinogenes. Los resultados sugieren que la depleción fisiológica combinada de asparagina y glutamina tras la administración de las asparaginasas de E. coli o de E. carotovora puede dar como resultado una hepatotoxicidad pronunciada, mientras que la asparaginasa de W. Succionogenes no es hepatotóxica, incluso tras el tratamiento prolongado (véase Durden, D. L., y col., Kinetics analysis of hepatotoxicity associated with antineoplastic asparaginases, 43 Cancer Res. 1602 (1983)).

La importancia relativa de L-glutamina en el metabolismo intermedio de mamíferos ha servido para estimular la realización de más investigaciones acerca del posible papel de la privación de glutamina en la inmunosupresión inducida por asparaginasa. Se ha mostrado que el tejido linfoide tiene niveles relativamente bajos de actividad glutamina sintetasa (véase El-Asmar, F. A. & Greenberg, D. H., Studies on the mechanism of inhibition of tumor growth by glutaminase, 26 Cancer Res. 116 (1966); Hersh, E. M., L-glutaminase: suppression of lymphocyte blastogenic responses in vitro, 172 Science 139 (1971)), lo que sugiere que estos tejidos pueden ser particularmente sensibles a la depleción de glutamina exógena. Por el contrario, algunos investigadores han propuesto que la privación de asparagina sola puede ser responsable de la inmunosupresión inducida por asparagina (véase Baechtel, F. S., y col., The influence of glutamine, its decomposition products and glutaminase on the transformation of human lymphocytes, 421 Biochem. Biophys. Acta 33 (1976)).

Aunque el efecto inmunosupresor de las asparaginasas de E. coli y de E. carotovora está bien documentado (véase, Crowther, D., (1971) supra; Schwartz, R. S., Immunosuppression by L-asparaginase, 224 Nature 276 (1969)), las bases biológicas moleculares de estas funciones todavía no se han aclarado. La inhibición de la blastogénesis de los linfocitos por varios antagonistas de L-glutamina (véase Hersh, E. M. & Brown, B. W., Inhibition of immune response by glutamine antagonism: effect of azotomycin on lymphocyte blastogenesis, 31 Cancer Res. 834 (1980))y la glutaminasa de Escherichia coli (véase Hersh, E. M., (1971) supra) tiende a ser ilustrativa de un posible papel de la depleción de glutamina en la inmunosupresión. También se ha demostrado que la inhibición de la respuesta blastogénica linfoide a fitohemaglutinina (PHA) producida por la asparaginasa de E. coli puede invertirse mediante la adición de L-glutamina pero no con la adición de L-asparagina. Véase Simberkoff, M. S. & Thomas, L., Reversal by L-glutamine of the inhibition of lymphocyte mitosis caused by E. coli asparaginase, 133 Proc. Soc. Exp. Biol. (N. Y.) 642 (1970). Además, mediante la observación de que la E. asparaginasa es más eficaz que la asparaginasa de E. coli en la supresión de la respuesta de leucocitos de conejo a PHA (véase Ashworth, L- A. E. & MacLennan, A. P., Comparison of L-asparaginases from Escherichia coli and Erwinia carotovora as immunosuppressant, 34 Cancer Res. 1353 (1974)) se ha sugerido la existencia de una correlación entre la inmunosupresión y la cantidad relativa de la actividad glutaminasa. Sin embargo, la significación de estos estudios in vitro es algo limitada porque los destinos in vivo de las asparaginasas y el control homeostásico de asparagina y glutamina puede dar como resultado una modificación de los efectos inmunosupresores de las asparaginasas antineoplásicas. En un estudio más reciente se investigaron los efectos inmunosupresores de las asparaginasas de E. coli y W. succinogenes sobre la respuesta tumoral de ratones durante la inmunización con hematíes de carnero (HC). Se han obtenido pruebas de la asparaginasa sin glutaminasa de W. succinogenes no suprime la respuesta inmunitaria in vivo de ratones a los HC frente a los pronunciados efectos inmunosupresores observados en ratones tratados con la asparaginasa de E. coli (véase Durden, D. L. y Distasio J.A., Comparison of the immunosuppressive effects of asparaginase from Escherichia coli and Vibrio succinogenes, 40 Cancer Res. 1125 (1980)).

Otro problema significativo asociado con el uso de asparaginasas microbianas es que los pacientes tratados con E. coli y E. carotovora con frecuencia desarrollan anticuerpos neutralizantes de las clases IgG e IgM de inmunoglobulinas (véase, por ejemplo, Cheung, N. & Chau, K., Antibody response to Escherichia coli L-asparaginase: Prognostic significance and clinical utility of antibody measurement, 8 Am. J. Pediatric Hematol. Oncol. 99 (1986); Howard, J. B. & Carpenter F. H. (1972) supra, que permite un rebote inmediato de los niveles de asparagina y glutamina en suero. En un intento de mitigar los efectos tóxicos y la inmunosensibilidad asociada con el uso terapéutico de asparaginasa de E. coli y E. carotovora, inicialmente se desarrolló una asparaginasa de E. coli covalentemente modificada (PEG-asparaginasa) para usar en pacientes que han desarrollado una hipersensibilidad retardada a las preparaciones de asparaginasa "nativa" de E. coli (véase Cao, S. & Zhao, G., Chemical modification of enzyme molecules to improve their characteristics, 613 Ann. NY Acad. Sci. 460 (1990)).Se ha establecido que la asparaginasa de E. coli y de V. succinogenes modificada con polietilenglicol tiene, entre otras propiedades, un aumento de las semividas plasmáticas y, por tanto, un mayor efecto antitumoral en comparación con las enzimas nativas (véase A. Abuchowski y col., Cancer therapy with chemically modified enzymes I. Antitumor properties of polyethylene glycol-asparaginase conjugates, 7 Cancer Biochem. Biophys. 175 (1984)).

Sin embargo, en estudios posteriores se ha establecido que el desarrollo inicial de una respuesta inmunitaria frente a la asparaginasa de E. coli dio como resultado un 80% de reactividad cruzada contra la PEG-asparaginasa, con efectos farmacocinéticos adversos concomitantes, neutralización de la actividad PEG-asparaginasa y normalización de los niveles plasmáticos de L-asparagina y L-glutamina (véase Avramis, V. & Periclou, L., Pharmodynamic studies of PEG-asparaginase (PEG-ASNase) in pediatric ALL leukemia patients, Seventh International Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris, Francia (1997)).

El desarrollo de anticuerpos dirigidos contra la asparaginasa de E. coli (EC) y la PEG-asparaginasa modificada en pacientes está asociado con la neutralización de la actividad enzimática de las asparaginasas de EC y PEG in vivo, por tanto, potencialmente dando como resultado un pronóstico clínico adverso.

En el documento LU 59710A se ha descrito un procedimiento para acilar L-asparaginasas, en particular asparaginasas de origen bacteriano. Se ha observado que las L-asparaginasas aciladas de este modo tienen una mayor semivida y una menor tendencia a coagular.

Es objeto de esta invención resolver los problemas anteriores proporcionando una forma alternativa de asparaginasa terapéuticamente eficaz e inmunológicamente separada, es decir, asparaginasa acilada de W. succinogenes o un análogo del mismo. Tales asparaginasas y su preparación se describen con detalle más adelante y pueden usarse para tratar pacientes que sufren enfermedades que responden a la privación de asparagina como tratamiento de primera línea o, como alternativa, para tratar pacientes que previamente habían desarrollado hipersensibilidad a otras asparaginasas microbianas, por ejemplo la derivada de E. coli, y/o formas modificadas de asparaginasas que no sean de W. succinogenes, por ejemplo asparaginasa pegilada de E. coli o de E. carotovora.

Definición de términos

A menos que expresamente se defina otra cosa, los términos usados en la presente memoria descriptiva se entenderán según su significado habitual en la técnica, aunque se entenderá que los siguientes términos tienen los siguientes significados, a menos que se indique otra cosa.

Un "análogo" de una proteína, por ejemplo asparaginasa, se refiere a un polipéptido que difiere de algún modo de su forma o formas naturales. Por ejemplo, un análogo de asparaginasa se referirá a una enzima en la que se han producido deleciones en uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos natural. Por otro lado, uno o más residuos aminoacídicos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente. Otros análogos incluyen aquellos en los que se han añadido aminoácidos adicionales a la secuencia nativa. Por ejemplo, se pueden añadir uno o más aminoácidos al extremo amino y/o al extremo carboxi de la enzima, o insertarse entre residuos de aminoácidos internos. Tales análogos se pueden preparar mediante cualquier técnica adecuada, aunque normalmente se usará la modificación de un gen recombinante para que codifique el o los cambios deseados. Las enzimas de la presente invención tienen uno o más residuos aminoacídicos derivados, es decir acilados.

Una "secuencia de aminoácidos contigua única" significa una secuencia de aminoácidos que no se encuentre en una proteína o un polipéptido natural. Por tanto, una "secuencia de aminoácidos contigua única de Wolinella succinogenes" se refiere a una secuencia que contiene una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en comparación con la región correspondiente de la enzima nativa.

Una "enfermedad que responde a la depleción de asparagina" se refiere a una afección en la que las células responsables de la enfermedad carecen o tienen una capacidad reducida para sintetizar asparagina. La depleción o privación de asparagina en tales células puede ser parcial o sustancialmente completa, siempre que se alcance el beneficio terapéutico deseado. En ciertas formas de realización, se produce una depleción de más de aproximadamente el 50% de asparagina en suero, preferentemente mayor de aproximadamente el 75%, siendo lo más preferido una depleción de más del 95%. Entre los ejemplos representativos de enfermedades que responden a la depleción o privación de asparagina se incluyen ciertas enfermedades malignas, particularmente enfermedades hematológicas malignas, incluidos linfomas, leucemias y mielomas. Entre los ejemplos concretos de leucemias tratables según la invención se incluyen leucemia linfoblástica aguda (LLA) leucemias no linfoblásticas agudas, leucemias de células B y células T, leucemias crónicas y leucemia indiferenciada aguda. Entre las enfermedades hematológicas no malignas representativas que responden a la depleción de asparagina se incluyen enfermedades de la sangre mediadas por el sistema inmunológico, por ejemplo enfermedades infecciosas tales como las producidas por la infección por VIH (es decir, SIDA). Las enfermedades no hematológicas asociadas con dependencia de asparagina incluyen enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo artritis reumatoide, LES autoinmunitario, enfermedades vasculares del colágeno, SIDA, etc. Otras enfermedades autoinmunitarias incluyen osteoartritis, síndrome de Issac, psoriasis, diabetes mellitus insulinodependiente, esclerosis múltiple, panencefalitis esclerosante, lupus eritematoso sistémico, fiebre reumática, enfermedad intestinal inflamatoria (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa, glomerulonefritis, miastenia gravis, pénfigo vulgar y enfermedad de Graves. A pesar de lo anterior, las células responsables de cualquier enfermedad que responden, por ejemplo detienen su proliferación, se vuelven senescentes, sufren apoptosis y mueren, etc., a la depleción de asparagina pueden tratarse según los presentes procedimientos. Como los expertos en la técnica apreciarán, las células que se piensa que producen enfermedad pueden someterse a pruebas para determinar la dependencia de asparagina en cualquier ensayo in vitro o in vivo, por ejemplo un ensayo in vitro en el medio de crecimiento carece de asparagina.

Un "paciente" se refiere a un animal afectado por una enfermedad que responde a la depleción de asparagina. Normalmente, los pacientes tratados según los presentes procedimientos son mamíferos, por ejemplo, animales bovinos, caninos, equinos, felinos, ovinos, porcinos y primates, particularmente seres humanos.

Un "vector de expresión" se refiere a un ácido nucleico, normalmente un plásmido, en el que se pueden clonar, y posteriormente expresar, genes heterólogos de interés. Para la expresión, tales vectores generalmente se introducen mediante cualquier técnica adecuada. Entre las técnicas preferidas se incluyen transformación, electroporación, transfección e introducción balística (por ejemplo, "disparo génico"). Dependiendo del vector usado, entre las células huésped adecuadas para la expresión del gen o los genes heterólogos deseados se incluyen célula procarióticas y eucarióticas. Las células procarióticas preferidas son células bacterianas competentes para la transformación, tales como cepa de E. coli y DH5\alpha y JM 109. Entre las células huésped eucarióticas preferidas se incluyen líneas de células de mamíferos y levaduras. Como aquellos expertos en la técnica apreciarán, el sistema celular de expresión vector/huésped seleccionado para la expresión del gen heterólogo deseado depende de muchos factores, y se deja al experto en la técnica determinarlos en circunstancias particulares. De igual forma, las condiciones requeridas para la expresión del gen deseado a partir de un vector de expresión que lo lleva depende de muchos factores, incluyendo el tipo de célula huésped, el promotor o promotores y otros elementos de la regulación de la transcripción empleados, los medios (o el medio) usados, etc. De nuevo, la selección realizada en una determinada circunstancia está a discreción del experto en la técnica implicado, y el concreto empleado está fácilmente dentro de las habilidades de tal persona, dada la descripción en la presente memoria descriptiva.

Una proteína que es "biológicamente activa" es una que tiene al menos una de las actividades biológicas de la correspondiente proteína nativa, aunque el grado de la actividad exhibida puede diferir del de la proteína nativa. Por ejemplo, un análogo de W. succinogenes según la invención puede tener una actividad específica mayor, una semivida en suero más larga, etc., que la forma nativa de la proteína.

Una proteína que comprende un "marcador epítopo" se refiere a una que tiene uno o más, preferentemente dos o más, aminoácidos adicionales covalentemente unidos en ella, cuyo marcador tiene un epítopo separado que puede ser reconocido por otra proteína, por ejemplo, un anticuerpo que se une a ese epítopo, preferentemente con una afinidad elevada, una proteasa que actúa dentro o alrededor de la secuencia de aminoácidos específica (por ejemplo, DAPI, catepsina-C) etc. Por ejemplo, como se usa en la presente memoria descriptiva un "marcador de epítopo N terminal" se puede referir a un péptido unido al extremo N de una proteína, en el que el péptido tiene una conformación reconocida por un anticuerpo concreto. Tal péptido y su correspondiente anticuerpo o anticuerpos se pueden usar para purificar con rapidez el polipéptido al cual el péptido está unido mediante técnicas estándar de cromatografía de afinidad. Tales anticuerpos, y cualquier otro usado en la práctica de esta invención (por ejemplo, para dirigirlos hacia vehículos de liberación génica) pueden prepararse usando técnicas ampliamente conocidas en la técnica. Por ejemplo, véase Harlow y Lane en Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. También se pueden incluir marcadores de epítopo en el extremo C de la proteína y en regiones internas en las que la inserción de tal marcador no afecta de forma sustancial y adversa a la actividad biológica o a las propiedades farmacocinéticas de la enzima.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una proteína (por ejemplo, una asparaginasa o un análogo de la misma) significa la cantidad requerida para producir el efecto terapéutico deseado. Por supuesto, la cantidad real requerida depende de muchos factores, tales como la enfermedad que se va a tratar, la progresión de la enfermedad, la edad, el tamaño y el estado físico del paciente, como se comenta con más detalle más adelante.

Con la expresión "alterar una propiedad farmacocinética de una proteína" se quiere decir que una propiedad de un fármaco varía a medida que actúa en el organismo en un periodo de tiempo, por ejemplo, semivida en suero, tasa de aclaramiento, biodistribución, inmunogenicidad, etc. Tal alteración puede ser un aumento o una disminución de la propiedad que se está investigando.

Resumen de la invención

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende asparaginasa acilada de Wolinella succinogenes y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La asparaginasa acilada recombinante y nativa de W. succinogenes se puede purificar y formular en una composición farmacéutica. La purificación se puede llevar a cabo mediante cualquier procedimiento adecuado. Tales procedimientos normalmente implican procedimientos de purificación por afinidad y/o técnicas de separación por tamaño. Tras la purificación, el polipéptido acilado se puede formular en una composición farmacéutica que comprende la enzima y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones según la invención pueden administrarse a un paciente de forma tal que libere una cantidad terapéuticamente eficaz de la enzima. En ciertas formas de realización, tales composiciones permiten la liberación oral, mientras que otras formas de realización permiten la liberación transdérmica o transmucosa. Entre las formas de realización preferidas se incluyen aquellas pretendidas para inyección parenteral, por ejemplo, por vía intramuscular, intravenosa o subcutánea.

La invención se refiere a asparaginasa de W. succinogenes (derivada de una fuente natural o recombinante) y análogos de la misma, y a procedimientos para producirla, que se ha modificado covalentemente para incluir una fracción química acilo que no se encuentra en la enzima natural.

Las formas recombinantes de asparaginasa de W. succinogenes puede prepararse como se ha descrito anteriormente, aunque cuando se usa una forma no análoga para derivar, el ácido nucleico que codifica la proteína codificará una forma madura de la enzima nativa.

La invención se refiere a una modificación covalente, es decir acilación de formas nativas y/o recombinantes de asparaginasa de W. succinogenes. Ciertas formas de realización de este aspecto se refieren a una o más modificaciones covalentes para facilitar el aislamiento/purificación de formas recombinantes de la enzima. Otras formas de realización tratan de modificaciones covalentes que alteran la especificidad del sustrato, la inmunorreactividad, la biodistribución, la semivida en suero, etc.

Otro aspecto de la presente invención está dirigido al uso terapéutico de formas nativas y/o recombinantes de asparaginasa acilada de W. succinogenes en la fabricación de medicamentos para el tratamiento de enfermedades que responden a la depleción de asparagina, incluyendo ciertas neoplasias (por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA) y leucemia indiferenciada aguda), así como en el tratamiento de varias enfermedades hematológicas no malignas y autoinmunitarias que responden a la depleción de asparagina. Entre las enfermedades malignas representativas que pueden tratarse de este modo usando composiciones farmacéuticas de la presente invención se incluyen ciertas enfermedades hematológicas, por ejemplo, linfomas, leucemias y mielomas, incluyendo las fases crónicas y agudas. Entre las enfermedades no malignas representativas que pueden tratarse de acuerdo con la presente invención se incluyen enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo, artritis (por ejemplo artritis reumatoide), LES y SIDA. Normalmente, las composiciones se aplicarán a seres humanos afectados por una enfermedad que responde a la depleción de asparagina, aunque otras clases de pacientes, particularmente mamíferos (por ejemplo, animales bovinos, caninos, equinos, felinos, ovinos, porcinos y primates que sufren una enfermedad que responde a la depleción de asparagina se pueden tratar de igual forma.

Para la expresión de asparaginasa de W. succinogenes y análogos de la misma se prefieren los sistemas de producción microbianos, en particular sistemas de células bacterianas, levaduras y de mamíferos. Otro aspecto se refiere a procedimientos de derivación de polipéptidos usando acilación. Las formas de realización preferidas de este aspecto se refieren a la acilación de asparaginasas purificadas, particularmente asparaginasas de W. succinogenes (derivados de fuentes naturales y recombinantes) y análogos de las mismas. Se han descrito procedimientos para alterar una propiedad farmacocinética de una proteína (por ejemplo, asparaginasa, en particular asparaginasa de W. succinogenes o un análogo de la misma) mediante la acilación de la proteína.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de los siguientes figuras, descripción detallada, ejemplos y reivindicaciones.

Descripción de las figuras

La presente invención puede entenderse mejor y sus ventajas apreciarse por aquellos expertos en la técnica relevante haciendo referencia a las figuras adjuntas, en las que:

Figura 1: Ilustra las secuencias de nucleótidos de los cebadores de PCR directos [SEC ID Nº 1] e inversos [SEC ID Nº 2] usados en la amplificación de las secuencias genómicas de L-asparaginasa de W. succinogenes.

Figura 2: Electroforesis en gel de agarosa de ADN genómico de W. succinogenes marcado con yoduro de propidio (carriles 1 y 2) y un fragmento de ADN de 1,0 kb derivado de la amplificación por PCR. Los carriles 3 y 4 son los marcadores de peso molecular del ADN. El carril 5 es el fragmento de PCR específico de W. succinogenes de 1,0 kb amplificado usando los dos cebadores de PCR que se muestran en la figura 1. El carril 6 contiene un marcador de peso molecular de ADN \PhiX174.

Figura 3: Análisis por enzimas de restricción de 4 colonias que se aislaron tras la inserción del fragmento de PCR de 1,0 kb específico de W. succionogenes en el vector PCR II. El ADN de 1,0 kb se digirió con BamHI (carriles 2-5); EcoRI (carriles 6-9) y BamHI y EcoRI (carriles 10-13). El carril 14 representa una escalera de pesos moleculares de ADN. El fragmento de ADN de 1,0 kb específico de W. succinogenes se representa con una flecha.

Figura 4: Electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos de ADN amplificados de los clones "positivos" seleccionados usando cebadores específicos de asparaginasa de W. succinogenes. Los carriles 1 y 7 son marcadores de peso molecular. Los carriles 2 y 4 representan ADN extraído de las colonias bacterianas nº 1 y nº 3 de los carriles 2 y 4 de la Figura 3. El carril 6 representa una muestra del producto de la amplificación por PCR de las asparaginasa de W. succinogenes (amplificado a partir del ADN genómico de W. succinogenes de la Figura 2, carril 5) usado en la reacción de ligación inicial. Debe observarse que se ha mostrado que el fragmento clonado en el vector PCR II es de exactamente el mismo tamaño (es decir, 1,0 b) que el producto de amplificación de PCR inicial.

Figura 5: Ilustra los resultados de una determinación de la actividad antitumoral de las asparaginasas de W. succinogenes (WS), E. coli (EC) y E. carotovora (Erw) frente a tumores generados por la inyección subcutánea de 6C3HED células Gardner de linfosarcoma en ratones C3H. La actividad antitumoral se midió como una función del volumen del tumor medido con compás (cm^{3}). El control negativo consistió en inyecciones de tampón fosfato 0,01 M (pH 7,0= en ratones C3H usando el mismo programa de inyección que para las asparaginasas.

Figura 6: Ilustra la secuencia de ADN [SEC ID Nº 3] del inserto de ADN modificado específico de la asparaginasa de W. succinogenes. Esta secuencia contiene, no sólo la secuencia codificadora de la asparaginasa de W. succinogenes nativa (comenzando con el codón 40 de la figura 6 y no incluyendo los 23 últimos nucleótidos del extremo 3' de la figura 6), sino también 39 codones del "marcador" del epítopo en el extremo N que se muestra en la figura 6.

Figura 7: Es una representación esquemática de una modificación química para una proteína, por ejemplo, asparaginasa de W. succinogenes.

Figura 8: Ilustra la ausencia de reactividad cruzada entre diferentes diluciones del plasma de un paciente del que se sabe que contiene títulos elevados de anticuerpos neutralizantes frente a la asparaginasa de E. coli y la enzima de W. succinogenes.

Figura 9: Ilustra la ausencia de reactividad cruzada entre diferentes diluciones de títulos elevados de anticuerpos neutralizantes policlonales frente a la asparaginasa de E. coli y la asparaginasa derivada de W. succinogenes.

Descripción detallada de la invención

Esta invención se basa en el descubrimiento de que la asparaginasa acilada de W. succinogenes se puede usar como una forma alternativa de tratamiento con asparaginasa en pacientes con enfermedades que responden a la depleción de asparagina, en particular aquellos que se han sensibilizado a otras enzimas microbianas por un tratamiento previo. Además, si es necesario, es muy probable que los pacientes tratados inicialmente con asparaginasa de W. succinogenes que posteriormente desarrollan hipersensibilidad a esta enzima sean capaces de recibir un análogo inmunológicamente distinto de la asparaginasa de W. succinogenes.

Como se ha comentado anteriormente, se ha mostrado que el uso clínico de las asparaginasas aisladas de E. coli, E. carotovora y asparaginasa de E. coli modificada con PEG en el tratamiento de la leucemia da como resultado un amplio intervalo de toxicidad para el huésped (por ejemplo, disfunción hepática, renal, esplénica, pancreática y coagulación sanguínea), inmunosupresión pronunciada y que da lugar a una reacción inmunológica de tipo alérgica con la formación simultánea de anticuerpos neutralizantes, todo lo cual sirve para reducir de forma marcada la eficacia terapéutica de estas asparaginasas microbianas mencionadas anteriormente.

Por tanto, la asparaginasa acilada de W. succinogenes, particularmente la asparaginasa acilada recombinante de W. succinogenes o un análogo de las misma, proporcionará a los pacientes una asparaginasa alternativa inmunológicamente distinta, y permitirá a la mayoría de los pacientes completar todo el curso del tratamiento con asparaginasa, que es de suma importancia para la posible "cura" de su enfermedad, por ejemplo, leucemia. Además, los datos experimentales proporcionados en la presente memoria descriptiva establece que la forma recombinante de la asparaginasa de W. succinogenes exhibe propiedades bioquímicas, farmacológicas e inmunológicas sustancialmente similares, y quizá idénticas, a las de la forma homotetramérica nativa de la enzima.

Ventajas de la presente invención

Como se ha comentado previamente, a pesar de su utilidad terapéutica, el tratamiento con asparaginasa microbiana usando asparaginasas de E. coli, E. coli modificada con PEG o de E. carotovora tiene numerosas limitaciones clínicas distintas, incluyendo: (1) toxicidad hepática, renal, pancreática, del SNC y de la coagulación sanguínea; (2) la causa de una marcada inmunosupresión; y (3) provocan una reacción alérgica y la producción de anticuerpos neutralizantes de asparaginasa. Por el contrario, en el tratamiento con asparaginasa acilada de W. succinogenes estas limitaciones están muy atenuadas o no existen, lo que convierte a esta enzima en altamente eficaz en, por ejemplo, el tratamiento de enfermedades hematológicas malignas y otros trastornos asociados con dependencia de asparagina.

En la presente memoria descriptiva se describen metodologías para aislar la asparaginasa homotetramérica "nativa" de W. succinogenes que posee potentes actividades antineoplásicas y para la producción (usando vectores de expresión recombinantes) de rWS y sus análogos, es decir, aquellas que se han acilado y aquellas que se han modificado para que incluyan aminoácidos adicionales o alternativos que se han acilado. En ciertas formas de realización preferidas, la enzima rWS es una forma recombinante de la asparagina homotetramérica nativa de W. succinogenes (anteriormente V. succinogenes; véase Durden, D. L., A glutaminase-free asparaginase from Vibrio succinogenes lacking immunosuppression and toxicity, Ph. D. Dissertation, University of Miami Medical School (1983); Durden, D. L. & Distasio, J. A., Characterization of the effects of asparaginase from E. coli and a asparaginase from Vibrio succinogenes, 40 Cancer Res. 1125 (1980)).

La secuencia de nucleótidos que codifica el gen de W. succinogenes se determinó en 1995, además de varios cientos de bases de las regiones adyacentes 5' y 3' (véase número de acceso GenBank X89215). También se han descrito la secuencia de aminoácidos y la estructura tridimensional de la enzima. Véase Lubkowski, y col., Eur. J. Biochem., vol. 241: 201-207 (1996).

Como se ha comentado anteriormente, se ha mostrado que la asparaginasa de W. succinogenes es inmunológicamente distinta de la enzima de E. coli (véase Distasio, J. A. & Niederman, T. (1976), supra). Además, los resultados previos han establecido que la asparaginasa de W. succinogenes no suprime la respuesta inmunológica humoral o mediada por células al antígeno dependiente de células T, HC, incluso cuando se administra a dosis 5 veces mayores que los niveles de la enzima de E. coli que son capaces de anular estas respuestas (véase Durden. D. L. & Distasio, J. A., Characterization of the effects of asparaginases from Escherichia coli and a asparaginase from Vibrio succinogenes on specific cell-mediated cytotoxicity, 27 Int. J. Cancer 59 (1981); Durden, D. L. & Distasio, J. A. (1980), supra).

Las siguientes secciones elaboran algunos de los diversos efectos bioquímicos y fisiológicos del uso clínico de la terapia con asparaginasa en el tratamiento de enfermedades malignas asociadas con dependencia de asparagina, en particular, enfermedad hematológica.

I. Efectos del tratamiento con asparaginasa sobre la histología del bazo y del timo y la población de linfocitos

El estudio de los efectos del tratamiento con asparaginasa de E. coli sobre la histología del bazo y las poblaciones de linfocitos ha mostrado que causa una reducción marcada del tamaño y la reactividad de los centros germinales esplénicos, cuyos cambios se asocian de forma concomitante con una marcada reducción de las células que contienen inmunoglobulinas citoplásmicas (inmunoblastos de células B; véase Distasio, J. A., y col. (1982), supra). Además, se sabe que las subpoblaciones linfocitarias en el bazo muestran una reducción de hasta un 40% del porcentaje de células que expresan inmunoglobulinas en la superficie (células B) acompañado con un aumento de la proporción de células que expresan Thy-1.2 (células T), mientras que la proporción de Lyt-2 y Lyt-1 permanece invariable. Por el contrario, la privación de asparagina sola, causada por la administración de asparaginasa de W. succinogenes, no tiene ningún efecto demostrable sobre la histología del bazo o la distribución del marcador linfocitario.

De igual modo, el examen histológico del timo tras la administración de asparaginasa de E. coli reveló una depleción pronunciada de timocitos corticales, mientras que no se observaron cambios en la histología o celularidad del timo tras la administración de asparaginasa de W. succinogenes. Por tanto, una comparación de los efectos de la administración a largo plazo sobre la histología, celularidad y peso del bazo y del timo indicó que el tratamiento con asparaginasa de E. coli estaba asociado con una reducción marcada y sostenida de estos parámetros en el bazo y en el timo.

II. Toxicidad hepática asociada con la administración de asparaginasa

La hepatotoxicidad es la principal toxicidad clínica asociada con la administración terapéutica de las asparaginasas de E. coli y de E. carotovora (véase Broome, J. D., Factors which may influence the effectiveness of L-asparaginase as tumor inhibitors, 22 Br. J. Cancer. 595 (1969)).Los efectos hepatotóxicos de estas dos enzimas microbianas se comparó con los asociados con la administración de asparaginasa de W. succinogenes (véase Durden, D. L. y col. Kinetic analysis of hepatotoxicity associated with anti-neoplastic asparaginases, 43 Cancer Res. 1602 (1983); Distasio, J. A., y col., Glutaminase-free asparaginase from Vibrio succinogenes: an anti-lymphoma enzyme lacking hepatotoxicity, 30 Int. J. Cancer 343 (1982)).

La administración de 50 UI de asparaginasa de E. coli a ratones Balb/c durante 4 días dio como resultado una infiltración difusa de micrograsa en los hepatocitos en todo el hígado. Por el contrario, el estudio microscópico de secciones transversales de ratones Balb/c tratados con asparaginasa de W. succinogenes mostró una histología hepática idéntica a la que presentó el grupo de animales control. La cuantificación de la cantidad total de lípidos extraíbles del hígado de ratones Balb/c tratados con asparaginasa de E. coli indicó un aumento del 45% y del 127% de la concentración de lípidos, en comparación con el grupo de animales control tras 4 y 5 días de tratamiento, respectivamente. La administración de asparaginasa de W. succinogenes no produjo ningún cambio cuantitativo en la cantidad total de lípidos hepáticos extraíbles en comparación con el grupo de animales control. Además, se mostró que la concentración plasmática de albúmina, triglicéridos y colesterol, así como la actividad de antitrombina III disminuyeron en ratones Balb/c como resultado de la administración de asparaginasa de E. coli, lo que confirma la hepatotoxicidad. Se encontró que los niveles plasmáticos de antitrombina III no variaban al administrar asparaginasa de W. succinogenes y, mientras que se encontró que las concentraciones plasmáticas de lípidos disminuían mínimamente, sólo los niveles de colesterol se vieron alterados de forma estadísticamente significativa en comparación con los niveles exhibidos por los animales control.

Además, los efectos hepatotóxicos observados de la administración a largo plazo de asparaginasas de E. coli y de E. carotovora se compararon con los de la asparaginasa de W. succinogenes. Los resultados obtenidos del modelo murino Balb/c demostraron que la hepatotoxicidad asociada con la administración de asparaginasa de E. coli era paralela a la hepatotoxicidad observada en seres humanos, con un aumento rápido de los niveles totales de lípidos hepáticos extraíbles y una disminución concomitante de los niveles plasmáticos de albúmina, triglicéridos y colesterol, así cono la actividad de antitrombina III en la primera y segunda semanas de tratamiento, seguido por la vuelta a la función hepática normal durante las semanas 3 y 4. La administración de asparaginasa de E. carotovora se asoció con un nivel intermedio de hepatotoxicidad, con un aumento de la concentración de lípidos totales hepáticos extraíbles que se produce durante la segunda y la cuarta semana de tratamiento. Por el contrario, no se encontró una asociación entre el tratamiento prolongado de ratones Balb/c con asparaginasa de W. succinogenes y ninguna hepatotoxicidad demostrable. Estos resultados procedentes de la administración a largo plazo sugieren que la hepatotoxicidad observada puede ser un resultado directo de la depleción fisiológica combinada de asparagina y glutamina.

III. Actividad antineoplásica asociada con la administración de asparaginasa

Se determinó la actividad antineoplásica relativa (antilinfoma) de las asparaginasas nativas homotetraméricas de E. coli, E. carovotora y W. succinogenes frente a linfosarcoma de Gardner 6C3HED, que se habían implantado previamente en ratones C3H. Los resultados de este estudio se ilustran en la figura 5.Todos los animales del grupo control que sólo reciben tampón fosfato 0,01M murieron en los 20 días posteriores a la implantación inicial del tumor.

La administración de asparaginasa de E. coli o de W. succinogenes dio como resultado una remisión completa del linfosarcoma en el 100% de los animales. Los animales se sometieron a análisis durante 60 a 90 días tras la implantación inicial del tumor sin que se observaran signos de tumor. De igual forma, se demostró que los animales seguidos por periodos de tiempo más largos tenían una longevidad normal sin recurrencias del tumor. Sin embargo, como se ha comentado anteriormente, el uso de asparaginasa de E. coli está asociado con toxicidad e inmunosupresión que limita de forma marcada su capacidad para usarse en el tratamiento de la enfermedad neoplásica.

La administración de asparaginasa de E. carotovora dio como resultado una regresión inicial, seguida por una fase de proliferación rápida del tumor. Todos los animales murieron (mortalidad del 100%) a causa del desarrollo del linfosarcoma en los 30 días posteriores a la implantación tumoral. Usando el tumor linfosarcoma P1798 en ratones Balb/c se obtuvieron resultados similares.

IV. Reactividad cruzada inmunitaria de las asparaginasas

Como se ha comentado anteriormente, los pacientes tratados con asparaginasas de E. coli y de E. carotovora con frecuencia desarrollan reacciones inmunológicas de hipersensibilidad de tipo retardado con la producción concomitante de anticuerpos neutralizantes dirigidos frente a la enzima asparaginasa específica. Además, con el uso de asparaginasa de E. coli en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda (LLA) de la infancia, este fenómeno mencionado ha dado lugar a una pérdida de la eficacia del fármaco/ enzima y, en algunos casos, a una recurrencia de la leucemia. Esta inmunorreactividad ha llevado a buscar procedimientos para disminuir la inmunogenicidad de las asparaginasas y para desarrollar otras formas sin reactividad cruzada de esta enzima, para su uso clínico.

Se ha demostrado en estudios que la forma homotetramérica nativa de asparaginasa de W. succinogenes no presenta reacciones cruzadas inmunológicas con las asparaginasas de E. coli (EC) o de E. carotovora (Erw)(véase Distasio, J. & Niedennan, A., Purification and characterization of L-asparaginasa with anti-lynphoma activity from Vibrio succinogenes, 251 J. Biol. Chem. 6929 (1976). En la presente memoria descriptiva, se describen experimentos para evaluar la reactividad cruzada inmunológica de las formas nativas homotetramérica (WS) y formas recombinantes (rWS) de asparaginasa de W. succinogenes usando el suero o el plasma de los pacientes de los que se sabe que tienen anticuerpos neutralizantes frente a las asparaginasas de EC o de Erw. Además, se ha valorado la capacidad del suero o plasma de los pacientes (que antes se había demostrado que eran alérgicos a la asparaginasa EC) parra que sufran reacciones cruzadas con EC, Erw, WS y rWS, usando un sistema de ensayo de inmunodifusión doble. En estudios reciente se sugiere que la detección subclínica de anticuerpos antiasparaginasa EC en pacientes tratados con enzima derivada de EC está asociada con una pérdida de eficacia de las asparaginasas EC y PEG in vivo (véase Avramis, V. & Periclou, I (1997), supra).

Los resultados experimentales descritos en la presente memoria descriptiva demuestras que es muy probable que los anticuerpos fabricados en respuesta a la xenoinmunización en seres humanos y conejos frente a asparaginasas de EC y Erw no sufran reacciones cruzadas con la asparaginasa de WS o de rWS, ni neutralizarán la actividad enzimática de cualquier forma de la enzima in vivo o in vitro. De igual modo, estos resultados también sirven para establecer que los anticuerpos dirigidos contra la asparaginasa de EC o PEG en seres humanos no sufrirá reacciones cruzadas o neutralizará la asparaginasa de WS o de rWS. En conjunto, estos datos han sido útiles para desarrollar los fundamentos para una aplicación clínica eficaz de la asparaginasa de WS o de rWS (o análogos de la misma) en pacientes que han desarrollado previamente una hipersensibilidad con base inmunológica a las asparaginasas de EC y/o PEG.

Además, debido a las actividades inmunosupresoras intrínsecas y antimetabólicas, la asparaginasa acilada de WS y/o de rWS de la invención (o sus análogos) también se pueden usar en el tratamiento terapéutico de varias enfermedades autoinmunitarias tal como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, SIDA, etc. Aunque la asparaginasa de WS tiene menos actividad inmunosupresora que la asparaginasa de EC, el nivel inferior de la toxicidad asociada para el huésped la convierte en ideal para uso clínico en enfermedades no malignas que responden a la depleción de asparagina.

Modificación covalente de asparaginasas y otras proteínas

Muchas de las proteínas que se usan en la actualidad para tratar enfermedades humanas tienen semividas en la circulación extremadamente cortas que limitan su eficacia. Además, la administración de muchas proteínas extrañas (incluyendo ciertas proteínas recombinantes) está asociada con respuestas de hipersensibilidad alérgica, que también puede conducir a la producción de anticuerpos neutralizantes que aceleran la rápida eliminación del plasma de estas proteínas terapéuticas. Para superar estos y otros problemas, se usa un procedimiento de modificación covalente para acilar la asparaginasa de W. succinogenes, con el fin de extender su semivida, reducir su inmunogenicidad y aumentar su eficacia. Este régimen de modificación química implica la alteración sistemática de la estructura proteica mediante la conjugación de una cadena de hidrocarburo alifático (saturado, parcialmente saturado, o insaturado, una cadena lineal, una cadena ramificada y/o una cadena aromática) de un agente acilante con grupos polares dentro de la estructura proteica (véase la figura 7). Más adelante se describen las condiciones para modificar covalentemente la asparaginasa de E. coli y de W. succinogenes usando un cloruro ácido.

Composiciones, formulación y administración

Como se ha descrito anteriormente, la asparaginasa acilada de W. succinogenes (y sus análogos) se puede usar para tratar las enfermedades que responden a la depleción de asparagina. Asimismo, se puede usar para tratar tales enfermedades profilácticamente o para tratar a los pacientes previamente diagnosticados y tratados para tal enfermedad. Por ejemplo, un paciente con un diagnóstico previo y tratado con éxito de leucemia, o cuya enfermedad está en remisión, puede sufrir recaídas. Tales pacientes también pueden tratarse con un medicamento según la invención.

La asparaginasa acilada de W. succinogenes, y sus análogos biológicamente activos, puede administrarse a un paciente usando técnicas estándar. Por lo general, las técnicas y formulaciones pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990.

Las formas de dosificación adecuadas dependen, en parte, del uso o de la vía de entrada, por ejemplo oral, transdérmica, transmucosa o mediante inyección (parenteral). Tales formas de dosificación deberían permitir al agente terapéutico alcanzar una célula blanco o, de otro modo, tener el efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, preferentemente, las composiciones farmacéuticas inyectadas en la circulación sanguínea son solubles.

Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden formularse en forma de sales farmacéuticamente aceptables y complejos de las mismas. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales inocuas presentes en las cantidades y concentraciones a las que se administran. La preparación de tales sales puede facilitar el uso farmacéutico mediante la alteración las características físicas del compuesto sin impedirle ejercer su efecto fisiológico. Entre las alteraciones útiles de las propiedades físicas se incluyen la reducción del punto de fusión para facilitar la administración transmucosa y el aumento de la solubilidad para facilitar la administración de concentraciones más elevadas del fármaco. La sal farmacéuticamente aceptable de una asparaginasa puede presentarse como un complejo, como apreciarán los expertos en la técnica.

Entre las sales farmacéuticamente aceptables se incluyen sales de adición de ácido tales como las que contienen sulfato, clorhidrato, fumarato, maleato, fosfato, sulfamato, acetato, citrato, lactato, tartrato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato, ciclohexilsulfamato y quinato. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden obtenerse a partir de ácidos, incluyendo ácido clorhídrico, ácido maleico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido sulfámico, ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido malónico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido ciclohexilsulfámico, ácido fumárico y ácido quínico.

Entre las sales farmacéuticamente aceptables también se incluyen sales de adición de bases tales como las que contienen benzatina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina, procaína, aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio, amoniaco, alquilamina y zinc, cuando están presentes grupos funcionales ácidos, tales como ácido carboxílico o fenol. Por ejemplo, véase Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Tales sales pueden prepararse usando las bases adecuadas correspondientes.

En la composición farmacéutica según la invención también pueden incorporarse vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables para facilitar la administración de la asparaginasa concreta. Ejemplos de vehículos adecuados para usar en la práctica de la invención incluyen carbonato cálcico, fosfato cálcico, varios azúcares tales como lactosa, glucosa o sacarosa, o tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, polietilenglicoles y disolventes fisiológicamente compatibles. Ejemplos de disolventes fisiológicamente compatibles incluyen soluciones estériles de agua para inyectar (API), solución salina y dextrosa.

Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden administrarse por diferentes vías, incluyendo la administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, oral, tópica (transdérmica) o transmucosa. Para la administración sistémica, se prefiere la administración oral. Para la administración oral, por ejemplo, los compuestos pueden formularse en formas de dosificación oral convencionales, tales como cápsulas, comprimidos y preparaciones líquidas como jarabes, elixires y gotas concentradas.

Por otro lado, se puede usar la inyección (administración parenteral), por ejemplo inyección intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para la inyección, las composiciones farmacéuticas se formulan en soluciones líquidas, preferentemente en tampones o soluciones fisiológicamente compatibles tales como solución salina, solución de Hank o solución de Ringer. Además, los compuestos pueden formularse en forma sólida y volverse a disolver o suspender justo antes de su uso. Por ejemplo, se pueden producir formas liofilizadas de la asparaginasa.

Asimismo, la administración sistémica se puede conseguir por medios transmucoso o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se usan penetrantes adecuados para permeabilizar la barrera. Tales penetrantes se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, sales biliares y derivados de ácido fusídico. Además, se pueden usar detergentes para facilitar la permeación. Por ejemplo, la administración transmucosa puede realizarse mediante pulverizadores nasales, inhaladores (para liberación pulmonar), supositorios rectales o supositorios vaginales. Para la administración tópica, los compuestos pueden formularse en ungüentos, pomadas, geles o cremas, como se conoce bien en la técnica.

Las cantidades del agente terapéutico activo que se va a administrar dependerá de muchos factores, incluyendo el agente terapéutico concreto, por ejemplo, asparaginasa acilada de W. succinogenes, las CI_{50} y CE_{50} del agente, la semivida biológica del compuesto, la edad, el tamaño, el peso y el estado físico del paciente, y la enfermedad o trastorno que se va a tratar. La importancia de estos y otros factores que se deben considerar es bien conocida para los expertos habituales en la técnica. Generalmente, la cantidad de asparaginasa que se va a administrar variará de aproximadamente 10 unidades internacionales por metro cuadrado de superficie del cuerpo del paciente (UI/m^{2}) a 50.000 UI/m^{2}, prefiriéndose un intervalo de dosificación de aproximadamente 1.000 UI/m^{2} a aproximadamente 15.000 UI/m^{2} y, prefiriéndose particularmente un intervalo de aproximadamente 6.000 UI/m^{2} a aproximadamente 10.000 UI/m^{2}, para tratar una enfermedad hematológica maligna, por ejemplo leucemia. Normalmente, estas dosis se administran mediante inyección intramuscular o intravenosa tres veces a la semana, por ejemplo lunes, miércoles y viernes, durante el curso del tratamiento. Por supuesto, pueden usarse otras dosis y/o regímenes de tratamiento, según determine el médico que está tratando al paciente.

Metodologías experimentales y resultados Cultivo in vitro de W. succinogenes

Se cultivó W. succinogenes en 10-15 litros de medio de cultivo líquido con un 0,4% de extracto de levadura, formiato amónico 100 mM y fumarato sódico 120 mM. El medio se ajustó a un pH de 7,2 antes de introducir en la autoclave. Tras la esterilización en la autoclave, al medio de cultivo a temperatura ambiente se añadió una solución de tioglicolato esterilizada con filtro de 0,2 \mum, dando una concentración final de 0,05%. Los cultivos se incubaron en agitación continua en una plataforma de agitación en una habitación a una temperatura de 37ºC. Para los cultivos a gran escala, se usó un precultivo de 500 ml para inocular 10-15 litros de medio de cultivo completo.

Las bacterias se recogieron después de que los cultivos habían alcanzado una densidad óptica de aproximadamente 1,1 a 650 nm de longitud de onda, mediante centrifugación usando un rotor de flujo continuo de alta velocidad Sorvall. Tras la centrifugación, las células se lavaron en tampón con cloruro sódico 0,15M, cloruro magnésico 0,1M y mercaptoetanol 0,01M. Después, las células se resuspendieron en tampón borato 0,1M (pH 9,0) a una concentración final de 0,5 g de peso celular húmedo/ml de tampón borato y se almacenaron congeladas hasta el posterior procesamiento para la purificación enzimática.

Animales y líneas celulares

Los modelos animales murinos usados en estos experimentos fueron ratones Balb/C o C3H de 9 a 12 semanas de edad (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).

La actividad terapéutica de las L-asparaginasas se determinó usando las líneas celulares (ATCC)de linfosarcoma de Gardner 6C3HED (Gardner, W. U., Cancer Res., vol. 4: 73 (1944)) y de linfosarcoma P 1798, como tumores ascíticos en ratones C3H y Balb/cc, respectivamente. Por otro lado, las dos líneas celulares de linfosarcoma se cultivaron en medio RPMI 1640 complementado con 10% de suero bovino fetal. El linfosarcoma de Gardner 6C3HED se originó en el timo de ratones C3H a los que se había administrado inicialmente dosis elevadas de estradiol. Posteriormente, se perpetuó el linfosarcoma mediante transplante seriado en los ratones C3H.

Aislamiento del ADN genómico de W. succinogenes

El ADN genómico de W. succinogenes se extrajo de bacterias cultivadas en medio basal. Normalmente, las células bacterianas de un cultivo de 50 ml se recogieron por centrifugación y se resuspendieron mediante agitación suave en un vórtex en 1,5 ml de tampón TE (pH 7,0). A la suspensión celular se añadieron 15 \mul de SDS al 10%, para dar una concentración final de 0,1% y 3 \mul de una solución de reserva de 20 mg/ml de proteinasa K. Después, la mezcla se incubó a 37ºC durante aproximadamente 60 minutos, seguido por varias extracciones con fenol/cloroformo. El ADN genómico se precipitó con etanol y se recogió por centrifugación. El ADN genómico de W. succinogenes aislado de este modo era lo bastante puro como para usar en la amplificación por PCR en condiciones estrictas.

Amplificación por PCR de las secuencias de asparaginasa de W. succinogenes

La secuencia de nucleótidos de un fragmento HindIII de 2,5 kb que contiene la región codificadora de 993 nucleótidos de la asparaginasa de W. succinogenes se publicó en 1995. Véase GenBank accession number X89215. La deducción de esta secuencia facilitó la síntesis de cebadores específicos para la amplificación por PCR del gen codificador de la enzima de W. succinogenes. Como se ilustra en la Figura 1, los cebadores de la PCR directos e inversos específicos de la asparaginasa de W. succinogenes tenían las siguientes secuencias:

5'-TCCGGATCCAGCGCCTCTGTTTTGATGGCT-3' Cebador OCR directo [SEC ID Nº 1] (BamHI Sitio de restric-{}\hskip7.8cm ción subrayado)

5'-TGGGAATTCGGTGGAGAAGATCTTTTGGAT-3' Cebador PCR inverso [SEC ID Nº 2] (EcoRI Sitio de restric-{}\hskip7.9cm ción subrayado)

Debe observarse que la secuencia genómica codificadora de la asparaginasa de W. succinogenes no contiene de forma natural ni el sitio de restricción BamHI ni el EcoRI. Sin embargo, la amplificación por PCR usando estos cebadores mencionados introdujo un sitio de restricción BamHI y otro EcoRI en los extremos 5' y 3', respectivamente, para facilitar la clonación direccional de esta secuencia genómica amplificada en el interior de vectores de secuenciación y/ de expresión.

En cuanto a la amplificación por PCR, el ADN genómico de W. succinogenes (purificado como en el Ejemplo 3) se sometió a 30 ciclos de amplificación por PCR en las siguientes condiciones de reacción: 10 \mul de tampón de reacción de PCR II; 6 \mul de cloruro magnésico de 25 mg/ml; 8 \mul de soluciones almacenadas 10 mM de dNTP, 1 \mul de ADN polimerasa Taq (Stratagene Corp.); 1 \mul (aproximadamente 50 ng) de cada uno de los cebadores para PCR directos e inversos específicos de asparaginasa de W. succinogenes; 1 \mul de ADN genómico de W. succinogenes y agua de grado PCR sin nucleasas para llevar la mezcla de reacción hasta un volumen total de 100 \mul. Tras la amplificación, 2 \mul de los productos de la PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se marcaron con yoduro de propidio para valorar la especificidad de la reacción de amplificación y el peso molecular de los fragmentos de ADN resultantes. La amplificación dio como resultado la producción de un fragmento de ADN homogéneo de 1,0 kb específico de asparaginasa de W. succinogenes.

Clonación de secuencias de asparaginasa de W. succinogenes

Posteriormente, el fragmento de ADN amplificado específico de la asparaginasa de W. succinogenes se subclonó en los sitios BamHI y EcoRI del vector de clonación PCRII (Stratagene, La Jolla, CA) usando las siguientes condiciones de reacción: 2 \mul de los productos de reacción amplificados por PCR, 2 \mul del vector de clonación PCRII; 1 \mul de tampón de ligación 10X, 4 \mul de ADN ligasa T_{4} (Stratagene, La Jolla, CA) y agua destilada/desionizada para alcanzar un volumen de reacción total de 10 \mul. La reacción de ligación se incubó a 16ºC durante toda la noche y 2 \mul de esta reacción se usaron para transformar las cepas de E. coli competentes DH-5\alpha y M15.

Se usó selección colorimétrica inducida por IPTG (mediada por la expresión de \beta-galactosidasa en presencia de X-GAL) para identificar las colonias bacterianas recombinantes. Se escogieron tres colonias blancas (recombinantes positivas putativas) y una colonia azul (recombinantes negativas putativas), se inocularon en un cultivo de 5 ml de medio LB que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y se incubaron durante toda la noche a 37ºC en una plataforma de agitación. De estos cultivos se aisló el ADN plasmídico mediante una metodología estándar de ADN "mini-prep" y el ADN se disolvió en 30 \mul de tampón TE y se digirió con 3 endonucleasas de restricción diferentes: BamH1, EcoRI y BamHI/EcoR1, para asegurar que el ADN plasmídico aislado contenía el inserto esperado de 1,0 kb específico de la asparaginasa de W. succinogenes.

Los resultados de la electroforesis, como se ilustra en la figura 3, carriles 2 y 4, demostraron que las colonias nº 1 y nº 3 contenían el inserto de 1,0 kb esperado. Para confirmar que estos clones contenían el gen de la asparaginasa de W. succinogenes se usaron los cebadores de PCR específicos de la asparaginasa de W. succinogenes para amplificar los fragmentos específicos de asparaginasa de W. succinogenes aislados de los clones mencionados anteriormente (figura 3, carriles 2 y 4). Estos cebadores no mediaban la amplificación del ADN bacteriano que no contenía el inserto (figura 3, carril 3). Los resultados de esta segunda amplificación por PCR demostraron que las colonias nº 1 y nº 3 contenían el inserto de ADN específico de la asparaginasa de W. succinogenes en el vector de clonación PCRII, dando como resultado la generación de un producto de amplificación de 1,0 kb (véase la figura 3, carriles 2 y 4).

A continuación, el inserto de ADN específico de la asparaginasa de W. succinogenes en el vector de clonación PCRII se eliminó mediante digestión con BamHI y EcoRI de 10 g de ADN plasmídico derivado de la colonia nº 1, se purificó en gel mediante el uso de Gene Clean Kit® (Stratagene, La Jolla, CA). El inserto de ADN se eluyó del gel con 10 \mul de agua destilada/desionizada y después se ligó durante toda la noche a 16ºC en los vectores restringidos de forma parecida pGEX-2T (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) u pET-28ª (Novagen, Inc., Madiso, WI) en las siguientes condiciones de reacción: 3 \mul de inserto de ADN; 3 \mul de ADN vector; 4 \mul de tampón de reacción de ligación 5X; 2 \mul de ADN ligasa T_{4} y 9 \mul de agua destilada/desionizada para dar un volumen de reacción final de 20 \mul. Se usaron 10 \mul de cada mezcla de reacción de ligación para transformar 50 \mul de células E. coli DH-5\alpha competentes. Los transformantes se sembraron en placas con agar LB que contienen 100 mg/ml de ampicilina. Los transformantes positivos (es decir, transformantes que contienen el inserto de ADN específico de la asparagina de W. succinogenes, pGEX-2T WSA y pET-28-WSA), respectivamente, se obtuvieron después de aproximadamente 18 horas de incubación a 37ºC. Para confirmar que los transformantes contenías el inserto de ADN específico de asparaginasa de W. succinogenes, se realizó la digestión con endonucleasas de restricción usando BamHI y EcoRI, así como amplificación por PCR y análisis de la secuencia de ADN. Los resultados de estos análisis demostraron que cada uno de los transformantes "positivos" seleccionados contenían el inserto de ADN específico de la asparaginasa de W. succionogenes. La secuencia nucleotídica del inserto de ADN específico de la asparaginasa de W. succinogenes se muestra en la Figura 6 [SEC ID Nº 3], secuencia que contiene 117 nucleótidos en dirección 5'a los codones iniciales del gen de Wolinella y 23 nucleótidos en dirección 3' al codón de terminación del gen.

Expresión de análogos recombinantes de asparaginasa de W. succinogenes

Para facilitar el aislamiento de la proteína asparaginasa recombinante de W. succinogenes (rWS), se han construido varios tipos de análogos de asparaginasa con epítopo mar4cado. Estos marcadores de epítopo incluían: hemaglutinina de influenza (HA); glutatión-S-transferasa (GST); DYLD (FLAG) y polihistidina (p-His). En cada caso, el marcador se coloca en el extremo N de la enzima.

Las siguientes metodologías se usan para aislar estas diversas proteínas asparaginasa rWS con epítopo marcado:

(1): Para purificar la enzima asparaginasa rWS GST-marcada expresada en el vector pGEX-2T-WSA se usa cromatografía en columna en sefarosa-GST (Pharmacia AB, Upsala, Suecia), seguido por fragmentación por trombina.

(2): Para purificar por afinidad la enzima asparaginasa rWS marcada con HA, o FLAG, se usan anticuerpos antiHA y antiFLAG (Pharmacia AB, Upsala, Suecia)inmovilizados en proteína G-sefarosa.

(3): Para purificar por afinidad la enzima asparaginasa rWS marcada con p-His se usa resina níquel (Ni-NTA [resina de nitrilo-ácido triacético]; Novagen, Inc., Chatsworth, CA).

Más específicamente, por ejemplo, la producción de asparaginasa rWS-glutatión-S-transferasa (GST) marcada con polihistidina (p-His) requiere la inducción de E. coli transformada positivamente con IPTG, seguido por la recogida de las bacterias (véase Hochuli, E., & Dobell, N, New metal chelate absorbents selective for protein and peptide containing neighboring histidine residues, 411, J. Chromatography 177 (1987)). En tales sistemas de expresión, se pueden usar vectores de expresión como pGEX-2T y pET-28 a, para facilitar la expresión de una forma sin epítopo marcado de la asparaginasa rWS tras la inducción con IPTG. Estos constructos marcados con p-His, localizados en el extremo N de la asparaginasa rWS, pueden subclonarse en el sitio BamH1 a EcoRI del vector pET-28A (Novagen, Inc. Chatsworth, CA para la expresión de la enzima rWS marcada con p-His.

Purificación de asparaginasa nativa de Wolinella succinogenes

La forma homotetramérica nativa de la asparaginasa de W. succinogenes se purificó según la siguiente metodología. Se prepararon lisados celulares de W. succinogenes sometiendo las bacterias cultivadas y congeladas según los Ejemplos 1 a 3 a 4 ciclos de congelación/descongelación con ultrasonidos, seguido por centrifugación de alta velocidad para eliminar los desechos celulares. Tras la centrifugación, el sobrenadante se llevó a una concentración 0,1M de sulfato amónico a una temperatura de 4ºC. Después, la mezcla se llevó hasta un volumen final de 120% mediante la adición de una solución de protamina al 2%, seguida por centrifugación durante 30 minutos a 21.000 x g. Los sobrenadantes se recuperaron, se acumularon y se llevaron a una saturación de sulfato amónico del 50% y se equilibraron durante 30 minutos en hielo con agitación continua. La solución resultante se sometió a diálisis frente a tampón fosfato potásico 0,01M (pH 8,0) y se aplicó a una columna de hidroxiapatita de 3 cm \times 20 cm (preparada por: Pharmacia, Inc.) equilibrada con tampón fosfato potásico 0,1M a pH 8,0.

La asparaginasa de W. succinogenes se eluyó de la columna de hidroxiapatita usando concentraciones escalonadas de tampón fosfato (es decir, tampón fosfato 0,10, 0,20, 0,25, 0,30, 0,35 M, pH 8,0). Las fracciones eluidas (10 ml/fracción) se recogieron, se sometieron a análisis para determinar la actividad enzimática de asparaginasa y se acumularon. Las fracciones enzimáticamente activas se sometieron a diálisis frente a tampón borato sódico 0,1M (pH 7,0) y se aplicaron a una columna de DEAE-Sephadex de 3 cm \times 20 cm (preparada por Pharmacia, Inc.) equilibrada en tampón borato sódico 0,1M, pH 7,0: La enzima se eluyó mediante el uso de un gradiente lineal de cloruro sódico (0 a 1,0M) en tampón borato sódico 0,1 M (pH 7,0). Se retuvieron 60 ml de las fracciones que contienen asparaginasa. Mediante electroforesis en SDS-PAGE y tinción de plata se ha mostrado que la L-asparaginasa de W. succinogenes preparada usando esta metodología es homogénea.

La asparaginasa EC-2 de E. coli (MercK, Sharp & Dohme, West Point, PA) se purificó posteriormente mediante filtración en gel sobre Ultragel®AcA-44 (LKV Instrumentes, Inc., Rockville, NM).La rama Pharmaceutical Resources del Instituto Nacional del Cáncer proporcionó la asparaginasa de Erwinia carotovora (Microbiological Research Establishment, Salisbury, Reino Unido).

Determinación de las características bioquímicas de la asparaginasa

Se han aclarado las estructuras cristalográficas por rayos X de varias asparaginasas microbianas (véase Lubkowski, J. & Palm, N. (1996), supra). La asparaginasa recombinante de W. succinogenes, que posee propiedades clínicas aceptables, tiene las siguientes características:

(1) actividad catalítica in vitro, (2) preferentemente una estructura homotetramérica de tipo proteína nativa requerida para la catálisis enzimática funcional, y (3) en relación con la forma recombinante de asparaginasa de W. succinogenes, similar a la de la forma homotetramérica nativa de la asparaginasa de W. succinogenes, mayor especificidad de sustrato para L-asparaginasa y no catalizadora de la desamidación de L-glutamina a ningún grado fisiológicamente significativo.

Para cuantificar las características bioquímicas de las dos enzimas asparaginasas recombinante y nativa homotetramérica, se pueden determinar los parámetros de cinética enzimática K_{m} y V_{max}, la especificidad de sustrato, el pH óptimo y la temperatura óptima. Además, se pueden usar SDS-PAGE en condiciones tanto reductoras como no reductoras, seguido por tinción de plata y azul de Coomassie de los geles, para establecer la homogeneidad de la enzima, evaluar la composición de subunidades y determinar el peso molecular de la enzima (véase Park, R. & Liu, K., A role for Shc, grb2 y raf-1 in FcR1 signal relay, 271 J. Biol. Chem. 13342 (1996).

La actividad enzimática de la L-asparaginasa puede determinarse cuantitativamente mediante la cantidad de amoniaco producido tras la hidrólisis de L-asparaginasa 0,08M usando tampón fosfato sódico 0,01M (pH 7,0) como tampón de reacción (véase Durden, D. L. & Distasio, J. A. (1980), supra). La mezcla de ensayo puede estar formada por 10 a 40 UI de una solución homogénea de enzima L-asparaginasa diluida a 2,0 ml con tampón fosfato sódico 0,01M (pH 7,0). Brevemente, este sistema de ensayo mide indirectamente la desamidación de L-asparagina mediante la cuantificación de la liberación de NH_{3} detectada por colorimetría con reactivo de Nessler. Para derivar inicialmente un coeficiente de extinción de NH_{3} se puede preparar una curva estándar de NH_{4}OH, en función de la absorbancia a 420 nm. La reacción enzimática puede iniciarse mediante la adición de sustrato L-asparagina (0,04 M). Para determinar los parámetros de cinética enzimática K_{m} y V_{max} se puede usar un sistema de ensayo más sensible de L-asparaginasa dependiente de NADPH (véase Distasio, J. A. & Niederman, T. (1976), supra).

Administración terapéutica de asparaginasa en modelos animales murinos

Las formas recombinante y nativa de asparaginasa de W. succinogenes puede ajustarse entre 5 y 50 UI por inyección y los ratones pueden recibir hasta 3 inyecciones intraperitoneales (I.P.) diarias a cada dosis. Se pueden realizar estudios toxicológicos y farmacológicos de las enzimas nativas y recombinantes mediante la determinación de la actividad enzimática en suero (es decir, la semivida de la enzima en suero) como se ha descrito anteriormente.

Determinación de la actividad enzimática de la asparaginasa (semivida en suero)

Se pueden realizar determinaciones de la semivida en suero en ratones Balb/c a los que se han inyectado 5 ó 10 UI por vía intraperitoneal de asparaginasa de Wolinella succinogenes nativa (WS) o recombinante (rWS). Las mediciones de la semivida de la enzima pueden efectuarse mediante una ligera modificación de un procedimiento previamente publicado (véase Durden, D. L., y col., kinetic analysis of hepatotoxicity associated with anti-neoplastic asparaginases, 43 Cancer res. 1602 (1983)). Específicamente, las mediciones de la semivida de la enzima se pueden llevar a cabo obteniéndose una muestra de sangre de 5 \mul de la vena de la cola de ratones Balb/c a intervalos específicos tras la inyección I.P. de asparaginasa WS o rWS. Después, las muestras de sangre se guardan en hielo hasta que se han recogido todas las muestras. Una vez que se ha completado la obtención de muestras, cada una de las muestras de sangre de 5 \mul pueden introducirse de inmediato con una pipeta en 0,5 ml de cloruro sódico al 1,19% frío en tampón fosfato sódico 0,1M (pH 7,0) y se pueden mezclar mediante agitación enérgica en vórtex.

Para determinar la actividad asparaginasa en suero (y por tanto la semivida en suero), dos alícuotas de 0,2 ml de cada punto de tiempo se pueden equilibrar en un baño de agua a 37ºC. Posteriormente se inicia la reacción enzimática mediante la adición de 0,03 ml de L-asparagina 0,04 M, equilibrada previamente a 37ºC, antes de la adición, en una de las muestras de 0,2 ml. La otra alícuota de 0,2 ml recibe sólo 0,3 ml de agua destilada y servirá como "blanco" control. El tubo de reacción que contiene el sustrato puede incubarse a 37ºC durante 1 hora, tras la cual la reacción se detiene mediante la adición de 0,2 ml de TCA al 5%. Además, al "blanco" control también se añade una alícuota de 0,2 ml de TCA al 5%. Después, los tubos se centrifugan a 5000 x g para eliminar el precipitado resultante producido por TCA. La actividad enzimática se puede determinar por colorimetría mediante la adición de una alícuota de 0,2 ml de la muestra que contiene el sustrato a 0,2 ml de agua destilada y 0,2 ml de Reactivo de Nessler recién preparado y se lee la absorbancia a 420 nm usando un espectrofotómetro (Gilford Instrument Laboratories, Oberlin, OH).

Determinación de la actividad antineoplásica de asparaginasa

La actividad antineoplásica (antilinfoma) de una preparación homogénea de asparaginasa de W. succinogenes nativa (WS) y recombinante (rWS), así como la de las asparaginasas de E. coli (EC) y de E. carotovora (Erw) puede determinarse usando la línea de células de linfosarcoma Gardner 6C3HED implantada en ratones C3H. Este tumor linfoide se originó en el timo de ratones C3H a los que se han administrado dosis elevadas de estradiol y se perpetuó por trasplante seriado en los ratones C3H. En estos estudios, el tumor se mantiene como un tumor ascítico mediante inyección I.P. de 2 \times 10^{8} células viables de linfosarcoma en 0,1 ml de PBS (pH 7,0).

Para determinar la actividad antitumoral de la asparaginasa se inyectan 2,5 x 10^{6} células viables de linfosarcoma 6C3HED de un tumor ascítico en un volumen de 0,05 ml de PBS (pH 7,0) por vía subcutánea en la región inguinal ventral izquierda de ratones C3H de 9 a 12 semanas de edad. De igual modo, en otra serie de experimentos, se inyectan 2,5 x 10^{6} células viables de linfosarcoma P1798 de un tumor ascítico en un volumen de 0,05 ml de PBS (pH 7,0) por vía subcutánea en la región inguinal ventral izquierda de ratones Balb/c de 9 a 12 semanas de edad (véase Jack, G. W., y col., The effect of histidine ammonia-lyase on some murine tumors, 7 Leukemia Res. 421 (1983)). Generalmente, el crecimiento palpable del tumor sólido se produjo dentro de los 4 a 7 días posteriores a la inyección de las células de linfosarcoma. Después, se miden los cambios en el volumen del tumor sólido por medio de medición diaria con compás de las dimensiones del tumor en tres ejes. Cuando el volumen medio del tumor alcanza 1 cm^{3} se puede efectuar la inyección intraperitoneal de asparaginasa. Puede administrarse una dosis total de 3 ó 6 UI de asparaginasa en un total de seis inyecciones I.P. de 0,5 ó 1,0 UI asparagina/inyección, respectivamente. Las inyecciones pueden administrarse dos veces a día durante tres días consecutivos.

El grupo de animales control negativo recibe inyecciones I.P. de tampón fosfato 0,01 M (pH 7,0) usando un programa de inyección similar. Las asparaginasas de E. coli y E. carotovora sirven como controles positivos para comparación de la actividad antitumoral en esta serie de experimentos. Para el análisis estadísticos de los datos se usará una prueba de t de Student.

Reactividad cruzada inmunológica de la asparaginasa de W. succinogenes

Este ejemplo describe cómo se determinó si los anticuerpos de pacientes que se sabe que neutralizan la asparaginasa de E. coli reaccionan con W. succinogenes. Específicamente, se realizó un ensayo ELISA para efectuar esta determinación, como se describe a continuación.

El ensayo ELISA se realizó en placas de microtitulación de 96 pocillos, del siguiente modo:

la asparaginasa (EC en una placa, WS en la otra) se diluyó en tampón carbonato (preparado disolviendo 1,59 g de Na_{2}CO_{3}, 2,93 g de NaHCO_{3} y 0,2 g de NaN_{3} en 1 l de agua purificada; el pH se ajustó a 9,0-9,5 usando HCl 1N o NaOH 1N; el tampón se almacenó a 4ºC durante no más de dos semanas antes de usar) hasta una concentración final de 0,10 UI/ml. De cada placa, 54 pocillos se recubrieron con 100 \mul de la solución respectiva de asparaginasa diluida y se incubaron durante toda la noche a 4ºC después de envolverse en papel de aluminio para permitir que la enzima se asocie con las placas.

A la mañana siguiente, se retiraron las placas y se eliminó la solución de cada uno de los pocillos. A continuación se bloquearon estos pocillos con 300 \mul de una solución de 1 mg/ml de tampón bloqueante BSA-PBS, a pH 7,0 (preparado fresco añadiendo la cantidad adecuada de seroalbúmina bovina a tampón PBS, fosfato sódico 0,010 M, pH 7,0-7,2, suero salino al 0,9%). Después, las placas se lavaron con 300 ml de tampón Tween-suero salino (NaCl 0,145M, Tween 20 0,05%) por pocillo usando un lavador de placas Dynatech Ultrawash.

Los anticuerpos usados para la selección en las dos placas se diluyeron del siguiente modo: 1:100, 1:1.000;1:2.000; 1:4.000; 1:8.000; 1:16.000 y 1:32.000. Como control se usó el suero de un paciente humano normal. El suero del paciente, el suero antiasparaginasa de EC de conejo y el suero de ser humano normal se diluyeron en PBS-Tween (PBS con Tween 20 0,05%) y 100 \mul de cada dilución se colocaron en cada placa por triplicado según el siguiente esquema:

1

Después de añadir las diluciones anteriores, las placas se incubaron durante al menos 1,5 horas a temperatura ambiente, seguido por tres lavados de cada placa con suero salino-Tween, como se ha descrito antes. A la dilución de 1:1.000 se preparó inmunoglobulina antihumana de cabra conjugada con peroxidasa de rábano (BioSource International) en PBS-Tween. A continuación se añadió a cada pocillo 100 \mul de la Ig antihumana conjugada -PR. Después, se cubrieron las placas y se las dejó incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.

Después de 1 hora de incubación, cada placa se lavó de nuevo tres veces con suero salino-Tween, como antes. Para detectar la unión del anticuerpo, a cada pocillo se añadieron 100 \mul de sustrato OPD (o-fenilendiamindiclorhidrato)(40 mg de OPD en 100 ml de tampón fosfato cítrico (0,1M, pH 6,0, preparado combinando una solución que contiene 13,4 g de Na2HPO4 7 H2O (dibásico) en 500 ml de agua destilada con una cantidad de una solución que contiene 9,60 g de ácido cítrico (anhidro) en 500 ml de agua destilada suficiente para ajustar el pH a 6,0) con 334 \mul de H2O2 al 3% preparada justo antes de usar y guardada a temperatura ambiente en oscuridad) y se dejó incubar a temperatura ambiente en oscuridad durante aproximadamente 40 minutos. La reacción en cada pocillo se detuvo añadiendo 100 \mul de ácido fosfórico 1M. Después se midió la absorbancia en cada pocillo a 40 nm.

Como se muestra en la figura 8, títulos elevados de anticuerpos neutralizantes frente a la enzima de E. coli presente e el plasma del paciente no se unieron a la asparaginasa de Wolinella. Este figura muestra uno de 6 muestras de plasma recogidas de pacientes de los que se conoce que son alérgicos a la enzima de E. coli, así como antisuero de conejo producido frente a la asparaginasa de E. coli. Ninguno de estos antisueros reactivos antiE. coli se une o neutraliza la actividad asparaginasa de Wolinella (figuras 8 y 9). A partir de estos datos se concluyó que la enzima de W. succinogenes es inmunológicamente distinta de la de E. coli y que la enzima de Wolinella se puede usar en pacientes alérgicos a la enzima de E. coli (como se pone como ejemplo mediante titulación del plasma del paciente que se muestra en la figura 8 y del antisuero anti E. coli de conejo que se muestra en la figura 9).

También se ha preparado un antisuero altamente específico frente a la enzima de W. succinogenes que no muestra reacción cruzada con la asparaginasa de E. coli en los análisis Western blot. Este reactivo es útil para realizar caracterizaciones inmunológicas de las formas nativa, recombinante y diversos análogos de la enzima de Wolinella. El análisis de las formas nativa, recombinante y análogas de la asparaginasa de W. succinogenes para este tipo de reactividad cruzada será útil para caracterizar proteínas modificadas genéticamente y químicamente. Un hecho importante es que estos análisis se aplicarán para analizar las muestras clínicas durante las fases I y II de los ensayos clínicos de las diferentes formas de la enzima de W. succinogenes.

Ejemplo 1 Metodología para la modificación de proteínas usando acilación

La acilación de proteínas se lleva a cabo usando diferentes agentes acilantes, tales como haluros de acilo (por ejemplo, cloruro de acilo), compuestos de carbodiimida o anhídridos ácidos, cada uno con un número distinto de átomos de carbono que comprende una cadena alifática lineal o ramificada unida al átomo de carbono del carbonilo o del carbonilo modificado En el caso de las carbodiimidas). Los agentes acilantes cuyo uso se contempla en la práctica de esta invención tienen la capacidad para reaccionar con un grupo polar contenido en la secuencia peptídica de una proteína para formar una cadena lateral amida. El grupo polar es la cadena lateral de cualquiera de los aminoácidos de la secuencia primaria, por ejemplo, el grupo amino de lisina o arginina, el grupo hidroxi de treonina, serina o tirosina, o el grupo tiol de cisteína. Preferentemente, la reacción se lleva a cabo en condiciones que no reducen sustancialmente (es decir, reducen en más del 90%, preferentemente menos del 50% y, más preferentemente menos del 25%) la actividad catalítica de la enzima.

Brevemente, la reacción química comenzó a tiempo cero con la adición, gota a gota, de cloruro de acetilo a 5.000 UI de asparaginasa derivada de W. succinogenes en un volumen de 10 ml de tampón borato 0,1 M a pH 8,5. La concentración final de cada cloruro ácido es 0,1M. La reacción química implica un ataque nucleófilo del grupo polar, por ejemplo el grupo amino libre, en la secuencia peptídica de la molécula de asparaginasa (que se mantiene en una forma sin protonar en el tampón borato, pH 8,5) con el agente acilante reactivo. El grupo polar reacciona con el agente acilante, proporcionando una cadena lateral aminoacídica de hidrocarburo alifático modificado. Si el agente acilante es un haluro de acilo, se produce un equivalente del ácido hidrohálico respectivo. Por tanto, si el agente acilante es cloruro de acilo y el aminoácido que se va a modificar es lisina, después la reacción da un grupo amino acilado y 1 equivalente de HCl (véase la figura 7). Para impedir que las condiciones ácidas destruyan la estructura de la molécula proteica (disminuyendo el rendimiento de la enzima, Tabla 1, a continuación), a la mezcla de reacción se añade, gota a gota, una solución de NaOH 1N cada 5-10 segundos. Se extrajeron alícuotas de 2 ml a los tiempos de reacción indicados (véase la Tabla 1, a continuación) e inmediatamente se sometieron a diálisis frente a tampón fosfato 0,01M a pH 7,0. La concentración de proteínas se mide mediante el método Bradford. La actividad enzimática se determina por la cantidad de amoniaco producido tras la hidrólisis de L-asparagina (L-asparagina 0,08M) con un reactivo de Nessler (véase Durden, D. L. y col., Cancer Res. 40: 1125, (1980)). Los grupos amino libres se miden mediante el método de Habeeb (véase Habeeb, A. F. S. A., Analytical Biochemistry, 14: 328, 1966).

TABLA 1 Efecto de la acilación con cloruro de acetilo sobre la asparaginasa de W. succinogenes

2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a) \+  \begin{minipage}[t]{135mm} La reacción se inicia al
tiempo 0 con la adición de cloruro de acetilo a 5.000 UI de
asparaginasa de  W. succinogenes  en 10 ml de tampón borato 0,1
M, pH 8,5. Se extraen alícuotas de 2,0 ml a los tiempos indicados y
se someten a diálisis frente a tampón fosfato 0,01M, pH
7,0.\end{minipage} \cr  b) \+  \begin{minipage}[t]{135mm}
La Proteína se mide por triplicado mediante el método de
Bradford.\end{minipage} \cr  c) \+
 \begin{minipage}[t]{135mm} La actividad enzimática se mide
determinando la cantidad de amoniaco producido tras la hidrólisis de
L-asparagina con reactivo de
Nessler.\end{minipage} \cr  d) \+ Los grupos amino libres se
miden mediante el método de
Habeeeb.\cr}

La modificación de acilo se lleva a cabo con agentes acilantes de cadenas alifáticas de diferentes longitudes, por ejemplo una cadena alifática de 2 carbonos (C2), una cadena alifática de 4 carbono (C4), una cadena alifática de 6 carbonos (C6) etc. Un hecho importante es que, cada proteína específica (por ejemplo, asparaginasa) tiene un número diferente de grupos polares libres en distintas posiciones en la molécula proteica y, por tanto, cada proteína se modifica óptimamente con un agente acilante de longitud diferente, que conjuga una cadena de carbonos alifática distinta con los grupos amino libres. Estos incluyen, por ejemplo, cloruro de acetilo (C2), cloruro de butirilo (C4), cloruro de hexanoílo (C6), cloruro de decanoílo (C10), así como el uso de cloruros ácidos de cadena ramificada incluyendo cloruro de trimetilacilo. Asimismo, se pueden usar agentes acilantes distintos para proteínas diferentes. Por ejemplo, con algunas proteínas se puede usar cloruro de acetilo, mientras que para otras proteínas el mejor agente acilante puede ser anhídrido acético. Con propósitos de ilustración, en la Tabla 1 se presenta la modificación covalente de la asparaginasa de W. succinogenes con cloruro de acetilo.

A. Resultados de la modificación

Una serie de problemas se han asociado con el uso de enzimas con fines terapéuticos. Muchas de estas enzimas tienen semividas extremadamente cortas, que limitan su eficacia in vivo. La modificación con C2 de la asparaginasa de W. succinogenes da como resultado una enzima que tiene una semivida de 8,2 horas en ratones, en comparación con la semivida de 1,8 horas de la enzima nativa. El aumento de la semivida es consistente con el curso del tiempo de la reacción de acetilación (dando como resultado una disminución del 20-40% de la actividad enzimática, mientras que la actividad de la asparaginasa de W. succinogenes disminuye al aumentar el tiempo de reacción). Se observó una recuperación de aproximadamente el 80% de la actividad enzimática después de 30 minutos de tiempo de reacción, un tiempo de alteración máxima de la prolongación farmacocinética de la semivida hasta 8,0 horas. Otros procedimientos de modificación que implican polimerización (por ejemplo, modificación con polietilenglicol) dan como resultado grupos heterogéneos de productos de reacción modificados que pueden no ser adecuados para la administración a seres humanos. El procedimiento de modificación con cloruro ácido es un abordaje sistémico que no proporciona tal heterogeneidad en los productos de reacción (véase la figura 7). La mayor reproducibilidad y la naturaleza más restringida de los productos de reacción dan lugar a una modificación bien controlada de la proteína y a un producto más fiable, con una prolongación predecible de la semivida que disminuye la inmunogenicidad, y con la ventaja de ser capaz de controlar cuidadosamente el grado de modificación de los grupos polares presentes en la molécula proteica específica. Los datos actuales sobre la modificación de la asparaginasa de W. succinogenes demuestran que la enzima está modificada con una reacción de acilación C2 que produce el aumento de la semivida de aproximadamente el cuádruple. La modificación de los grupos amino libres de la molécula de asparaginasa es responsable de la prolongación de la semivida. Se ha sugerido que la prolongación de la semivida se correlacionará con una disminución de la carga electrostática, un aumento de la hidrofobicidad y una reducción de la inmunogenicidad de la enzima de Wolinella. La prolongación de la semivida y la disminución de la inmunogenicidad aumentarán la eficacia de la enzima de W. succinogenes, cuando este fármaco se usa en el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda, enfermedad autoinmunitaria o SIDA, por ejemplo en seres humanos. Mediante este procedimiento de modificación somos capaces de generar proteínas extrañas que tienen una inmunogenicidad inferior, una semivida prolongada y una mayor eficacia.

Aunque las formas de realización y las aplicaciones de la presente invención se han descrito con algún detalle como ilustración y ejemplos con fines de claridad y comprensión, será evidente para los expertos en la técnica relevante que serían posibles muchas modificaciones adicionales sin separarse de los conceptos inventivos contenidos en la presente memoria descriptiva. Por tanto, la invención no debe restringirse de ninguna manera, a excepción de las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se usa anteriormente, el término "incluyendo" significa "incluir sin limitación", y los términos usados en singular deberán incluir el plural y viceversa, a menos que el contexto dicte otra cosa.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Donald L Durden

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: USO DE LA ASPARAGINASA DE WOLINELLA SUCCINOGENES EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES HEMATOLÓGICAS Y AUTOINMUNITARIAS HUMANAS

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 3

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(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

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(A): DIRECCIÓN: Lyon & Lyon

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(B): CALLE: 633 West Fifth Street suite 4700

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(C): CIUDAD: Los Ángeles

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(D): ESTADO: California

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): CÓDIGO POSTAL: 90071-2066

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(V): FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete de 3,5'', 1,44 Mb de memoria

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(B): ORDENADOR: IBM compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: IBM PC DOS 5.

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(D): SOFTWARE: FastSEQ para Windows 2.0

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: En espera de asignación

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(B): DATOS DE PRESENTACIÓN: Presentado con la presente

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 60/049.085

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 9 de junio de 1997

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN ABOGADO/ AGENTE:

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(A): NOMBRE: Warburg, Richard J.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 32.327

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/ EXPEDIENTE: 234/274

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A): TELÉFONO: (213)489-1600

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(B): TELEFAX: (213) 955-0440

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(C): TELEX: 67-3510

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 30 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENA: única

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(x): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCGGATCCA GCGCCTCTGT TTTGATGGCT

\hfill

30

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 30 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENA: única

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGAATTCG GTGGAGAAGA TCTTTTGGAT

\hfill

30

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(3) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1133 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENA: única

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:

3

Claims

1. Una composición farmacéutica que comprende la asparaginasa acilada de Wolinella succinogenes y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que la asparaginasa es una enzima nativa.

3. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que la asparaginasa es una enzima recombinante.

4. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la asparaginasa se produce haciendo reaccionar la asparaginasa de Wolinella succinogenes con uno o más haluros de acilo.

5. El uso de una asparaginasa de Wolinella succinogenes en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo compuesto por enfermedades hematológicas y autoinmunitarias malignas y no malignas, en el que dicha enzima es un análogo de la asparaginasa que comprende al menos una modificación covalente y en el que dicha modificación covalente es acilación.

6. El uso según la reivindicación 5, en el que la asparaginasa es una enzima nativa.

7. El uso según la reivindicación 5, en el que la asparaginasa es una enzima recombinante.

8. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la enfermedad hematológica maligna se selecciona del grupo formado por un linfoma, una leucemia y un mieloma.

9. El uso según la reivindicación 8, en el que la enfermedad hematológica maligna es una enfermedad crónica.

10. El uso según la reivindicación 9, en el que la enfermedad hematológica maligna crónica está en una fase aguda.

11. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo formado por artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico y SIDA.

12. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en el que el paciente es un mamífero seleccionado del grupo formado por animales bovinos, caninos, equinos, felinos, porcinos y primates.

13. El uso según la reivindicación 12, en el que el paciente es un ser humano.

14. El uso según las reivindicaciones 12 ó 13, en el que el paciente se ha sensibilizado a otras enzimas microbianas por un tratamiento previo.

15. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14, en el que dicha acilación se lleva a cabo usando uno o más haluros de acilo.

16. El uso según la reivindicación 15, en el que dicho uno o más haluros de acilo son uno o más cloruros de acilo.

17. El uso según la reivindicación 16, en el que dicho uno o más cloruros de acilo se seleccionan del grupo formado por cloruro de acetilo, cloruro de butirilo, cloruro de hexanoílo y cloruro de decanoílo.