BRPI0708008A2 - indução e estabilização de atividade enzimática em microorganismos - Google Patents

Abstract

INDUçãO E ESTABILIZAçãO DE ATIVIDADE ENZIMáTICA EM MICROORGANISMOS. A presente invenção refere-se a métodos para indução da atividade desejada em enzimas ou microorganismos capazes de produzir as enzimas. A invenção refere-se ainda a métodos de estabilização da atividade em microorganismos. Em modalidades específicas, a invenção provê métodos para indução e estabilização da atividade de nitrilo hidratase, atividade de amidase e atividade de asparaginase 1. A invenção provê ainda composições compreendendo enzimas ou microorganismos tendo atividade induzida e/ou estabilizada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INDUÇÃO EESTABILIZAÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA EM MICROORGANISMOS"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se em geral a métodos para o cultivode microorganismos para produção de enzima e composições compreen-dendo enzimas ou microorganismos tendo atividade induzida e/ou estabili-zada. Mais particularmente, a invenção refere-se a métodos para indução deuma atividade de enzima desejada em microorganismos através do uso demeios de crescimento específicos e a métodos para estabilização da ativida-de desejada em uma enzima ou um microorganismo capaz de produzir aenzima.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Microorganismos, e suas enzimas, têm sido utilizados ao longotempo como biocatalisadores na preparação de vários produtos. A ação delevedura na fermentação de açúcar em etanol é um exemplo imediatamentereconhecível. Nos últimos anos, tem havido um crescente interesse no usode microorganismos e suas enzimas em atividades comerciais não normal-mente reconhecidas como sendo condescendentes ao uso de enzima. Umexemplo é o uso de microorganismos em processos industriais, particular-mente no tratamento de produtos de refugo.

Compostos contendo nitrila são usados em uma variedade deaplicações comerciais. Por exemplo, nitrilas são usadas na síntese de mui-tos compostos comercialmente úteis incluindo aminas, amidas, amidinas,ácidos carboxílicos, ésteres, aldeídos, cetonas, iminas e heterocíclicos. Nitri-las são também usadas como solventes, como herbicidas e na síntese dedetergentes e anti-sépticos. Uma das nitrilas comercialmente mais importan-tes é acrilonitrila, que é usada na produção de acrilamida, ácido acrílico, fi-bras acrílicas, resinas de copolímero e borrachas de nitrila.

As correntes de refugo geradas na produção de nitrilas freqüen-temente contêm altas concentrações de compostos contendo nitrogênio pe-rigosos. Por exemplo, as correntes de refugo podem conter nitrilas, tal comoacetonitrila, acrilonitrila, succinonitrila e fumaronitrila. Ainda, tais correntes derefugo podem também conter compostos perigosos, tal como cianidas, acri-lamidas, acroleína e cianoidrinas. Como refugos perigosos não podem ge-ralmente ser liberados legalmente no ambiente, métodos para tratamento decorrentes de refugo para remover ou remediar um ou mais componentesperigosos são importantes em processos de produção comercial.

Um método para tratamento de correntes de refugo de nitrogêniotem sido através do uso de certos microorganismos que convertem compos-tos nitrila em suas amidas ou ácidos correspondentes. Por exemplo, a Pa-tente US Nq 3.940.316 e a Patente U.S. Ne 4.001.081 revelam o uso de mi-croorganismos nitrilo hidratase para produzir acrilamida a partir de acrilonitrila.

Em geral, microorganismos de conversão de nitrila degradamnitrilas alifáticas em uma reação de duas etapas envolvendo nitrilo hidratasee amidase. Em uma primeira etapa, nitrilo hidratase catalisa a hidrólise danitrila (ou cianoidrina) para a amida correspondente (ou hidróxi ácido). Emuma segunda etapa, amidase catalisa a hidrólise da amida no ácido ou hi-dróxi ácido correspondente. Similarmente, alguns microorganismos forammostrados degradar nitrilas aromáticas diretamente convertendo essas nitri-Ias em seu respectivo ácido através da ação de nitrilase.

Desde os relatórios iniciais documentando a utilidade comercialpotencial da conversão biológica de acrilonitrila em acrilamida, as enzimasenvolvidas na degradação microbiana de nitrilas receberam considerávelinteresse. A possibilidade de preparação enzimática de ácidos quirais (talcomo hidróxi ácidos a partir de precursores de cianoidrina) tem sido tambémum foco de muito interesse neste campo. Apesar dos resultados promisso-res, as várias aplicações potenciais da conversão de nitrilo hidrata-se/amidase discutidas acima não foram ainda integralmente exploradas.

Outro exemplo do uso crescente de microorganismos e suasenzimas é na formação de ácido aspártico. Asparaginase I é uma enzimaque catalisa a hidrólise de asparagina em ácido aspártico, conforme mostra-do abaixo:HOOCCHNH2CONH2 + H2O -> HOOCCHNH2CH2COOH + NH3

Asparaginase I pode ser encontrada em bactérias, plantas emuitos animais; no entanto, como células sangüíneas brancas humanas nãopossuem a enzima asparagina sintase necessária, as células não podemproduzir asparagina. Foi então constatado que asparaginase I pode ser efi-caz no tratamento de leucemia maligna humana. Células leucêmicas tipica-mente têm níveis baixos de asparagina sintase, a enzima algumas vezesestando completamente ausente. Células leucêmicas, então, geralmenterequerem uma fonte externa de asparagina. Uma vez que asparaginase Iconverte asparagina em ácido aspártico, administração de asparaginase I aum paciente sofrendo de leucemia limita mais a fonte disponível de aspara-ginase para as células cancerosas e funciona para enfraquecer a célula tor-nando-a mais suscetível a tratamentos quimioterapêuticos. Deste modo, as-paraginase I é tipicamente administrada a um paciente com leucemia comoparte de uma terapia de combinação com um agente quimioterapêutico.

Asparaginase I para uso em tal tratamento é atualmente obtida apartir de bactérias E. coli (na forma de um heterotetrâmero) e bactérias Er-winia (na forma de um homotetrâmero), mas essas fontes têm cada umadesvantagens. Por exemplo, a asparaginase I obtida de E. coli é menos efi-caz do que a asparaginase I obtida de Erwinia. No entanto, é muito mais di-fícil produzir asparaginase I usando Erwinia do que com E. coli. Ainda, essesrecursos podem resultar na presença de toxinas Gram-negativas na enzimaisolada, que é indesejável. Então, permanece uma necessidade de aumentara produção de asparaginase I a partir de uma variedade de microorganismosenquanto evitando produção simultânea de toxinas gram negativas, que po-de ser prejudicial.

Estabilidade, que é um elemento-chave para um catalisador bio-lógico prático, tem sido um obstáculo significante para usar nitrilo hidratasee/ou amidase em muitas aplicações comerciais. Embora agentes de imobili-zação e estabilização química sejam abordagens conhecidas para melhorada estabilidade da enzima, as presentes técnicas de imobilização e estabili-zação ainda precisam de mais desenvolvimento. Deste modo, permanece anecessidade na técnica de método para indução de níveis mais altos de ati-vidade enzimática em uma variedade de microorganismos, particularmentemicroorganismos capazes de produzir enzimas úteis na degradação decompostos contendo nitrila. Ainda, há também uma necessidade de um mé-todo para melhorar a estabilização de enzimas-chave na degradação decompostos contendo nitrila.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se em geral a métodos para induçãoe estabilização da atividade enzimática em microorganismos. A invençãoparticularmente faz uso de microorganismos produtores de nitrilo hidratasepara indução da produção de várias enzimas úteis. Por exemplo, em certasmodalidades, a invenção provê métodos úteis para indução da produção denitrilo hidratase (particularmente em níveis mais altos do que anteriormentepossível), asparaginase I e amidase a partir de microorganismos de degra-dação de nitrila. Em modalidades adicionais, a invenção provê métodos demelhora da estabilização de várias enzimas, tal como nitrilo hidratase, aspa-raginase I e amidase. A invenção também provê catalisadores bio-desintoxicantes (particularmente incorporando enzimas tal como nitrilo hidra-tase e amidase) que podem manter um nível comercialmente útil de ativida-de enzimática com o tempo. Os catalisadores biodesintoxicadores são parti-cularmente caracterizados pelo fato de que a atividade enzimática dos bioca-talisador-es pode ser induzida e estabilizada por seu ambiente, conforme a-qui descrito.

A presente invenção é particularmente caracterizada pelo fato deque os métodos descritos aqui podem ser usados para induzir atividade en-zimática que é de ambos nível e estabilidade que são úteis em um catalisa-dor de biodesintoxicação prático. A invenção é ainda caracterizada pela ha-bilidade em induzir níveis mais altos de asparaginase I a partir de microor-ganismos, incluindo (mas não limitado a) microorganismos Gram-positivos, emelhorar a estabilidade de tal atividade de asparaginase I.

A invenção é particularmente vantajosa pelo fato de que induçãoe estabilização dos microorganismos podem ser realizadas sem a necessi-dade de introdução de nitrilas perigosas, tal como acrilonitrilas, no ambiente.

Anteriormente, era acreditado que indução de atividade de enzima específi-ca em certos microorganismos necessitasse da adição de indutores quími-cos. Por exemplo, na indução de atividade de nitrilo hidratase em Rhodococ-eus rhodochrous e Pseudomonas chloroaphis, era geralmente necessáriosuplementar com agentes químicos perigosos, tal como acetonitrila, acriloni-trila, acrilamida e similar. Apenas de acordo com a presente invenção, noentanto, foi surpreendentemente constatado que atividade enzimática altaem microorganismos produtores de nitrilo hidratase pode ser induzida e es-tabilizada com o uso de aditivos de meios não-perigosos, tal como aminoá-cidos contendo amida, e seus derivados. Mais particularmente, de acordocom a invenção, asparagina, glutamina, ou suas combinações, podem serusadas como indutores com a exclusão completa de agentes químicos peri-gosos, tal como acetonitrila, acrilonitrila, acrilamida e similar. Então, a pre-sente invenção provê beneficamente métodos mais seguros para produçãode enzimas e microorganismos comercialmente úteis e seu uso em métodosadicionais, tal como para desintoxicação de correntes de refugo.

Em modalidades preferidas, a presente invenção provê aumen-tos significantes na produção e estabilidade de várias enzimas, e os micro-organismos capazes de produzir as enzimas, usando meios modificados,técnicas de imobilização e estabilização, conforme aqui descrito. Por exem-plo, indução e estabilização podem ser aumentadas através do uso de meioscompreendendo aminoácidos contendo amida, ou seus derivados.

Em um aspecto, a invenção compreende um método para cultivode microorganismos produtores de nitrilo hidratase. O método compreendede preferência cultura do microorganismo em um meio compreendendo umou mais aminoácidos contendo amida ou seus derivados. Em modalidadesespecíficas, o microorganismo produtor de nitrilo hidratase compreende bac-térias do gênero fíhodococcus. Em modalidades preferidas, os aminoácidoscontendo amida são selecionados do grupo consistindo em asparagina, glu-tamina ou suas combinações.

Em outras modalidades, a invenção provê um método para indu-ção de uma atividade de enzima desejada em um microorganismo produtorde nitrilo hidratase. De preferência, o método compreende cultura do micro-organismo produtor de nitrilo hidratase em um meio compreendendo um oumais aminoácidos contendo amida ou seus derivados. Em modalidades es-pecíficas, a atividade de enzima induzida pelo método compreende atividadede nitrilo hidratase, atividade de amidase ou atividade de asparaginase I. Osmétodos da invenção podem compreender etapas de processo adicionais,tal como recuperação do microorganismo culturado tendo a atividade de en-zima desejada, recuperação de uma enzima tendo a atividade desejada, fi-xação do microorganismo, ou células dele, a um substrato e reticulação decélulas do microorganismo.

Em modalidades adicionais, a invenção provê particularmentemétodos para estabilização de uma atividade desejada em uma enzima ouum microorganismo capaz de produzir a enzima. Em uma modalidade, taismétodos compreendem contato da enzima, ou um microorganismo capaz deproduzir a enzima, com um ou mais aminoácidos contendo amida.

Em modalidades adicionais da invenção, a enzima, ou o micro-organismo capaz de produzir a enzima, pode ser imobilizado. Tal imobiliza-ção pode funcionar para fixar as enzimas, microorganismos ou células a umsubstrato para facilidade de manuseamento. Em outras modalidades, tal i-mobilização pode realmente funcionar para estabilizar a atividade induzida,então prolongando o tempo durante o qual a atividade induzida pode ser uti-lizada. A imobilização pode compreender ligação de superfície da enzima,microorganismo ou células a um substrato. Alternativamente, a imobilizaçãopode compreender pelo menos parcialmente aprisionamento da enzima, mi-croorganismo ou células dentro de um substrato ou através de reticulação decélulas, tal como com glutaraldeído. Isto permite beneficamente apresenta-ção de um material imobilizado com atividade induzida (por exemplo, umcatalisador) de tal maneira a facilitar reação do catalisador com um materialpretendido e recuperação de um produto desejado enquanto simultanea-mente retendo o catalisador no meio de reação e em um modo reativo.

Em modalidades particulares, o substrato compreende um mate-rial polimérico, que é de preferência selecionado do grupo consistindo empolímeros contendo alginato e amida. Outros materiais de substrato sãotambém compreendidos pela invenção. Atividade estabilizada de acordocom a invenção é de preferência caracterizada pela manutenção de umaporcentagem de atividade específica em relação à atividade inicial. Por e-xemplo, em uma modalidade, a atividade desejada da enzima, ou do micro-organismo capaz de produzir a enzima, é estabilizada de modo que a ativi-dade desejada após um tempo de pelo menos 30 dias em uma temperaturade cerca de 25°C é mantida em um nível de pelo menos cerca de 50% daatividade inicial exibida pela enzima ou pelo microorganismo capaz de pro-duzir a enzima.

Em modalidades adicionais, a invenção provê métodos parapreparação de uma enzima ou microorganismo tendo uma atividade enzimá-tica específica. Por exemplo, em uma modalidade, a invenção provê méto-dos para preparação de uma enzima ou microorganismo tendo atividade denitrilo hidratase. Em particular, o método compreende indução de atividadede nitrilo hidratase em um microorganismo através de cultura do microorga-nismo em um meio compreendendo um ou mais aminoácidos contendo ami-da ou seus derivados, e recuperação da enzima ou microorganismo tendoatividade de nitrilo hidratase. Em modalidades adicionais, a invenção provêmétodos para preparação de uma enzima ou microorganismo tendo ativida-de de asparaginase I ou atividade de amidase.

A invenção é ainda caracterizada pela habilidade em multipla-mente induzir atividade enzimática em microorganismos de modo que osmicroorganismos, ou as enzimas então produzidas, sejam capazes de de-gradar uma pluralidade de compostos. Então, em uma modalidade, o méto-do da invenção compreende multiplamente induzir a atividade de nitrilo hi-dratase em direção a uma pluralidade de compostos contendo nitrila em ummicroorganismo através de cultura do microorganismo em um meio compre-endendo um ou mais aminoácidos contendo amida ou seus derivados. Op-cionalmente, o método compreende ainda recuperação da enzima ou micro-organismo tendo atividade de nitrilo hidratase para degradação de uma plu-ralidade de compostos contendo nitrila. Com certeza, em modalidades adi-cionais, a invenção provê métodos de multiplamente induzir outros tipos deatividade.

Em outro aspecto, a presente invenção provê uma nova compo-sição que é particularmente útil nos métodos da invenção, bem como para aprodução de vários dispositivos, tal como biofiltros. Em uma modalidade, acomposição da invenção compreende: (a) um meio nutriente compreenden-do um ou mais aminoácidos contendo amida ou seus derivados; (b) um oumais microorganismos produtores de enzima e (c) uma ou mais enzimas. Depreferência, as enzimas são selecionadas do grupo consistindo em nitrilohidratase, amidase, asparaginase I e suas combinações. Em modalidadesadicionais, o um ou mais microorganismos compreendem bactérias selecio-nadas do grupo consistindo em gênero Rhodococcus, gênero Brevibacteriume suas combinações. Em modalidades preferidas, o um ou mais microorga-nismos podem ser pelo menos parcialmente imobilizados em um substrato.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A presente invenção é particularmente descrita com referênciaàs figuras que seguem; no entanto, tais figuras são providas para ilustrarapenas modalidades preferidas da invenção, e a invenção não pretende serlimitada a elas.

A figura 1 é uma ilustração gráfica do efeito de estabilização so-bre atividade de nitrilo hidratase provida pela imobilização em alginato decálcio em uma modalidade de acordo com um método da invenção;

A figura 2 é uma ilustração gráfica do efeito de estabilização so-bre atividade de nitrilo hidratase provida pela imobilização em poliacrilamidaem uma modalidade de acordo com o método da invenção;

A figura 3 é uma ilustração gráfica do efeito de estabilização so-bre atividade de nitrilo hidratase provida pela imobilização em alginato decálcio reticulado com polietilenoimina, endurecido, ou poliacrilamida em mo-dalidades adicionais de acordo com um método da invenção;

A figura 4 é uma ilustração gráfica do efeito de estabilização so-bre atividade de nitrilo hidratase provida pela imobilização através de reticu-lação com glutaraldeído de acordo com um método da invenção; e

A figura 5 é uma ilustração gráfica da atividade de asparaginaseI em células DAP 96253 de Rhodococcus sp. induzida com asparagina deacordo com uma modalidade da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção agora será descrita mais integralmente da-qui em diante com referência a modalidades específicas da invenção e parti-cularmente aos vários desenhos providos com ela. Na verdade, a invençãopode ser concretizada em muitas formas diferentes e não deve ser construí-da como limitada às modalidades mostradas aqui; pelo contrário, essas mo-dalidades são providas de modo que esta descrição vai satisfazer necessi-dades legais aplicáveis. Conforme usado no relatório, e nas reivindicaçõesapensas, as formas singulares "um", "uma", "o", "a" incluem referentes noplural a menos que o contexto dite claramente de outro modo.

A presente invenção surge da surpreendente constatação deque atividade enzimática específica pode ser induzida e estabilizada atravésda adição de aminoácidos contendo amida, ou seus derivados, a uma cultu-ra ou composição compreendendo enzimas ou microorganismos específicoscapazes de produzir tais enzimas. Além disso, estabilização adicional podeser conseguida através de métodos de imobilização, tal como fixação, apri-sionamento e reticulação. Em modalidades específicas, são providos méto-dos para induzir níveis mais altos de nitrilo hidratase e amidase a partir demicroorganismos de degradação (incluindo microorganismos produtores denitrilo hidratase) e de melhora da estabilidade de nitrilo hidratase.

Os métodos da invenção descritos aqui também provêem méto-dos adicionais úteis na desintoxicação de composições contendo compostosnitrila através da conversão das porções nitrila em amidas e/ou ácidos. Taismétodos podem ser usados para remover compostos nitrila indesejados devárias composições, tal como correntes de refugo de instalações de fabrica-ção e produção.

A presente invenção provê em geral métodos para cultura demicroorganismos, de preferência induzindo atividade enzimática específica.De preferência, os métodos compreendem cultura do microorganismo emum meio compreendendo um ou mais aminoácidos contendo amida ou seusderivados. Em modalidades preferidas, os aminoácidos contendo amida sãoselecionados do grupo consistindo em asparagina, glutamina, seus deriva-dos ou suas combinações. Por exemplo, os aminoácidos contendo amidapodem incluir formas naturais de asparaginas, asparagina anidra, monoidra-to de asparagina, formas naturais de glutamina, glutamina anidra e/ou mo-noidrato de glutamina, cada um na forma de isômero L ou isômero DL.

A concentração dos aminoácidos contendo amida, ou seus deri-vados, no meio pode variar dependendo do resultado final desejado da cultu-ra. Por exemplo, uma cultura pode ser realizada para o propósito de produ-ção de microorganismos tendo uma atividade enzimática específica. Em ou-tras modalidades, uma cultura pode ser realizada para o propósito de forma-ção e coleta de uma enzima específica a partir dos microorganismos cultu-rados. Em modalidades adicionais, uma cultura pode ser realizada para opropósito de formação e coleta de uma pluralidade de enzimas tendo fun-ções e atividades iguais ou diferentes.

A quantidade dos aminoácidos contendo amida, ou seus deriva-dos, adicionados ao meio ou mistura de crescimento pode geralmente seraté cerca de 10.000 ppm (isto é, cerca de 1% em peso) com base no pesogeral do meio ou mistura. A presente invenção é particularmente benéfica,no entanto, pelo fato de que a atividade de enzima pode ser induzida atravésda adição de quantidades ainda menores. Por exemplo, em certas modali-dades, a concentrações dos aminoácidos contendo amida, ou seus deriva-dos, está na faixa de cerca de 50 ppm a cerca de 5.000 ppm, cerca de 100ppm a cerca de 3.000 ppm, cerca de 200 ppm a cerca de 2.000 ppm, cercade 250 ppm a cerca de 1500 ppm, cerca de 500 ppm a cerca de 1250 ppmou cerca de 500 ppm a cerca de 1000 ppm.

De preferência, os aminoácidos contendo amida, ou seus deri-vados, são adicionados a um meio nutricionalmente completo. Um meio nu-tricionalmente completo adequado geralmente é um meio de crescimentoque pode fornecer um microorganismo com os nutrientes necessários reque-ridos para seu crescimento, que inclui minimamente uma fonte de carbonoe/ou nitrogênio. Um exemplo específico de um meio útil é o meio de ÁgarR2A comercialmente disponível, que consiste tipicamente em Ágar, extratode levedura, peptona proteose, hidrolisato de caseína, glicose, amido solú-vel, piruvato de sódio, hidrogenofosfato de dipotássio e sulfato de magnésio.Outro exemplo de um meio líquido nutricionalmente completo útil de acordocom a presente invenção é Yeast Extract Malt Extract Ágar (YEMEA), queconsiste em glicose, extrato de malte e extrato de levedura (mas especifica-mente exclui ágar). Com certeza, qualquer meio nutricionalmente completoútil na técnica poderia ser usado de acordo com a presente invenção, o meioacima sendo descrito para propósitos exemplares apenas.

Em modalidades adicionais, os métodos da invenção podemcompreender o uso de aditivos adicionais para o meio nutricionalmentecompleto. Tipicamente, os outros suplementos ou nutrientes úteis de acordocom a invenção são aqueles úteis para auxiliar em crescimento celular mai-or, massa celular maior ou crescimento acelerado. Por exemplo, em umamodalidade, o meio nutricionalmente completo pode compreender uma fontede carboidrato em adição a qualquer fonte de carboidrato já presente nomeio nutricionalmente completo.

Conforme acima descrito, a maioria dos meios tipicamente con-tém algum teor de carboidrato (por exemplo, glicose); no entanto, de acordocom a presente invenção, pode ser útil incluir uma fonte de carboidrato adi-cional. O tipo de carboidrato em excesso provido pode depender do resulta-do desejado da cultura. Por exemplo, em modalidades específicas, a adiçãode carboidratos, tal como maltose ou maltodextrina, foi verificada prover in-dução aperfeiçoada de asparaginase.

Em outra modalidade, cobalto, ou um sal dele, pode ser adicio-nado à mistura ou meio. Por exemplo, a adição de cobalto (por exemplo,cloreto de cobalto) ao meio pode ser particularmente útil para aumento damassa da enzima produzida pelos microorganismos culturados. Em certasmodalidades, cobalto, ou um seu sal, pode ser adicionado ao meio de cultu-ra de modo que a concentração de cobalto esteja em uma quantidade de atécerca de 100 ppm. De preferência, cobalto está presente em uma concen-tração de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm, cerca de 10 ppm a cerca de75 ppm, cerca de 10 ppm a cerca de 50 ppm ou cerca de 10 ppm a cerca de 25 ppm.

Em modalidades adicionais, uréia, ou um seu sal, pode ser adi-cionada à mistura ou meio. Em certas modalidades, uréia, ou um seu sal,pode ser adicionada ao meio de cultura de modo que a concentração de u-réia esteja em uma quantidade de até cerca de 10 g/L. De preferência, uréiaestá presente em uma concentração de cerca de 5 g/L a cerca de 100 g/L,cerca de 10 g/L a cerca de 75 g/L, cerca de 10 g/L a cerca de 50 g/L ou cer-ca de 10 g/L a cerca de 25 g/L. Em modalidades específicas, uréia está pre-sente em uma concentração de cerca de 7,5 g/L.

O meio pode também incluir componentes adicionais sem seafastar da presente invenção. Por exemplo, outros componentes do meioadequados podem incluir aditivos comerciais, tal como proteína de sementede algodão, maltose, maltodextrina e outros carboidratos comerciais.

A presente invenção é particularmente caracterizada pelo fato deque indução e estabilização de enzimas, e microorganismos capazes deprodução das enzimas, podem ser conseguidas sem a necessidade de nitri-Ias perigosas. Conforme anteriormente apontado, a indução de muitos tiposde atividade de enzima, tal como atividade de nitrilo hidratase, tem tradicio-nalmente incluído suplementação com nitrilas, tal como acetonitrila, acriloni-trila, succinonitrila e similar. Além disso, se indução múltipla fosse desejada(isto é, indução de atividade em uma enzima única para degradar dois oumais tipos de nitrila), era geralmente necessário incluir dois ou mais tipos denitrilas perigosas. A presente invenção, particularmente surgindo do uso deaminoácidos contendo amida, e seus derivados, como indutores enzimáticoselimina a necessidade de agentes químicos perigosos para facilitar induçãoenzimática única ou múltipla. Particularmente, a presente invenção é benéfi-ca pelo fato de que indução múltipla é possível através do uso de aminoáci-dos contendo amida, ou seus derivados, no meio de cultura ou mistura. No-vamente, isto é especialmente surpreendente como compostos nitrila múlti-pios eram previamente requeridos no meio de cultura para induzir atividadede enzima em direção a dois ou mais compostos nitrila. No entanto, a pre-sente invenção atinge esta característica particularmente útil através do usode aminoácidos contendo amida completamente seguros. Então, a presenteinvenção é particularmente útil para preparação de uma enzima ou microor-ganismo tendo atividade para degradação de uma pluralidade de compostoscontendo nitrila. Além disso, os métodos da invenção provêem a habilidadeem desintoxicar uma variedade de nitrilas ou amidas, tal como nitrilas tendouma porção C^N simples, dinitrilas (compostos tendo duas porções ΟξΝ) oucompostos tendo porções nitrila múltiplas (por exemplo, acroleína cianoidri-na). Tais enzimas, ou microorganismos, são aqui referidos como sendo mul-tiplamente induzidos.

Embora a presente invenção elimine a necessidade de agentesquímicos perigosos para indução de atividade de enzima, o uso de tais indu-tores adicionais não é excluído. Por exemplo, em modalidades específicas,uma ou mais nitrilas poderiam ser usadas para auxiliar no desenvolvimentode atividade específica. Por exemplo, meios suplementados com succinoni-trila e cobalto podem ser úteis para indução de atividade de asparaginase I.No entanto, o uso de nitrilas não é necessário para indução de atividade deasparaginase I. Ao contrário, embora o uso de nitrilas e outros agentes quí-micos perigosos seja certamente não preferido de acordo com a invenção,em modalidades específicas, tal uso é possível.

Uma variedade de microorganismos pode ser cultivada para usode acordo com a presente invenção. Em geral, quaisquer microorganismoscapazes de produzir enzimas tendo atividade útil, conforme aqui descrito,podem ser usados na invenção. Em modalidades particulares, os microorga-nismos úteis de acordo com a invenção compreendem microorganismos ca-pazes de produzir nitrilo hidratase.

Conforme aqui usado, microorganismos produtores de nitrilo hi-dratase pretendem se referir a microorganismos que, embora geralmentesendo reconhecidos como sendo capazes de produzir nitrilo hidratase, sãotambém capazes de produzir uma ou mais enzimas adicionais. Conformeaqui descrito mais, a maioria dos microorganismos é capaz de produzir umavariedade de enzimas, tal produção freqüentemente sendo determinada peloambiente do microorganismo. Então, embora microorganismos para uso deacordo com a invenção possam ser descritos como microorganismos produ-tores de nitrilo hidratase, tal linguagem apenas refere-se à habilidade conhe-cida de tais microorganismos em produzir nitrilo hidratase e não limita osmicroorganismos a apenas a produção de nitrilo hidratase. Pelo contrário,um microorganismo produtor de nitrilo hidratase útil de acordo com a inven-ção é um microorganismo capaz de produzir pelo menos nitrilo hidratase(isto é, capaz de produzir nitrilo hidratase ou nitrilo hidratase e uma ou maisenzimas adicionais).

Vários organismos produtores de nitrilo hidratase são conheci-dos na técnica. Por exemplo, bactérias pertencentes ao gênero Nocardia[vide Pedido de Patente Japonês Ne 54-129190], Rhodococcus [vide Pedidode Patente Japonês Nq 2-470], Rhizobium [vide Pedido de Patente JaponêsNe 5-236977], Klebsiella [Pedido de Patente Japonês Ns 5-30982], Aeromo-nas [Pedido de Patente Japonês Nq 5-30983], Agrobacterium [Pedido de Pa-tente Japonês N9 8-154691], Bacillus [Pedido de Patente Japonês N5 8-187092], Pseudonoeardia [Pedido de Patente Japonês Ns 8-56684] e Pseu-domonas são exemplos não-limitantes de microorganismos produtores denitrilo hidratase que podem ser usados de acordo com a invenção.

Ainda, exemplos específicos de microorganismos úteis de acor-do com a invenção incluem, mas não estão limitados a, Noeardia sp., Rho-doeoeeus sp., Rhodoeoeeus rhodoehrous, Klebsiella sp., Aeromonas sp.,Citrobaeter freundii, Agrobaeterium rhizogenes, Agrobaeterium tumefaeiens,Xanthobaeter flavas, Erwinia nigrifluens, Enterobaeter sp., Streptomyees sp.,Rhizobium sp., Rhizobium Ioti, Rhizobium legminosarum, Rhizobium merioti,Candida guilliermondii, Pantoea agglomerans, Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae, Agrobaeterium radiobaeter, Bacillus smithii, Pseudonoeardiathermophila, Pseudomonas ehloroaphis, Pseudomonas erythropolis, Brevi-baeterium ketoglutamieum, Rhodoeoeeus erythropolis e Pseudonoeardiathermophila. Em modalidades particularmente preferidas, microorganismosusados de acordo com a invenção compreendem Rhodococcus sp. DAP96253 e DAP 96255 e Rhodococcus rhodoehrous DAP 96622.

Em modalidades adicionais, microorganismos úteis de acordocom a invenção podem também incluir transformantes. Em particular, ostransformantes podem ser qualquer hospedeiro onde um gene de nitrilo hi-dratase clonado de um microorganismo conhecido incluir tal gene é inseridoe expresso. Por exemplo, a Patente dos Estados Unidos N9 5.807.730 des-creve o uso de Eseheriehia eoli como um hospedeiro para a linhagem debactéria MT-10822 (FERM BP-5785). Com certeza, outros tipos de bactériasgeneticamente engenheiradas poderiam ser usados de acordo com a inven-ção contanto que as bactérias sejam capazes de produzir uma ou mais en-zimas úteis na invenção, conforme aqui descrito.

Nem todas as espécies dentro de um dado gênero exibem omesmo tipo de atividade e/ou produção de enzima. Então, é possível ter umgênero geralmente conhecido incluir linhagens capazes de exibir uma ativi-dade desejada, mas ter uma ou mais espécies que não exibem geralmente aatividade desejada. Então, em modalidades adicionais, microorganismoshospedeiro podem incluir linhagens de bactérias que não são especificamen-te conhecidas ter a atividade desejada, mas são de um gênero conhecido terlinhagens específicas capazes de produzir a atividade desejada. Tais linha-gens podem ter transferidas para elas um ou mais gene útil para causar aatividade desejada. Exemplos não-limitantes de tais linhagens incluem Rho-doeoeeus equie Rhodoeoeeus globerulus PWD1.

Atividade enzimática, conforme aqui usado, geralmente refere-seà habilidade de uma enzima em agir como um catalisador em um processo,tal como a conversão de um composto em outro composto. Da mesma ma-neira, a atividade desejada referida aqui pode incluir a atividade de uma oumais enzimas sendo ativamente expressas por um ou mais microorganismos.

Em certas modalidades, atividade pode ser referida em termosde "unidades" por massa de enzima ou células (tipicamente com base nopeso seco das células, por exemplo, unidades/mg cdw). Uma "unidade" ge-ralmente se refere à habilidade em converter um teor específico de um com-posto em um composto diferente sob um conjunto de condições definidocomo uma função de tempo. Em modalidades específicas, 1 "unidade" deatividade de nitrilo hidratase pode se relacionar com a habilidade em conver-ter 1 μιτιοΙ de acrilonitrila em sua amida correspondente por minuto, por mili-grama de células (peso seco) em um pH de 7,0 e uma temperatura de 30°C.Similarmente, 1 unidade de atividade de amidase pode ser relacionar com ahabilidade em converter 1 μιτιοΙ de acrilamida em seu ácido correspondentepor minuto, por miligrama de células (peso seco) em um pH de 7,0 e tempe-ratura de 30°C. Ainda, 1 unidade de atividade de asparaginase I pode serelacionar com a habilidade em converter 1 μιτιοΙ de asparagina em seu áci-do correspondente por minuto, por miligrama de células (peso seco) em umpH de 7,0 e uma temperatura de 30°C.

Em modalidades preferidas, a presente invenção é particular-mente caracterizada pela habilidade em induzir uma atividade desejada queé maior do que possível usando métodos previamente conhecidos. Por e-xemplo, em uma modalidade, a invenção permite a indução de atividade denitrilo hidratase em um microorganismo produtor de nitrilo hidratase que émaior do que ou igual à atividade produzida no mesmo microorganismo atra-vés da indução com um composto contendo nitrila. Em modalidades preferi-das, a atividade de nitrilo hidratase produzida é maior do que a atividadeproduzida no mesmo microorganismo pela indução com um composto con-tendo nitrila. Por exemplo, a atividade de nitrilo hidratase produzida de acor-do com os métodos da invenção pode ser pelo menos 5% maior do que aatividade produzida no mesmo microorganismo pela indução com um com-posto contendo nitrila. De preferência, a atividade de nitrilo hidratase produ-zida de acordo com o método da invenção é pelo menos 10%, pelo menos12% ou pelo menos 15% maior do que a atividade produzida no mesmo mi-croorganismo pela indução com um composto contendo nitrila.

Os microorganismos úteis de acordo com a invenção podem serselecionados de fontes conhecidas (tal como aquelas acima descritas) oupodem compreender microorganismos recém-isolados. Em uma modalidadeda invenção, microorganismos adequados com a presente invenção podemser isolados e identificados como linhagens de microorganismo úteis atravésde cultivo das linhagens na presença de uma mistura de aminoácidos con-tendo amida ou seus derivados. O microorganismo pode ser isolado ou sele-cionado ou obtido de fontes conhecidas ou pode ser avaliado a partir de fon-tes futuras com base na habilidade em desintoxicar uma mistura de nitrilasou uma mistura de nitrila e compostos amida ou uma mistura de amidas paraa amida e/ou ácido correspondente após indução múltipla de acordo com apresente invenção. À luz da descrição provida aqui, seria uma questão deexperimentação de rotina para um versado na técnica realizar um ensaiopara determinar se o microorganismo seria útil de acordo com a presenteinvenção. Por exemplo, em um ensaio, a presença de atividade de nitrilohidratase ou amidase pode ser determinada através da detecção de amônialivre. Vide Fawcett, J.K. e Scott, J.E. 1960, "A Rapid and Precise Method forthe Determination of Urea", J. Clin. Pathol. 13:156-159, que é incorporadoaqui a título de referência.

A presente invenção provê beneficamente métodos para cultivode microorganismos, particularmente microorganismos produtores de nitrilohidratase. Em certas modalidades, a invenção refere-se a métodos para in-dução de uma atividade de enzima desejada em microorganismos, tal comoenzimas produtoras de nitrilo hidratase. De preferência, o método compre-ende cultura de um microorganismo produtor de nitrilo hidratase em um meiocompreendendo um ou mais aminoácidos contendo amida, ou seus deriva-dos. Em uma modalidade, a invenção provê um método para indução deatividade de desintoxicação de nitrila usando um meio suplementado comaminoácidos contendo amida, ou seus derivados, que de preferência incluiasparagina, glutamina ou sua combinação. Mais particularmente, o métodocompreende cultura do microorganismo no meio e opcionalmente coleta dosmicroorganismos culturados ou enzimas produzidas pelos microorganismos.

Os microorganismos podem ser culturados e coletados de acor-do com métodos úteis para atingir biomassa ótima. Em certas modalidades,tal como quando culturados em placas de Ágar, os microorganismos podemser culturados por um período de pelo menos cerca de 24 mas geralmentemenos do que seis dias. Quando culturados em um fermentador, os micro-organismos são de preferência culturados em um meio mínimo por um perí-odo de cerca de 1 hora a cerca de 48 horas, cerca de 1 hora a cerca de 20horas ou cerca de 16 horas a cerca de 23 horas. Se uma biomassa maior fordesejada, os microorganismos podem ser culturados em um fermentador porperíodos de tempo mais longos. No final do período de cultura, os microor-ganismos culturados são tipicamente coletados e concentrados, por exem-plo, através de raspagem, centrifugação, filtragem ou qualquer outro métodoconhecido daqueles versados na técnica.

Em modalidades específicas, os microorganismos podem serculturados sob condições especificadas adicionais. Por exemplo, cultura éde preferência realizada em um pH entre cerca de 3,0 e cerca de 11,0, commais preferência entre cerca de 6,0 e cerca de 8,0. A temperatura na qualcultura é realizada está de preferência entre cerca de 4°C e cerca de 55°C,com mais preferência entre cerca de 15°C e cerca de 37°C. Ainda, a tensãode oxigênio dissolvido está de preferência entre cerca de 0,1% e 100%, depreferência entre cerca de 4% e cerca de 80% e com mais preferência entrecerca de 4% e cerca de 30%. A tensão de oxigênio dissolvido pode ser mo·nitorada e mantida na faixa desejada através de fornecimento de oxigênio naforma de ar ambiente, oxigênio puro, peróxido e/ou outras composições queliberam oxigênio.

É também possível de acordo com a presente invenção separaras etapas de cultivo de microorganismo e indução de atividade de enzima.Por exemplo, é possível de acordo com a invenção cultivar um ou mais mi-croorganismos em um primeiro meio que não inclui suplementação necessá-ria para induzir atividade de enzima. Tal pode ser referido como uma fase decrescimento para os microorganismos. Em uma segunda fase (isto é, umafase de indução), os microorganismos culturados podem ser transferidospara um segundo meio compreendendo suplementação necessária para in-duzir atividade enzimática. Tal segundo meio compreenderia de preferênciaos aminoácidos contendo amida, ou seus derivados, conforme aqui descrito.Similarmente, os suplementos de indução podem ser adiciona-dos em qualquer momento durante o cultivo dos microorganismos deseja-dos. Por exemplo, os meios podem ser suplementados com aminoácidoscontendo amida, ou seus derivados, antes do começo do cultivo dos micro-organismos. Alternativamente, os microorganismos poderiam ser cultivadosem um meio por uma quantidade predeterminada de tempo para cultivar omicroorganismo, e aminoácidos contendo amida, ou seus derivados, poderi-am ser adicionados em um ou mais momentos predeterminados para induzira atividade desejada no microorganismo. Além disso, os aminoácidos con-tendo amida, ou seus derivados, poderiam ser adicionados ao meio de cres-cimento (ou a uma mistura separada incluindo os microorganismos previa-mente cultivados) para induzir a atividade desejada nos microorganismosapós o crescimento dos microorganismos estar completo.

Conforme acima mencionado, os métodos da invenção são par-ticularmente úteis para indução de uma atividade de enzima desejada. Mui-tos tipos de microorganismos, incluindo aqueles descritos aqui, são capazesde produzir uma variedade de enzimas tendo uma variedade de atividades.Como é geralmente conhecido na técnica, o tipo de atividade de enzima in-duzida em cultivo de microorganismos pode variar dependendo da linhagemde microorganismo usada, do método de cultivo usado e da suplementaçãousada com os meios de crescimento. A presente invenção surpreendente-mente permite a indução de uma variedade de atividades de enzima atravésdo uso de aminoácidos contendo amida, ou seus derivados. Em modalida-des preferidas, a presente invenção provê a indução de uma ou mais enzi-mas selecionadas do grupo consistindo em nitrilo hidratase, amidase e aspa-raginase I. Em modalidades específicas, tais enzimas são induzidas atravésda cultura de uma ou mais bactérias a partir do gênero Rhodococus em ummeio compreendendo um ou mais aminoácidos contendo amida ou seus de-rivados.

Em modalidades particulares, a invenção permite a indução si-multânea de ambas nitrilo hidratase e amidase. Isto é particularmente útilpara aplicações industriais, tal como tratamento de correntes de refugo con-tendo nitrila. Tais tratamentos requerem um primeiro tratamento para conver-ter nitrilas em amidas e um segundo tratamento para converter amidas emácidos. A habilidade em simultaneamente produzir nitrilo hidratase e amida-se removeria a necessidade de separadamente preparar as enzimas e per-mitiria essencialmente uma única etapa de tratamento.

Em modalidades adicionais, a invenção particularmente provê aindução de atividade de asparaginase I. Surpreendentemente, foi constatadoque atividade de asparaginase I pode ser induzida em Rhodococcus rhodoc-hrous, DAP 96622 (Gram positiva) ou Rhodococcus sp., DAP 96253 (Grampositiva), em meio suplementado com amida contendo aminoácidos, ou seusderivados. Outras linhagens de Rhodoeoceus podem ser também de prefe-rência usadas de acordo com esta modalidade da invenção. Ainda outraslinhagens capazes de produzir asparaginase I incluem Pseudomonas ehio-roaphis (ATCC 43051) (Gram positiva), Pseudomonas ehloroaphis (ATCC13985) (Gram positiva), Rhodoeoceus erythropolis (ATCC 47072) (Gram po-sitiva) e Brevibacterium ketoglutamieum (ATCC 21533) (Gram positiva). En-tão, a presente invenção é ainda benéfica pelo fato de que ela permite a in-dução de atividade de asparaginase I em bactérias Gram positivas.

A atividade desejada (por exemplo, atividade de nitrilo hidratase,amidase ou asparaginase I) dos microorganismos colheitados, uma vez in-duzida de acordo com os métodos descritos aqui, pode ser beneficamenteestabilizada. Uso comercial de enzimas para o tratamento de água de refu-go, bem como outros usos comerciais de várias enzimas, é geralmente limi-tado pela instabilidade da atividade induzida. Por exemplo, células frescasvão tipicamente perder pelo menos 50% de sua atividade inicial dentro de 24horas em uma temperatura de 25°C. Então, quando células devem ser usa-das como um catalisador, as células devem ser feitas na hora que necessá-rias e não podem ser armazenadas para uso futuro. Atividade de nitrilo hi-dratase pode ser estabilizada através da adição de compostos contendo ni-trila; no entanto, isto novamente necessita do uso de agentes químicos peri-gosos, indesejados. A presente invenção novamente resolve este problema.Por exemplo, células tendo atividade de nitrilo hidratase induzida podem serestabilizadas de acordo com a presente invenção, sem a necessidade deagentes químicos perigosos, de modo que as células têm uma atividade en-zimática viável por um período de tempo de até um ano. Então, a presenteinvenção estabiliza enzimas, ou microorganismos capazes de produzir taisenzimas, de modo que a atividade prática da atividade induzida é estendidabastante além do período típico de atividade útil.

Em uma modalidade, tal estabilização é provida pela adição deum ou mais aminoácidos contendo amida, ou seus derivados. Os aminoáci-dos contendo amida, ou seus derivados, podem ser adicionados aos micro-organismos no momento da cultura dos microorganismos ou podem ser adi-cionados a uma mistura compreendendo microorganismos induzidos na ati-vidade de enzima, células ou enzimas de subunidade. Qualquer amida con-tendo aminoácidos, ou derivados dela, conforme previamente descrito aquipode ser usada para estabilização de atividade induzida de acordo com estamodalidade da invenção.

Em modalidades adicionais, estabilização pode ser provida, deacordo com a invenção, através da imobilização dos microorganismos dacultura, ou células deles. Por exemplo, células colheitadas dos microorga-nismos, enzimas colheitadas dos microorganismos ou os próprios microor-ganismos induzidos, podem ser imobilizados para um substrato como ummeio para estabilizar a atividade induzida. Em certas modalidades, as enzi-mas, células ou microorganismos são pelo menos parcialmente aprisionadosno substrato.

Qualquer substrato geralmente útil para fixação de células, en-zimas ou microorganismos pode ser usado de acordo com a invenção. Emuma modalidade, o substrato compreende alginato, ou seus sais. Alginato éum copolímero linear com blocos homopoliméricos de β-D-manuronato (M)(1-4)-ligado e seus resíduos de α-L-glucuronato de epímero em C-5, respec-tivamente, covalentemente ligados juntos em seqüências ou blocos diferen-tes. Os monômeros podem aparecer em blocos homopoliméricos de resí-duos G consecutivos (blocos G), resíduos M consecutivos (blocos M), resí-duos MeG alternados (blocos MG) ou blocos aleatoriamente organizados.Em uma modalidade preferida, alginato de cálcio é usado como o substrato.Particularmente preferido é alginato de cálcio que foi reticulado, tal comocom polietilenoimina, para formar um substrato de alginato de cálcio endure-cido. Descrição adicional de tais técnicas de imobilização pode ser encon-trada em Bucke1 C. (1987), "Cell Immobilization in Calcium Alginate", Me-thods in Enzymology, volume 135, Parte B (ed. K. Mosbach) pp. 175-189,que é aqui incorporado a título de referência. O efeito de estabilização deimobilização usando alginato de cálcio reticulado com polietilenoimina é ilus-trado na FIGURA 1, que é descrita mais abaixo no Exemplo 2.

Em outra modalidade, o substrato compreende um polímero con-tendo amida. Qualquer polímero compreendendo um ou mais grupos amidapoderia ser usado de acordo com a invenção. Em uma modalidade preferida,o substrato compreende um polímero de poliacrilamida. O efeito de estabili-zação de imobilização usando poliacrilamida é ilustrado na FIGURA 2, que édescrito mais abaixo no Exemplo 3.

Estabilização pode ser conseguida mais, de acordo com a in-venção, através de reticulação. Por exemplo, células colheitadas de um mi-croorganismo induzido podem ser quimicamente reticuladas para formar a-glutinação de células. Em uma modalidade preferida, células colheitadas deum microorganismo induzido são reticuladas usando glutaraldeído. Por e-xemplo, células podem ser suspensas em uma mistura de água deionizada eglutaraldeído seguido pela adição de polietilenoimina até floculação máximaser conseguida. As células reticuladas (tipicamente na forma de partículasformadas de várias células) podem ser colheitadas através de filtragem sim-pies. Descrição adicional de tais técnicas é provida em Lopez-Gallego e ou-tros, "Enzyme Stabilization by Glutaraldehyde Crosslinking of Absorbed Pro-teína on Aminated Supports", J. Biotechnol. 119:70-75, que é aqui incorpo-rado a título de referência. O efeito de estabilização de reticulação com glu-taraldeído é ilustrado na FIGURA 4, que é descrito mais abaixo no Exemplo 5.

Em outra modalidade, os microorganismos podem ser encapsu-Iados ou imobilizados ao invés de deixados permanecer no movimentoBrowniano clássico. Tal imobilização facilita coleta, retenção e reutilizaçãodos microorganismos e geralmente compreende fixação dos microorganis-mos a um substrato. Tal fixação pode também facilitar a estabilização dosmicroorganismos, conforme acima descrito, ou pode ser apenas para facili-dade de manuseamento dos microorganismos induzidos ou enzimas.

Os microorganismos podem ser imobilizados através de qual-quer método geralmente reconhecido como útil para imobilização de micro-organismos, tal como absorção, ligação eletrostática, ligação covalente esimilar. Geralmente, os microorganismos são imobilizados em um apoio sóli-do que auxilia na recuperação dos microorganismos a partir de uma misturaou solução, tal como mistura de reação de desintoxicação. Apoios sólidosincluem, mas não estão limitados a, carbono ativado granular, composto,produtos de resíduo de madeira (por exemplo, lascas de madeira, madeira,"nuggets", ripas cortadas em pedaço ou árvores), partículas de metal ou óxi-do de metal (por exemplo, alumina, rutênio, óxido de ferro), resinas de trocade íon, DEAE celulose, polímero DEAE-SEPHADEX®, contas de cerâmica,contas de poliacrilamida reticuladas, cubos, grânulos, ou outras formas degel, contas de alginato, cubos de κ-carragenana, bem como partículas sóli-das que podem ser recuperadas das soluções aquosas devido à habilidademagnética inerente. O formato do catalisador é variável (pelo fato de que aspropriedades dinâmicas da entidade particular são integradas com relaçõesde volume/área de superfície que influenciam a atividade do catalisador. Emmodalidades preferidas, o microorganismo induzido é imobilizado em contasque foram reticuladas com polietilenoimina ou é imobilizado em um polímerodo tipo poliacrilamida.

Em modalidades específicas, a invenção provê métodos paradesintoxicação de uma mistura de nitrilas através da conversão das nitrilasnas amidas ou ácidos correspondentes. Em uma modalidade, o métodocompreende aplicação de uma cultura de microorganismos de degradaçãode nitrila a uma mistura de nitrilas e multiplamente indução de microorga-nismos com uma mistura de aminoácidos contendo amida, ou seus deriva-dos, por uma quantidade de tempo suficiente para converter as nitrilas nasamidas correspondentes. Alternativamente, o método compreende aplicaçãode microorganismos multiplamente induzidos a uma mistura de nitrilas poruma quantidade de tempo suficiente para converter as nitrilas nas amidascorrespondentes.

Quando os microorganismos são aplicados a uma corrente derefugo, os microorganismos podem estar crescendo (ativamente dividindo)ou descansando (não ativamente se dividindo). Quando o método requeraplicação de uma cultura ativamente crescente de microorganismos, as con-dições de aplicação são de preferência tais de modo que crescimento bacte-riano é apoiado ou sustentado. Quando o método requer a aplicação de umacultura de microorganismos que não estão se dividindo ativamente, as con-dições de aplicação são de preferência tais de modo que atividades enzimá-ticas são apoiadas.

Em modalidades específicas, a presente invenção pode ser usa-da para tratar correntes de refugo de uma instalação de produção tendo re-fugo que tipicamente contém altas concentrações de nitrila, cianoidrina(s) ououtros agentes químicos sujeitos à degradação enzimática. Por exemplo, ainvenção provê um método de desintoxicação para desintoxicar uma misturade compostos nitrila ou uma mistura de compostos nitrila e amida em umacorrente de refugo aquosa de uma instalação de produção de nitrila. Ainda, apresente invenção poderia ser usada para tratamento de correntes de refugona produção de acrilonitrila butadieno estireno (ABS), onde acrilonitrila é u-sada na produção de ABS.

A presente invenção também provê um biofiltro que pode serusado na desintoxicação de misturas de compostos nitrila, misturadas decompostos nitrila e amida e misturas de compostos amida em efluentes talcomo ar, vapores, aerossóis e água ou soluções aquosas. Por exemplo, secompostos nitrila voláteis estiverem presentes, os voláteis podem ser retira-dos de solução sólida ou aquosa onde eles são encontrados e etapas devemser realizadas de tal maneira que os voláteis são aprisionados em um biofil-tro. Uma vez aprisionados, os voláteis podem ser desintoxicados com umacultura pura ou um extrato de um microorganismo, conforme aqui descrito.A presente invenção também provê estojos compreendendouma cultura de um microorganismo que foi multiplamente induzido e é capazde desintoxicar uma mistura de compostos nitrila, uma mistura de compostosnitrila e amida ou uma mistura de compostos amida. O microorganismo podeestar ativamente se dividindo ou liofilizado e pode ser adicionado diretamen-te a uma solução aquosa contendo os compostos nitrila e/ou amida. Em umamodalidade preferida, o estojo compreende uma amostra liofilizada induzida.O microorganismo pode ser também imobilizado em um apoio sólido, con-forme aqui descrito. Outros componentes do estojo podem incluir, por exem-pio, uma mistura de suplementos de indução, conforme aqui descrito, paraindução dos microorganismos, bem como outros componentes do estojo, talcomo frascos, componentes de embalagem, e similar, que são conhecidosdaqueles versados na técnica.

EXPERIMENTAL

A presente invenção será agora descrita com referência especí-fica a vários exemplos. Os exemplos que seguem não pretendem ser limitan-tes da invenção e são ao contrário providos como modalidades exemplares.

EXEMPLO 1

Indução de Nitrilo Hidratase e Amidase

A indução de atividade de nitrilo hidratase e atividade de amida-se em Rhodococcus sp., linhagem DAP 96253, foi avaliada usando tiposmúltiplos de indutores (1000 ppm). Três amostras diferentes foram cultura-das em meio YEMEA contendo 10 ppm de cobalto e 7,5 g/L de uréia e su-plementado com acrilonitrila, asparagina ou glutamina. A atividade de nitrilohidratase específica e a atividade de amidase específica em cada amostraforam avaliadas, e os resultados são providos abaixo na Tabela 1, com ativi-dades providas em unidades/mg cdw (peso seco de célula). Uma unidade deatividade de nitrilo hidratase refere-se à habilidade em converter 1 pmol deacrilonitrila em sua amida correspondente por minuto, por miligrama de célu-las (peso seco) em um pH de 7,0 e uma temperatura de 30°C. Uma unidadede atividade de amidase refere-se à habilidade em converter 1 pmol de acri-lamida em seu ácido correspondente por minuto, por miligrama de células(peso seco) pH de 7,0 e uma temperatura de 30°C.

Tabela 1

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Conforme visto na Tabela 1, o uso de asparagina ou glutaminacomo um indutor para atividade de nitrilo hidratase excede a habilidade deacrilonitrila em induzir tal atividade. Além disso, o uso de glutamina como umindutor resultou em atividade de amidase aproximadamente 37% maior doque a atividade de amidase resultando do uso de acrilonitrila, e asparaginaproveu aproximadamente 74% de atividade maior do que acrilonitrila.

EXEMPLO 2

Estabilização de Atividade de Nitrilo Hidratase Usando !mobilização em Algi-nato de Cálcio

Teste foi realizado para avaliar a estabilidade relativa de célulasinduzidas para atividade de nitrilo hidratase usando asparagina no meio decultura. Rhodococcus sp., linhagem DAP 96253, foi culturada usando ummeio de cultura padrão sozinho ou suplementado com asparagina. Célulasforam recuperadas da cultura e imobilizadas em contas de alginato de cálcio(2-3 mm de diâmetro). Para preparar as contas, 25 g de uma solução de al-ginato de sódio a 4% (1 g de alginato de sódio em 24 ml de TRIS-HCI a 5mM - pH 7,2) foram preparados e 25 mg de meta-periodato de sódio foramdissolvidos neles (agitados a 25°C por 1 hora ou até que todo o alginato ti-vesse dissolvido). As células para imobilização foram suspensas em TRIS-HCI a 50 mM para um volume final de 50 ml, e a solução de célula foi adicio-nada à mistura de alginato enquanto agitando. Contas foram formadas ex-trudando a mistura através de uma agulha hipodérmica de 27G em 500 mlde CaCl2 a 0,1 M. As contas foram curadas por 1 hora na solução de CaCI2 elavadas com água.

Quatro amostras foram preparadas para avaliação: Amostra 1 -contas formadas com células culturadas sem asparagina, mas com aspara-gina adicionada à mistura incluindo as contas; Amostra 2 - contas formadascom células culturadas com asparagina e tendo asparagina adicionada àmistura incluindo as contas; Amostra 3 - contas formadas com células cultu-radas com asparagina e tendo uma mistura de acrilonitrila e acetonitrila adi-cionada à mistura incluindo as contas; e Amostra 4 - contas formadas comcélulas culturadas com acrilonitrila e acetonitrila e tendo asparagina adicio-nada à mistura incluindo as contas. Nas Amostras 3 e 4, acrilonitrila e aceto-nitrila foram adicionadas em uma concentração de 500 ppm cada. Em cadauma das amostras 1 -4, asparagina foi adicionada a 1000 ppm.

As células imobilizadas foram mantidas por um tempo de cercade 150 horas e periodicamente avaliadas quanto à atividade de nitrilo hidra-tase restante. Os resultados do teste são ilustrados na FIGURA 1. Para ava-liação de atividade estabilizada, quantidades equivalentes de células foramtestadas, e a atividade de uma alíquota equivalente de células integrais notempo 0 foi ajustada como 100%. Alíquotas equivalentes de catalisador fo-ram incubadas na temperatura apropriada. Nos momentos apropriados, umaalíquota inteira foi removida da incubação e a atividade de enzima determi-nada. Para as primeiras 10 horas amostras foram avaliadas a cada 2 horas.De 10-60 horas amostras foram avaliadas a cada 4 horas e em seguida a-mostras foram avaliadas a cada 12 horas.

Conforme visto na FIGURA 1, imobilização de células induzidasem alginato de cálcio provê estabilização de atividade de nitrilo hidrataseque é muito similar ao nível de estabilização que pode ser atingido usandocompostos contendo nitrila perigosos, mas sem as desvantagens (por e-xemplo, questões de saúde e reguladoras).

EXEMPLO 3

Estabilização de Atividade de Nitrilo Hidratase Usando Imobilização em Poli-acrilamida

Teste foi realizado para avaliar a estabilidade relativa de célulasinduzidas para atividade de nitrilo hidratase usando asparagina no meio decultura. Rhodococcus sp., linhagem DAP 96253, foi culturada usando ummeio de cultura padrão suplementado com asparagina. As células foram re-cuperadas da cultura e imobilizadas em cubos de poliacrilamida reticulada(2,5 mm χ 2,5 mm χ 1 mm). A solução de poliacrilamida foi preparada, e acarga desejada de células foi adicionada. A poliacrilamida com as células foireticulada para formar um gel, que foi cortado nos cubos apontados. Quais-quer estabilizadores conhecidos adicionais foram adicionados à poliacrilami-da. Duas amostras foram preparadas para avaliação: Amostra 1 - cuboscom carga celular baixa (preparada com suspensão compreendendo 1 g decélulas por 40 ml_ de suspensão celular); e Amostra 2 - cubos com cargacelular alta (preparada com suspensão compreendendo 4 g de células por40 ml de suspensão celular).

As células imobilizadas foram mantidas por um tempo de cercade 150 dias e periodicamente avaliadas quanto à atividade de nitrilo hidrata-se restante. Os resultados do teste são ilustrados na FIGURA 2. Para avali-ação de atividade estabilizada, quantidades equivalentes de células foramtestadas, e a atividade de uma alíquota equivalente de células integrais nomomento 0 foi ajustada como 100%. Alíquotas equivalentes de catalisadorforam incubadas na temperatura apropriada. Nos momentos apropriados,uma alíquota inteira foi removida da incubação e a atividade de enzima de-terminada. Para as primeiras 10 horas amostras foram avaliadas a cada 2horas. Das 10-60 horas amostras foram avaliadas a cada 4 horas. De 5 diasa 40 dias amostras foram avaliadas a cada 12 horas. De 40 a 576 dias, a -mostras foram avaliadas em média a cada 10 dias.

Conforme visto na FIGURA 2, células estabilizadas usando poli-acrilamida mantiveram atividade até 150 horas após indução. Além disso,células imobilizadas com poliacrilamida carregadas em uma concentraçãobaixa ainda exibiram 50% da atividade inicial em cerca de 45 horas apósindução, e células imobilizadas em poliacrilamida carregadas em uma altaconcentração ainda exibiram 50% de atividade inicial em cerca de 80 horasapós indução.

EXEMPLO 4

Estabilização de Atividade de Nitrilo Hidratase Usando !mobilização em Algi-nato de Cálcio ou Poliacrilamida

Teste foi realizado para avaliar a estabilidade relativa de célulasinduzidas quanto à atividade de nitrilo hidratase usando asparagina no meiode cultura. O teste especificamente comparou a estabilização provida pelaimobilização em poliacrilamida ou alginato de cálcio. Rhodococcus sp., li-nhagem DAP 96622, foi culturada usando um meio de cultura padrão suple-mentado com asparagina para induzir atividade de nitrilo hidratase. As célu-las foram recuperadas da cultura para imobilização.

Amostra de Teste 1 foi preparada imobilizando as células induzi-das com asparagina em cubos de poliacrilamida (2,5 mm χ 2,5 mm χ 1 mm)usando o método descrito no Exemplo 3. Como um comparativo, células se-paradamente induzidas usando acrilonitrila foram também imobilizadas emcubos de poliacrilamida para avaliação.

Amostra de Teste 2 foi preparada imobilizando as células induzi-das por asparagina em contas de alginato de cálcio (2-3 mm de diâmetro)usando o método descrito no Exemplo 2. Como um comparativo, uma amos-tra foi preparada usando água de refugo contendo nitrila real como o suple-mento de indução (chamada NSB/WWCB). Um segundo comparativo foipreparado usando, como o indutor, uma mistura sintética contendo as nitrilase amidas dominantes presentes em uma corrente de refugo de produção deacrilonitrila (também incluindo sulfato de amônio e expressamente incluindocianida de hidrogênio) (chamada FC w/MAS w/o HCN).

As células imobilizadas foram mantidas por um tempo de cercade 576 dias e periodicamente avaliadas quanto à atividade de nitrilo hidrata-se restante. Os resultados do teste são ilustrados na FIGURA 3. Para avali-ação de atividade estabilizada, quantidades equivalentes de célula foramtestadas. A atividade de uma alíquota equivalente de células integrais nomomento 0 foi ajustada como 100%. Alíquotas equivalentes de catalisadorforam incubadas na temperatura apropriada. Nos momentos apropriados,uma alíquota inteira foi removida da incubação e a atividade de enzima de-terminada. Para as primeiras 10 horas amostras foram avaliadas a cada 2horas. De 10-60 horas amostras foram avaliadas a cada 4 horas. De 5 dias a40 dias as amostras foram avaliadas a cada 12 horas. Dos dias 40 a 576,amostras foram avaliadas em média a cada 10 dias.

EXEMPLO 5

Estabilização de Atividade de Nitrilo Hidratase Usando !mobilização em Glu-taraldeído

Teste foi realizado para avaliar a estabilidade relativa de célulasinduzidas quanto à atividade de nitrilo hidratase usando asparagina no meiode cultura. O teste comparou especificamente a estabilização provida pelaimobilização através de reticulação com glutaraldeído. Rhodococcus sp.,linhagem DAP 96253, e Rhodococcus rhodoehrous, linhagem DAP 96622,foram separadamente culturadas usando um meio de cultura padrão suple-mentado com asparagina para induzir atividade de nitrilo hidratase. As célu-las foram recuperadas da cultura e reticuladas usando glutaraldeído, con-forme aqui descrito.

As células imobilizadas foram mantidas por um tempo de cercade 576 dias e periodicamente avaliadas quanto à atividade de nitrilo hidrata-se restante. Os resultados do teste são ilustrados na FIGURA 4. Para avali-ação de atividade estabilizada, quantidades equivalentes de células foramtestadas. A atividade de uma alíquota equivalente de células integrais nomomento 0 foi ajustada como 100%. Alíquotas equivalentes de catalisadorforam incubadas na temperatura apropriada. Nos momentos apropriados,uma alíquota integral foi removida da incubação e a atividade de enzima de-terminada. Para as 10 primeiras horas amostras foram avaliadas a cada 2horas. De 10-60 horas amostras foram avaliadas a cada 4 horas. De 5 dias a40 dias amostras foram avaliadas a cada 12 horas. De 40 a 576 dias, amos-tras foram avaliadas em média a cada 10 dias.

Conforme visto na FIGURA 4, ambas linhagens imobilizadas a-través de reticulação com glutaraldeído exibiram um pouco menos de ativi-dade inicial em comparação com outros métodos de estabilização descritosacima. No entanto, ambas linhagens imobilizadas através de reticulação comglutaraldeído exibiram excelente estabilização a longo prazo mantendo até65% de atividade após 576 dias.EXEMPLO 6

Efeito de Asparagina e Glutamina sobre o Crescimento de MicroorganismosProdutores de Nitrilo Hidratase

O crescimento relativo de vários microorganismos produtores denitrilo hidratase foi avaliado. Todas as linhagens foram cultivadas em meioYEMEA contendo 7,5 g/L de uréia e 10 ppm de cobalto (provido como clore-to de cobalto) suplementado com asparagina (ASN), glutamina (GLN) ouambos asparagina e glutamina. A asparagina e a glutamina foram adiciona-das 3,8 mM. Temperatura de cultivo estava na faixa de 26°C a 30°C. Cres-cimento foi avaliado através de inspeção visual e graduado na escala quesegue: (-) significando nenhum crescimento detectável; (+++) significandocrescimento muito bom; e (++++) significando crescimento excelente. Osresultados são providos abaixo na Tabela 2.

Tabela 2

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EXEMPLO 7

Efeito de Asparagina e Glutamina sobre Produção de Nitrilo Hidratase e A-midase

A indução de produção de nitrilo hidratase e amidase em váriosmicroorganismos de produção de nitrilo hidratase foi avaliada. Todas as li-nhagens foram cultivadas em meio YEMEA contendo 7,5 g/L de uréia e 10ppm de cobalto (provido como cloreto de cobalto) suplementado com aspa-ragina (ASN), glutamina (GLN) ou ambas asparagina e glutamina. A aspara-gina e glutamina foram adicionadas 3,8 mM. Como um comparativo, produ-ção de enzima sem nenhuma suplementação foi também testada. Tempera-tura de cultivo estava na faixa de 26°C a 30°C. O nível de nitrilo hidrataseem Unidades por mg de peso seco de célula foi avaliado, e os resultadossão providos na Tabela 3. O nível de amidase em Unidades por mg de pesoseco de célula foi avaliado, e os resultados são providos na Tabela 4.

Tabela 3

<table>table see original document page 33</column></row><table>Tabela 4

<table>table see original document page 34</column></row><table>

EXEMPLO 8

Efeito de Asparaginase e Glutamina sobre Produção de Asparaginase I

A indução de produção de asparaginase I em vários microorga-nismos produtores de nitrilo hidratase foi avaliada. Todas as linhagens foramcultivadas em meio YEMEA contendo 7,5 g/L de uréia e 10 ppm de cobalto(provido com cloreto de cobalto) suplementado com asparagina (ASN), glu-tamina (GLN) ou ambos asparagina e glutamina. As asparagina e a glutami-na foram adicionadas 3,8 mM. Como um comparativo, produção de enzimafoi também avaliada com suplementação com acrilonitrila (AN), acrilamida(AMD) ou acrilonitrila e acrilamida. Temperatura de cultivo estava na faixa de26°C a 30°C. O nível de asparaginase I em Unidades por mg de peso secode célula foi avaliado, e os resultados são providos na Tabela 5.Tabela 5

Nível de Asparaginase I (Unidades/mg cdw) comBase em Suplementação de Meio de Crescimento

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EXEMPLO 9

Indução de Atividade de Asparaginase I em Células de Rhodococcus sp.DAP 96253

Rhodoooccus sp. DAP 96253 foi cultivada usando meio bifásicocomo a fonte de inóculo para uma fermentação de 20 litros. A adição suple-mentar de meio/carboidrato (ou YEMEA, dextrose ou maltose) foi feita aomeio R2A modificado, contendo hidrolisato de semente de algodão substitu-indo a Proteos Peptona 3 (PP3). Asparagina (solução a 0,15M) foi adiciona-da em uma taxa contínua de 1000 μΙ/min começando em t=10 h. No final dafermentação, 159 unidades por miligrama de peso seco de célula de nitrilohidratase específica de acrilonitrila, 22 unidades de amidase por miligramade peso seco de célula e 16 g/l de peso líquido embalado de célula foramproduzidas. A quantidade de várias enzimas produzidas é provida na FIGU-RA 5. Como pode ser visto nela, 159 unidades de nitrilo hidratase, 22 unida-des de acrilamidas e 16 unidades de asparaginase I por miligrama de pesoseco de célula foram produzidas pelas células DAP 96253.

EXEMPLO 10

Efeito de Composição de Meio sobre a Produção de Asparaginase I em Cé-lulas Rhodococcus sp. DAP 96253

Teste foi realizado para avaliar o efeito sobre atividade de aspa-raginase I com base no indutor usado. Em particular, teste foi realizado u-sando asparagina, glutamina, succinonitrila e isovaleronitrila como indutores(todas adicionadas a 1000 ppm cada). Como pode ser visto na Tabela 6,asparagina foi capaz de induzir atividade de asparaginase I de 24,6 unida-des/mg de peso seco de célula. Glutamina ou succinonitrila também mostrouuma habilidade em induzir atividade de asparaginase I. Atividade de aspara-ginase I maior foi obtida quando maltose foi adicionada a YEMEA. A inclusãode Cobalto (5-50 ppm) no meio também resultou em melhoras quando com-binado ou com glicose ou maltose.

Tabela 6

Níveis de Asparaginase I em Rhodococcus sp. DAP96253 Cultivada em Meio com Suplemento de Carboidrato

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Muitas modificações e outras modalidades da invenção mostra-das aqui serão lembradas por um versado na técnica à qual as presentesinvenções pertencem tendo o benefício dos ensinamentos apresentados nasdescrições acima. Então, deve ser compreendido que as invenções não de-vem ser limitadas às modalidades específicas reveladas e que modificaçõese outras modalidades pretendem ser incluídas no escopo das reivindicaçõesapensas. Embora termos específicos sejam empregados aqui, eles são usa-dos em um sentido genérico e descritivo apenas e não para propósitos delimitação.

Claims (29)

1. Método para indução de atividade de enzima desejada em ummicroorganismo produtor de nitrila hidratase compreendendo cultura do mi-croorganismo produtor de nitrilo hidratase em um meio compreendendo pelomenos cerca de 50 ppm de um ou mais aminoácidos contendo amida ouseus derivados.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a atividade deenzima desejada é selecionada do grupo consistindo em atividade de nitrilohidratase, atividade de amidase, atividade de asparaginase I e suas combi-nações.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o microorga-nismo produtor de nitrilo hidratase compreende bactérias selecionadas dogrupo consistindo em gênero Rhodococcus, gênero Brevibacterium, gênerosPseudomonas, gênero Pseudonocardia, gênero Nocardia e suas combina-ções.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o microorga-nismo produtor de nitrilo hidratase compreende bactérias selecionadas dogrupo consistindo em Rhodococcus rhodochrous DAP 96622, Rhodococcussp. DAP 96253 e suas combinações.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, onde um ou maisaminoácidos contendo amida são selecionados do grupo consistindo em as-paragina, glutamina ou suas combinações.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, onde um ou maisaminoácidos contendo amida estão presentes em uma concentração de cer-ca de 50 ppm a cerca de 5000 ppm.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, onde meio é livre dequaisquer compostos contendo nitrila.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a-inda imobilização do microorganismo.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o microorga-nismo produtor de nitrilo hidratase induzida tem uma atividade de enzimamaior do que ou igual à atividade da mesma enzima quando induzida usan-do um composto contendo nitrila.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o microorga-nismo produtor de nitrilo hidratase induzida tem uma atividade de enzimaque é pelo menos 5% maior do que a atividade da mesma enzima quandoinduzida usando um composto contendo nitrila.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, onde meio com-preende ainda cobalto.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, onde meio com-preende ainda uréia.

13. Método para estabilização da atividade desejada em umaenzima ou um microorganismo capaz de produzir a enzima compreendendocontato da enzima ou microorganismo capaz de produzir a enzima com umacomposição compreendendo pelo menos cerca de 50 ppm de um ou maisaminoácidos contendo amida, ou seus derivados.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, onde um ou maisaminoácidos contendo amida são selecionados do grupo consistindo em as-paragina, glutamina e suas combinações.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, onde um o maisaminoácidos contendo amida estão presentes em uma concentração de cer-ca de 50 ppm a cerca de 5000 ppm.

16. Método de acordo com a reivindicação 13, onde a atividadedesejada da enzima ou do microorganismo capaz de produzir a enzima éestabilizada de modo que a atividade desejada após um tempo de pelo me-nos 30 dias em uma temperatura de 25°C é mantida em um nível de pelomenos cerca de 50% da atividade inicial exibida pela enzima ou pelo orga-nismo capaz de produzir a enzima.

17. Método para estabilização de nitrilo hidratase compreenden-do imobilização da nitrilo hidratase ou microorganismo capaz de produçãoda nitrilo hidratase com um substrato de modo que a atividade após um tem-po de pelo menos 30 dias em uma temperatura de 25°C é mantida em umnível de pelo menos cerca de 50% da atividade inicial exibida pela nitrilo hi-dratase ou pelo organismo capaz de produzir a nitrilo hidratase.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, onde o substratoé selecionado do grupo consistindo em alginato e polímeros contendo amida.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, onde o polímerocontendo amida compreende poliacrilamida.

20. Método de acordo com a reivindicação 17, onde a imobiliza-ção compreende reticulação de células do microorganismo com glutaraldeído.

21. Método de acordo com a reivindicação 17, onde o microor-ganismo compreende bactérias selecionadas do gênero Rhodococcus, gê-nero Brevibacterium, gênero Pseudomonas, gênero Pseudonocardia, gêneroNocardia e suas combinações.

22. Composição compreendendo:(a) um meio nutriente compreendendo pelo menos cerca de 50 ppm de umou mais aminoácidos contendo amida ou seus derivados;(b) um ou mais microorganismos de produção de enzima; e(c) uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em nitrilo hi-dratase, amidase, asparaginase I e suas combinações.

23. Composição de acordo com a reivindicação 22, onde um oumais aminoácidos contendo amida são selecionados do grupo consistindoem asparagina, glutamina e suas combinações.

24. Composição de acordo com a reivindicação 22, onde um oumais aminoácidos contendo amida estão presentes em uma concentraçãode cerca de 200 ppm a cerca de 2000 ppm.

25. Composição de acordo com a reivindicação 22, onde um oumais microorganismos compreendem bactérias selecionadas do grupo con-sistindo em gênero Rhodococcus, gênero Brevibacterium, gênero Pseudo-monas, gênero Pseudonocardia, gênero Nocardia e suas combinações.

26. Composição de acordo com a reivindicação 22, onde um oumais microorganismos compreendem bactérias selecionadas do grupo con-sistindo em Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. DAP 96253, Brevi-bacterium ketogiutaricum e suas combinações.

27. Composição de acordo com a reivindicação 22, onde um oumais microorganismos são pelo menos parcialmente imobilizados.

28. Composição de acordo com a reivindicação 22, onde meiocompreende ainda cobalto.

29. Composição de acordo com a reivindicação 22, onde meiocompreende ainda uréia.