ITMI20011826A1 - Microorganismo dotato di attivita' nitrile-idratasica/amidasica enantioselettiva e regioselettiva - Google Patents

Description

Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: Microorganismo dotato di attività nitrile-idratasica/amidasica enantioselettiva e regioselettiva.

CAMPO DELL’INVENZIONE.

La presente invenzione concerne nuovi microorganismi, preferibilmente mutagenizzati, appartenenti al genere Agrobacterìum radiobacter capaci di idratizzare e/o idrolizzare nitrili o ammidi nonché procedimenti di conversione utilizzanti i suddetti microorganismi.

TECNICA ANTERIORE.

La conversione di nitrili ad acidi è vantaggiosamente ottenuta neH’arte nota per via enzimatica con enzimi derivati da microorganismi, in quanto la corrispondente trasformazione “chimica" tradizionale richiede condizioni drastiche (6M HCI oppure 2M NaOH a riflusso) ed è difficilmente conducibile con la chemo-, regio- e stereoselettività nonché stereospecifità ed in particolare con la enantioselettività spesso richieste, p.e. nella sintesi di alcuni specialità chimiche e soprattutto farmaceutiche.

Tra le applicazioni più comuni di enzimi derivati da microorganismi in grado di processare nitrili, vanno ricordate la produzione di acrilammide da acrilonitrile (Kobayashi, M. et al., Eur. J. Biochem. 217: 327-336 1993), procedimenti di decontaminazione deH’ambiente (Kobayashi, M. et al., J. Bacteriology 172: 4807-4815, 1990) e la produzione di fibre tessili (Tauber, M. M. et al., Appi, and Environ. Microbiol. 56: 3125-3129, 2000). Per esempio, il batterio Rhodococcus rhodochrous K22 mostra un’attività sia su nitrili alifatici saturi (ad es. valeronitrile o glutaronitrile) che su nitrili insaturi (ad es. crotonitrile) (Kobayashi, M. et al., FEMS Miocrobiol. Lett. 77, 121-124 1991 e FEMS Miocrobiol. Lett. 120, 217-224 1994). Manca invece di attività su nitrili aromatici.

Generalmente i microorganismi presentano o attività nitrilasica (ossia di idrolisi del nitrile a dare direttamente il rispettivo acido), isolata ad esempio dai batteri del genere Alcaligenes Faecalis, Rhodococcus rhodochrous K22, Acinetobacter sp. ceppo AK226, Acidovorax facilis 72 W) oppure attività nitrile-idratasica/amidasica (ossia, in una prima fase, di idratazione del nitrile a dare la rispettiva ammide che viene poi, in una seconda fase, di sua volta idrolizzata sotto ottenimento del corrispondente acido) isolata ad esempio dai batteri del genere Rhodococcus rhochrous J1, Rhodococcus sp. 361, Rhodococus sp. C3II, Rhodoccus erythropolis MP50, Agrobacterìum tumefaciens, Camomonas testosteroni, Candida famata, Brevibacterium sp. R312. Più raramente entrambe le attività sono state isolate nello stesso microorganismo, come ad esempio in Rhodococcus butanica, ATCC cat.

21197 (US 3,751 ,337) o in Arthrobacter sp. ceppo J1.

Per esempio, nell’industria farmaceutica, questo tipo di attività enzimatica, nei casi in cui è dotata di una marcata enantioselettività verso specifici substrati chirali costituenti precursori di principi attivi, è sfruttabile nella produzione di acidi α-aril-propionici otticamente attivi (“profeni”) che costitusicono una classe di potenti anti-infiammatori nonsteroidali e di cui i relativi S-enantiomeri si sono rivelati farmacologicamente preferibili rispetto agli R-enantiomeri e quindi di cui le preparazioni di S-enantiomero “enantiopuro” sono preferite alle forme racemiche commercializzate inizialmente. Di conseguenza, diversi gruppi di ricercatori hanno esaminato la possibilità di utilizzare la coppia di enzimi nitrile idratasi/amidasi dei ceppi di Rhodococcus erythropolis MP50 e C3II per la produzione delI’S-naprossene e delI’S-ketoprofene. Un enzima con attività nitrilasica verso R,S-ibuprofen nitrile per la produzione enantioselettiva di è ottenibile da Acinetobacter sp. AK226 come descritto da Yamamoto et al., Agile. Biol. Chem. 55 86), 1459-1466, 1991. L’enzima, che agisce su una vasta quantità di substrati (simmetrici e chirali) quali nitrili aromatici (ad es. il benzonitrile), arilalchilici (ad es. il 2-fenilpropionitrile), alitatici (ad es. acrilonitrile) ed eterociclici (ad es. il 2-furonitrile), nonché su composti dinitrilici (ad esempio il malononitrile), si è rivelato poi altamente enantioselettivo per che viene idrolizzato più velocemente della sua corrispettiva forma speculare

ottenendo cosi S(+)-ibuprofene con notevoli eccessi enantiomerici. Si tratterebbe quindi di una nuova nitrilasi in grado di scegliere tra le due tipologie di substrati (enantiomeri).

Tuttavia, in sistemi enzimatici comprendeti attività sia nitrile-idratasica sia amidasica, l’attività (ed anche la enatioselettività) nelle due rispettive fasi possono essere marcatamente diverse. In particolare, si trova prevalentemente che gli enzimi nitrile-idratasi di origine microbica danno preferenzialmente l’R-enantiomero, mentre le amidasi danno preferibilmente l’S-enantiomero. (Cohen, M. A. et al., Tetrahedron: Asymmetry 3: 1543-1546 1992; Kakeya, H. et al., Tetrahedron Lettere 32: 1343-1346, 1991 ; Layh, N. et al., J. Biotechnology 33: 175-182, 1994; Hirrlinger, B. et al., J. Bacteriology 178: 3501-3507, 1996; Effenberger, F. et al., J. Biotechnology 60: 165-174, 1998). In quest’ultimo lavoro, Effenberger e coautori esaminano inoltre anche la regioselettività del sistema biocatalitico e dimostrano che, in base ad attività e preferenze di substrato diverse, i due ceppi C3II e MP50 possono complementare nella conversione regio-selettiva di nitrili ad ammidi e di ammidi ad acidi: il ceppo C3II idrolizza il dinitrile a dare la corrispondente mononitrile/monoammide, mentre il ceppo MP50 consente la produzione dei monoacidi, ossia del mononitrile/monoacido e del monoammide/monoacido. Essi utilizzano come substrato dinitrili alifatici, insaturi ed aromatici.

Altri ceppi che utilizzano come substrato dinitrili alifatici in cui i gruppi cianidrici si trovano, rispettivamente, in posizione αx e ω, sono Acidovorax facilis e Camomonas testosteroni. Dei due, solo il primo ha una nitrilasi che converte direttamente α,ω-di nitri le all’acido ω-cianocarbossilico. Il secondo ha invece un sistema nitrile idratasico/amidasico che dà l’acido ω-cianocarbossilico attraverso l’ammide corrispondente (Gavagan, J. and et al., J. Org. Chem. 63: 4792-4801 , 1998).

Bauer et al. {Appi. Microbiol. Biotechnol. 42: 1-7 (1994) e Appi. Microbiol. Biotechnol. 49: 89-95 (1998)) descrive un sistema nitrileidratasico/amidasico di Agrobacterium tumefaciens, ceppo d3. Mentre nel primo articolo gli autori osservano sia cellule intere, sia estratti cellulari e dimostrano la preferenza di Agrobacterium tumefaciens a processare l’(S)-enantiomero di un dato substrato (nitrilico oppure ammidico) racemico in entrambe le fasi della trasformazione enzimatica (con l'importante eccezione dell’lbuprofennitrile che da il corrispettivo (R)-lbuprofene, ossia l’enantiomero meno preferito da un punto di vista farmacologico), gli stessi autori dimostrano poi nel secondo articolo che l’enzima purificato nitrile-idratasi è altamente stereospecifico rispetto a molti composti fenilproprionitrilici perchè ne converte preferenzialmente l’(S)-enantiomero a dare selettivamente la corrispondente S-fenilpropionammide (per esempio, si raggiunge ee>90%, a 30% di resa, per la S-ketoprofen ammide). Sempre nel secondo articolo viene descritta inoltre l’influenza della temperatura sulla reazione nitri leidratasica con cellule intere in presenza di un inibitore dell’attività amidasica. Antecedentemente, nel primo articolo, Bauer et al. avevano indagato sulla fonte di azoto utilizzabile per la crescita del microorganismo e per l’induzione della sua attività enzimatica, stabilendo che YAgrobacterium tumefaciens d3 descritto da Bauer et al. può essere coltivato con l’uso di vari nitrili organici, p.e. 2-fenilproprionitrile come fonti di azoto ed anche come induttori di attività enzimatica, ma che quest’ultima viene soppressa totalmente nel caso di una eventuale presenza di ammonio nel terreno di coltura.

Nel brevetto US 5,395,758 della Sumimoto Chemical Company Ltd è descritto invece un microorganismo del genere Agrobacterìum radiobacter, ceppo SC-C15-1 (depositato secondo il trattato di Budapest il 23 Aprile 1992 con numero di accesso FERM BP-3843), in grado di convertire nitrili alifatici ed aromatici nelle corrispondenti ammidi. US 5,395,758 non contiene però nessun insegnamento sulla enantioselettività di Agrobacterìum radiobacter ceppo SC-C15-1 ; in particolare non c’è nessun accenno alle rese ottiche ottenibili eventualmente a partire da nitrili racemici. Inoltre, per esempio secondo esempio 4 di US 5,395,758 un “whole celi catalyst” costituito da Agrobacter radiobacter ceppo SC-C15-1 , è caratterizzato dal fatto di convertire i substrati nitrilici quantitativamente in ammidi, senza la (susseguente) formazione e quindi la possibilità della isolazione di acidi. È da notare quindi che Agrobacterìum radiobacter ceppo SC-C15-1 è privo di attività amidasica.

Anche in Gabriel et al. (J. Chromatology B, 1996, 681 :191-195) è descritto un microorganismo del genere Agrobacterìum radiobacter che degrada nitrili aromatici, utilizzati come pesticidi. Comunque anche Agrobacterìum radiobacter 8/4, come identificato e descritto dagli autori di questo articolo, risulta privo di attività amidasica, in quanto i pesticidi nitrilici offerti come substrati vengono sempre metabolizzati a dare le rispettive ammidi. Inoltre, non viene dato nessun insegnamento riguardante una eventuale enantioselettività di Agrobacterìum radiobacter 8/4 rispetto a determinati substrati.

Si può concludere quindi che tutti i ceppi del genere Agrobacterìum (specie radiobacter o tumefaciens) come sopra sono ceppi naturali (“wild-type”) esibenti predeterminate caratteristiche enzimatiche. Per esempio, nessuno dei microorganismi della specie Agrobacterium radiobacter dell’ arte nota dimostrava una attività amidasica.

Uno scopo della presente invenzione è quindi la messa a disposizione di un nuovo ceppo del genere Agrobacterium radiobacter che dimostri una attività amidasica.

Un ulteriore scopo, particolarmente preferito, è la messa a disposizione di un nuovo ceppo del genere Agrobacterium radiobacter mutagenizzato ad attività enzimatica ottimizzata, ossia che sia preferibilmente elevata e che dimostri una distinta regioselettività, stereoselettività, e/o enantioselettività. Viene particolarmente preferito che tale attività enzimatica ottimizzata possa essere indotta con induttori a basso costo. Un ulteriore scopo della presente invenzione è la messa a disposizione di un procedimento per la conversione, preferibilmente enantioselettiva, ^li nitrili nei rispettivracidi, possibilmente comprendente il passaggio a) di conversione di nitrili ad ammidi e quello b) di conversione di ammidi ad acidi.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è la messa a disposizione di un procedimento per la conversione, preferibilmente enantioselettiva, di ammidi nei rispettivi acidi.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è la messa a disposizione di un procedimento per la conversione, preferibilmente enantioselettiva, di nitrili nelle rispettive ammidi.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è la messa a disposizione di un procedimento per l’idratazione e/o idrolisi regioselettiva di dinitrili. SOMMARIO.

Tale scopo ed ulteriori scopi che meglio appariranno di seguito vengono raggiunti dalla presente invenzione che concerne un nuovo microorganismo appartenente al genere Agrobacterìum radiobacter, capace di convertire nitrili e/o ammidi nei rispettivi acidi. Secondo una forma di realizzazione preferita della presente invenzione viene messo a disposizione un microorgansimo mutagenizzato appartenente al genere Agrobacterìum radiobacter, catalasi-positivo ed ossidasi-negativo, ad attività enzimatica ottimizzata, ossia elevata, e dimostrante una distinta regioselettività, stereoselettività, e/o enantioselettività. Secondo una forma di realizzazione particolarmente preferita della presente invenzione viene messo a disposizione Agrobacterìum radiobacter 30”60 (NCIMB 41108). Inoltre, la presente invenzione mette a disposizione una serie di procedimenti per l’idratazione e/o idrolisi di nitrili o ammidi che utilizzano i microorganismi messi a disposizione dalla presente invenzione.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE.

Per meglio illustrare la presente invenzione, si allegano le seguenti Figure, in cui:

Figura 1 rappresenta lo schema del procedimento di selezione dei microorganismi in generale, e

Figura 2 illustra la genealogia di Agrobacterìum radiobacter 30”60 (NCIMB 41108) dopo la mutagenesi.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE.

Oggetto della presente invenzione è quindi un nuovo microorganismo, preferibilmente mutagenizzato, appartenente al genere Agrobacterium radiobacter, capace di convertire nitrili e/o ammidi nei rispettivi acidi. Ulteriore oggetto della presente invenzione è una serie di procedimenti per l'idratazione e/o idrolisi di nitrili o ammidi che utilizzano i nuovi microorganismi del genere Agrobacterium radiobacter.

Le conversioni vengono ottenute per via enzimatica ed il microorganismo viene pertanto definito ai fini della presente invenzione, come biocatalizzatore.

Il nuovo microorganismo secondo la presente invenzione appartiene alla famiglia delle Rhizobiacee genere II, Agrobacterium radiobacter, e presenta le seguenti caratteristiche morfologiche: ha forma di bastoncello di circa 0.8 μm per 1.5-3 μm . Al microscopio ottico appare mobile, non forma spore ed è Gram-negativo dopo colorazione effettuata secondo metodi noti nello stato deN’arte. Cresce ad un pH compreso tra 6-9 e ad una temperatura compresa tra 5 e 45°C in terreno contenente estratto di lievito, peptone, destrosio, NaCI. In particolare, il microorgansimo secondo la presente invenzione utilizza una vasta pluralità di carboidrati, sali di acidi organici e/o amino acidi come fonti di carbonio, mentre non vengono utilizzati cellulosa, agar di glucosio, D-galattosio ed altri carboidrati. Tra le fonti di azoto utilizzabili sono da nominare i sali di ammonio, ma non i nitrati che non vengono utilizzati. Una realizzazione preferita dell’invenzione è costituita dal microorganismo mutagenizzato denominato Agrobacterium radiobacter 30”60 meglio descritto qui di seguito e depositato sotto il Trattato di Budapest il 3 maggio 2001 presso il NCIMB (National Collection of Industriai and Marine Bacteria Ltd, Aberdeen, Scozia, Regno Unito), con numero di accesso 41108. È da rilevare che Agrobacterium radiobacter 30 "60 (NCIMB 41108) costituisce un nuovo ceppo. Di conseguenza, oltre a tale nuovo ceppo, la presente invenzione mette anche a disposizione una qualsiasi mutante derivabile di sua volta da Agrobacterium radiobacter 30 "60 (NCIMB 41108), per esempio un qualsiasi ceppo ottenuto per fusione cellulare oppure un qualsiasi ceppo recombinante derivato da Agrobacterium radiobacter 30 "60 (NCIMB 41108).

L’Agrobacterium radiobacter 30’BO (NCIMB 41108) che viene ulteriormente caratterizzato e descritto nella sezione sperimentale della presente domanda di Brevetto, come il ceppo wild-type dal quale è stato ottenuto, è un aerobio obbligato e, come detto sopra, non riduce i nitrati. Partendo dal ceppo liofilizzato, dopo 48 ore di crescita su terreno solido forma colonie rugose, tonde, di circa 1.2 mm di diametro e di colore bianco avorio. Come descritto sopra, Agrobacterìum radiobacter 30”Q0 (NCIMB 41108) può utilizzare sali di ammonio come fonti di azoto. È difatti importante sottolineare che l’uso dei sali d’ammonio non porta poi ad una inibizione della sua attività enzimatica verso substrati nitrilici, come lo è stato descritto invece p.e. per il ceppo d3 di Agrobacterìum tumefaciens (Bauer et al., “Enantioselective hydrolysis of racemic 2-phenylproprionitrile and other (R ,S)-2-arylproprionitriles by a new bacterial isolate, Agrobacterìum tumefaciens strain d3. Appi. Microbio/. Biotechnol. 42: 1-7, 1994).

Secondo la classificazione API 20 NE, Agrobacterìum radiobacter 30” 60 (NCIMB 41108) risulta inoltre essere positivo al marcatore enzimatico catalasi. Contrariamente al ceppo Agrobacterìum radiobacter SC-C15-1 descritto in US 5,395,758, Agrobacterìum radiobacter 30 "60 (NCIMB 41108) non è in grado di ridurre i nitrati, non utilizza il citrato come fonte di carbonio unica, risulta essere negativo al test dell’ossidasi e non produce acido da glucosio. Il terreno minimo agarizzato, su cui è stato selezionato il ceppo Agrobacterìum radiobacter 30 ”60 (NCIMB 41108) e su cui presenta una crescita ottimale, comprende almeno i seguenti costituenti: KH2P04 (1 g I'1), Na2 HP04 (3 g l1), MgS04 (0.5 g Γ1), NaCI

87-102, 1967; Betz and Clarke, J. Gen. Microbiol. 73: 161-174, 1972, Smyth and Clarke, J.Gen. Microbiol. 90: 81-90, 1975) descrivono con riferimento a Pseudomonas aeruginosa che la sintesi dell’annidasi è repressa dall’utilizzo di succinato e dalla combinazione del succinato come fonte di carbonio con un’ammide come fonte di azoto. Gli stessi autori descrivono inoltre, che tale tipologia di terreno costituisce un efficiente medium selettivo per l’isolamento di mutanti regolatori dell’ammidasi, di mutanti con l’enzima alterato e di mutanti resistenti alla repressione da cataboliti. Partendo da tali considerazioni, è stato definito il terreno di isolamento in cui l’utilizzo del succinato come fonte di carbonio, vista la presenza di una nitrile idratasi, è sostituita dal succinonitrile. I dati sperimentali relativi al ceppo wild-type di Agrobacterium radiobacter della presente invenzione confermano l'incapacità del progenitore di utilizzare il succinonitrile come induttore e/o come metabolita. Al contrario, la capacità per Agrobacterium. radiobacter 30”60 (NCIMB 41108) di utilizzare il succinonitrile come induttore dell’attività nitrile idratasica / amidasica e/o come metabolita, rappresenta un marcatore specifico di riconoscimento del ceppo mutagenizzato.

Il terreno di fermentazione successivamente sviluppato per Agrobacterium radiobacter 30”60 (NCIMB 41108) è costituito da:

risultano essere gli ioni Ca, Co, Fe, Mg e Mn; estrema importanza presentano gli ioni Co nei loro vari stadi di ossidazione in particolare com Co+2.

In questo terreno il ceppo Agrobacterium radiobacter 30”60 (NCIMB 41108) raggiunge una densità massima di 18.5-19 mg di cellule /mi (9 x 109 - 1.1 x 101° cellule/ml), corrispondente ad una densità ottica (campione diluito 1 : 10) misurata a 600 nm di 0.9 unità di assorbanza. Il batterio A. radiobacter 30”60 (NCIMB 41108) mostra un’attività basale di conversione enantioselettiva di nitrili e di ammidi nei rispettivi acidi, che viene indotta notevolmente mediante aggiunta al terreno di coltura di nitrili e/o ammidi, entrambi di natura alifatica, arilalchilica o aromatica. Il ceppo è quindi definibile come semi-costitutivo.

Esempi preferiti ma non esclusivi dr nitrili induttori dell’attività enzimatica sono nitrili o dinitrili “semplici” ossia nitrili o dinitrili non chirali, preferibilmente alitatici ramificati o lineari comprendenti 2-12 atomi di carbonio. Tra essi particolarmente preferiti sono i nitrili alifatici non chirali quali ad esempio il valeronitrile, l’isovaleronitrile, il butirronitrile, l’isobutirronitrile, oppure i dinitrili alifatici non chirali come il succinonitrile. Mentre è anche possibile indurre il batterio Agrobacterium radiobacter 30”60 (NCIMB 41108) con altri nitrili, p.e. arilalchilici o aromatici oppure con nitrili chirali (p.e. con (R,S)-2-fenilproprionitrile, quale nitrile arilalchilico impiegato talvolta nella tecnica anteriore), l’attività nitrile idratasica/amidasica cosi indotta è risultata accettabile ma comunque inferiore a quella ottenuta con nitrili e dinitrili alifatici semplici che rimangono preferiti. Tra le ammidi, che anch’esse possono essere alifatiche, arialchiliche o aromatiche, e che comprendono i anche lattami, sono utilizzati preferibilmente le seguenti molecole come induttori: εcaprolattame, l’isobutirammide, la benzammide, la valeroammide, la butirammide e la lattammide e che quindi vengono definite come ammidi “semplici” nell’ambito della presente invenzione. Particolarmente preferiti sono il valeronitrile ed il butirronitrile, utilizzati, come tutti gli induttori, ad una concentrazione non tossica per il microorganismo, per esempio ad una concentrazione finale compresa tra 0.5-5 g/L. L’induttore, o gli induttori, sono aggiunti al terreno di fermentazione da soli oppure in combinazione, sterilmente.

La possibilità di indurre ad alti livelli l'attività enzimatica nitrite idratasica / amidasica con molecole a basso costo, preferibilmente con i nitrili e/o le ammidi “semplici” come sopra, rappresenta un vantaggio dei biocatalizzatori secondo la presente invenzione, rispetto a quanto noto nell’arte: infatti molto spesso, buoni livelli di induzione venivano ottenuti addirittura solamente con il substrato stesso della reazione che si intendeva poi catalizzare, oppure con “sostanze modello”, spesso relativamente costose, simulanti il più possibile il substrato vero e proprio della reazione di sintesi, come lo è per esempio il caso del (R,S)-2-fenilproprionitrile spesso impiegato nelle sperimentazioni descritte nell’arte nota per indurre la capacità di processare poi determinati nitrili ed ammidi chirali convertibili nei rispettivi profeni di interesse farmacologico.

Ulteriore oggetto dell’invenzione è quindi costituito da una serie di procedimenti per l’idratazione e/o idrolisi di nitrili o ammidi che utilizzano i nuovi microorganismi Agrobacterium radiobacter secondo l’invenzione. Tra tali procedimenti, di conversione della presente invenzione, sono da nominare i seguenti: la conversione di nitrili nei rispettivi acidi, la conversione di nitrili nelle rispettive ammidi, la conversione di ammidi nei rispettivi acidi e l’idratazione o idrolisi regioselettiva di dinitrili.

Particolarmente preferiti sono quindi i procedimenti di conversione che utilizzano il ceppo Agrobacterium radiobacter 30”60, depositato con numero 41108 il 3 maggio 2001 presso il NCIMB.

Secondo una forma di esecuzione preferita ma non esclusiva della presente invenzione, nelle reazioni di conversione, i microorganismi del ceppo Agrobacterium radiobacter 30”60 (NCIMB 41108) vengono utilizzati come pellet batterico (whole celi catalyst) ottenuto dopo fermentazione in terreni di crescita contenenti l’induttore o gli induttori così come di seguito descritto.

Il seed-medium (terreno di inoculo) viene inoculato con una singola colonia del microorganismo del ceppo Agrobacterium radiobacter 30”60 (NCIMB 41108) prelevata da una coltura su piastra, o a becco di clarino, cresciuta per 18-36 ore in termostato alla temperatura di 30° C. Il microorganismo utilizzato per la semina, deriva da uno stock di batteri liofilizzato o congelato in presenza di glicerolo alla temperatura di -80° C. La coltura liquida utilizzabile come inoculo, viene cresciuta in shaker (beuta sottoposta ad agitazione) come coltura areata a 180 rpm ed alla temperatura di 30° C, per un massimo di 24 ore, meglio se fino a 22 ore dove il ceppo Agrobacterìum radiobacter 30”60 (NCIMB 41108) raggiunge una densità massima di 13.1 mg di cellule/ml (5.8 x 10 <9 >cellule/ml) corrispondente ad una densità ottica (campione diluito 1 :10) misurata a 600 nm di 0.588 unità di assorbanza. Il “fermentation medium", viene quindi inoculato con un volume di coltura batterica pari al 1 %-50%, preferibilmente al 10 % (v/v) del totale e il processo avviato come coltura areata in shaker a 300 rpm, alla temperatura di 30° C e per un tempo variabile da 24 a 96 ore, meglio se per 48 ore. Il volume di terreno totale, utilizzato per una beuta da 500 mi, è in genere di 100 mi. L’induttore o la miscela di induttori, viene aggiunto sterilmente in unica soluzione all’inizio del processo.

Il pellet batterico, ottenuto per centrifugazione della coltura batterica indotta, e lavato opportunamente mediante lavaggi in soluzioni fisiologica o acqua, costituisce il biocatalizzatore a cellule intere (“whole celi oatalyst”) ed è sotto forma di pasta batterica umida. Esso è conservato ad una temperatura inferiore a 10°C, preferibilmente compresa tra 3°C e 6°C, ancor più preferibilmente 4°C. Il whole celi catalyst costituisce infatti una forma esecutiva preferita ma non esclusiva della presente invenzione. Sono comunque comprese nella portata della presente invenzione e rientrano pertanto nella definizione di biocatalizzatore secondo l’invenzione, preparazioni di microorganismi costituite da batteri lisati, anche solo parzialmente, ad esempio mediante trattamento enzimatico, chimico o fisico, oppure estratti batterici grezzi, ad esempio ottenuti mediante lisi cellulare completa quale quella ottenibile mediante trattamento di una sospensione di batteri con French-press, oppure ancora omogenati, ad esempio ottenuti con Potter o sonicatore, oppure preparati semipurificati degli estratti batterici quali quelli ottenibili mediante centrifugazione di un lisato batterico grezzo, in presenza di opportuni flocculanti.

Le reazioni di conversione catalizzate dai microorganismi secondo la presente invenzione, avvengono ad un pH compreso tra 5 e 9,5, preferibilmente compreso tra 7 e 8, in soluzioni tampone, quali ad esempio tampone acetato, tampone Tris-HCI e tampone fosfato, particolarmente preferito è tampone fosfato a pH 7.7. La temperatura di reazione è compresa tra 5 e 45°C, più preferibilmente tra 28 e 42°C e ancora più preferibilmente tra 38 e 42°C. Il substrato può essere, se insolubile nel tampone, solubilizzato in solventi organici, quali alcool, ad es. etanolo, metanolo, isopropanolo o tert-butanolo, oppure in solventi organici quali il diossano, Ν,Ν-dimetilformammide, dimetilsulfossido, etc. Particolarmente preferito è il metanolo, presente nella miscela di reazione, come tutti i solventi organici come sopra, in una concentrazione finale compatibile con i sistemi metabolici del microorganismo, meglio se non superiore al 10% (v/v). Alla miscela di reazione possono inoltre venire aggiunti detergenti, preferibilmente anionici, quali Tween®-20, Tween®-80 (o altri Tweens® elencati ad esempio nel catalogo “SIGMA”), oppure vari Tritons® (ad esempio Triton® X-100 oppure X-114, X-405, N-101 , CG 110, XL-80N, WR-1339 oppure altri ancora, come elencati ad esempio nel catalogo “SIGMA”) in concentrazione finale, sempre “non tossica” per il sistema di reazione, preferibilmente compresa tra 0.5-5%.

Il biocatalizzatore viene aggiunto alla soluzione di reazione in rapporto ponderale compreso tra 10 e 0.5 (batteri/substrato). Il peso del biocatalizzatore è espresso come peso umido di pasta batterica. Nel caso di estratti batterici o di omogenati liquidi, il rapporto è adattato in considerazione del peso umido dei batteri inizialmente processati.

Con riferimento alle attività enzimatiche dei biocatalizzatori rilevate neH’ambito della presente invenzione, è da notare che esse risultano modificabili dall’esperto del ramo mediante la variazione delle condizioni di crescita del biocatalizzatore. Per esempio, le attività possono essere ottimizzate, se richiesto, mediante adatta variazione del mezzo di coltura (“culture medium”), dei tempi di fermentazione nonché dei parametri chimico-fisici e meccanici (ad esempio l’areazione) della coltivazione. Tra i substrati convertibili mediante i biocatalizzatori della presente invenzione sono da nominare i nitrili di formula R-CN, in cui R costituisce urr residuo organico. Sono preferiti i nitrili alitatici in xui R è un gruppo alifatico, i nitrili arilalchilici in cui R è un gruppo arilalchilico ed i nitrili aromatici in cui R è un gruppo aromatico.

Tra i nitrili alitatici, i nitrili alitatici preferiti secondo la presente invenzione sono quelli in cui R è un gruppo alifatico lineare, ramificato o ciclico e comprende 1-20 atomi di carbonio ed eventualmente 1-2 eteroatomi scelti da O, S, N. R può essere saturo oppure contenere 1-4 legami doppi e/o 1-3 legami tripli. Inoltre, R può essere sostituito con 1-5 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH, ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, cicloesil, cicloeptil. Nel caso della presenza di gruppi cicloalifatici, questi ultimi possono contenere 1-2 eteroatomi scelti da O, S, N, possono contenere 1-2 doppi legami e possono essere sostituiti di loro volta con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH oppure C-i-C6-alchil (lineare o ramificato, comprendente 1-2 doppi legami 0 un triplo legame), di sua volta sostituito con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH.

Nitrili alitatici particolarmente preferiti secondo la presente invenzione sono il 2-piperidilnitrile, il 2-metilbutirronitrile, il 2-metilpentanonitrile, il 3-metil-pentanonitrile ed il 2-metilesanonitrile.

Tra i nitrili arilachilici sono preferiti ad esempio alcuni α-metilarilacetonitrili (oppure “arilpropionitrili”), specialmente i nitrili che (-mediante il rimpiazzamento formale di CN con COOH-) sono i precursori della classe di composti farmaceutici denominati profeni. Una serie di nitrili arilachilici particolarmente preferiti secondo la presente invenzione è costituita da nitriti- -alitatici come sopra sostituiti di loro volta con 1-4 gruppi arilici (“aromatici”) o eteroarilici (“eteroaromatici”) comprendenti 4-14 atomi di carbonio e, eventualmente, 1-3 eteroatomi scelti da O, S, N. Tra i gruppi arilici sono da nominare ad esempio il gruppo fenilico, naftilico oppure i loro omologhi eteroarilici oppure il gruppo furilico. I gruppi arilici possono essere di loro volta sostituiti con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH, arii, benzoil, 1 ,3-diidro-1-osso-2H-isoindolil-2-il, 2-tienilcarbonil, ossifenil, ossi-Ci-C6-alchil oppure CrC6-alchil (lineare o ramificato, comprendente 1-2 doppi legami o un triplo legame), di sua volta sostituito con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI,

Tra i nitrili aromatici, i nitrili aromatici perferiti secondo la presente invenzione sono costituiti da un gruppo nitrilico sostituito con un gruppo arilico che può essere omociclico oppure eterociclico comprendente 4-14 atomi di carbonio e, eventualmente, 1-3 eteroatomi scelti da O, S, N. Tra i gruppi arilici sono da nominare ad esempio il gruppo fenilico, naftilico oppure i loro omologhi eteroarilici. Il gruppo arilico può essere di sua volta sostituito con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH, arii, oppure Ci-C6-alchil (lineare o ramificato, comprendente 1-2 doppi legami o un triplo legame), di sua volta sostituito con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH.

I nitrili aromatici particolarmente preferiti secondo la presente invenzione sono il benzonitrile, il 2-furilnitrile, ed il 2-piridilnitrile.

Ulteriori substrati convertibili mediante i biocatalizzatori della presente invenzione sono le ammidi di formula R-CONH2, in cui R costituisce un residuo organico. Sono preferite le ammidi alifatiche in cui R è un gruppo alifatico, le ammidi arilalchiliche in cui R è un gruppo arilachilico e le ammidi aromatiche in cui R è un gruppo aromatico.

Tra le ammidi alifatiche, le ammidi alifatiche preferite secondo la presente invenzione sono quelle in cui R è un gruppo alifatico lineare, ramificato o ciclico e comprende 1-20 atomi di carbonio ed eventualmente 1-2 eteroatomi scelti da O, S, N. R può essere saturo oppure contenere 1-4 legami doppi e/o 1-3 legami tripli. Inoltre R può essere sostituito con 1-5 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH, ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, cicloesil, cicloeptil. Nel caso della presenza di gruppi cicloalifatici, questi ultimi possono contenere 1-2 eteroatomi scelti da O, S, N, possono contenere 1-2 doppi legami e possono essere sostituiti di loro volta con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH oppure Ci-C6-alchil (lineare o ramificato, comprendente 1-2 doppi legami 0 un triplo legame), di sua volta sostituito con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH.

Le ammidi alifatiche particolarmente preferite secondo la presente invenzione sono la 2-piperidilammide, la 2-metilbutirroammide, la 2-metilpentanoammide, la 3-metil-pentanoammide, la 2-metilesanoammide.

Tra le ammidi arilalchiliche sono preferite ad esempio le ametilarilacetoammidi (oppure “arilpropioammidi”), specialmente ad esempio le ammidi che (-mediante il rimpiazzamento formale di CONH2 con COOH-) sono i precursori della classe di composti farmaceutici denominati profeni. Una serie di ammidi arilachiliche particolarmente preferite secondo la presente invenzione è costituita da ammidi alifatiche come sopra sostituite di loro volta con 1-4 gruppi arilici (“aromatici”) o eteroarilici (“eteroaromatici”) comprendenti 4-14 atomi di carbonio e, eventualmente, 1-3 eteroatomi scelti da O, S, N. Tra i gruppi arilici sono da nominare ad esempio il gruppo fenilico, naftilico oppure i loro omologhi eteroarilici oppure il gruppo furilico. I gruppi arilici possono essere di loro volta sostituiti con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH, arii, benzoli, 1 ,3-diidro-1-osso-2H-isoindolil-2-il, 2-tienilcarbonil, ossi-Ci-C6-alchil, ossifenil, oppure CrC6-alchil (lineare o ramificato, comprendente 1-2 doppi legami o un triplo legame), di sua volta sostituito con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH.

Ammidi arilalchiliche particolarmente preferite secondo la presente invenzione sono la mandeloammide, la p-(aminometil)-4-clorobenzenpropioammide, la a-fenil-2-piperidil-acetammide, la a-fenil-2-piridil-acetammide, la 2-(3-benzoilfenil)propioammide, la oc-metH-3-fenossibenzen-acetoammide, la 2-fluoro-a-metil[1 ,T-bifenil]-4-acetoammide, la 4-(1 ,3-diidro-1-osso-2H-isoindolil-2-il)-ametilbenzenacetoammide, la a-metil-4-(2-metilpropil)benzenacetoammide, la a-metil-4-(2-tienilcarbonil)benzenacetoammide.

Tra le ammidi aromatiche, le ammidi aromatiche preferite secondo la presente invenzione sono costituite da un gruppo ammidico sostituito con un gruppo arilico che può essere omociclico oppure eterociclico comprendente 4-14 atomi di carbonio e, eventualmente, 1-3 eteroatomi scelti da 0, S, N. Tra i gruppi arilici sono da nominare ad esempio il gruppo fenilico, naftilico oppure i loro omologhi eteroarilici. Il gruppo arilico può essere di sua volta sostituito con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH, arii, oppure CrC6-alchil (lineare o ramificato, comprendente 1-2 doppi legami o un triplo legame), di sua volta sostituito con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH.

Le ammidi aromatiche particolarmente preferite secondo la presente invenzione sono la benzammide, la 2-furilammide, e la 2-piridilammide. Ulteriori substrati convertibili mediante i biocatalizzatori della presente invenzione sono i dinitrili di formula generale NC-R-CN in cui R costituisce un residuo organico.

Secondo una forma di realizzazione preferita della presente invenzione sono preferiti i dinitrili in cui R costituisce un gruppo alchilenico lineare, ramificato o ciclico e comprende 1-20 atomi di carbonio ed eventualmente T-2 eteroatomi scelti da O, S, N. R può essere saturo oppure contenere 1-4 legami doppi e/o 1-3 legami tripli. Inoltre, R può essere sostituito con 1-5 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH, ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, cicloesil, cicloeptil, arii. Nel caso della presenza di gruppi cicloalifatici, questi ultimi possono contenere 1-2 eteroatomi scelti da O, S, N, possono contenere 1-2 doppi legami e possono essere sostituiti di loro volta con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH oppure CrC6-alchil (lineare o ramificato, comprendente 1-2 doppi legami o un triplo legame), di sua volta sostituito con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2I CHO, COOH. Nel caso della presenza di gruppi arilici, questi ultimi possono contenere 4-14 atomi di carbonio e, eventualmente, 1-2 eteroatomi scelti da O, S, N, e possono essere sostituiti di loro volta con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH oppure C-i-C6-alchil (lineare o ramificato, comprendente 1-2 doppi legami o un triplo legame), di sua volta sostituito con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH. Gruppi arilici preferiti sono costituiti da fenil, naftil e piridil.

Secondo una ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione, sono preferiti i dinitrili in cui R costituisce gruppo arilico (“arilenico”) che può essere omociclico oppure eterociclico comprendente 4-14 atomi di carbonio e, eventualmente, 1-3 eteroatomi scelti da O, S, N. Tra i gruppi arilici sono da nominare ad esempio il gruppo fenilenico, naftilenico oppure i loro omologhi eteroarilici. Il gruppo arilico può essere di sua volta sostituito con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH, arii, oppure Ci-C6-alchil (lineare o ramificato, comprendente 1-2 doppi legami o un triplo legame), di sua volta sostituito con 1-3 dei seguenti gruppi: F, CI, Br, J, OH, SH, NH2, CHO, COOH.

Tra i dinitrili particolarmente preferiti secondo la presente invenzione sono da nominare il 2-metilfenilmalononitrile,ed il 1 ,3-benzodinitrile.

Una conversione utilizzante il biocatalizzatore della presente invenzione è la conversione di nitrili nei rispettivi acidi. Per questa conversione, si fa reagire il substrato nitrilico alifatico, arialalchilnitrilico oppure arilnitrilico come sopra assieme al biocatalizzatore in una soluzione tampone come sopra controllando con adatti mezzi analitici la formazione dell’acido desiderato. La reazione viene interrotta mediante centrifugazione e/o decantazione del biocatalizzatore dopo ottenimento della resa di acido desiderata e l’acido viene isolato. I tempi nonché le temperature di reazione variano a seconda del substrato specifico scelto e potranno essere adeguatamente ottimizzati dall’esperto del ramo in maniera da ottenere, mediante la attività nitrile idratasica ed amidasica, -per almeno una frazione pari al 20% del substrato nitrilico iniziale, una idrolisi completa del nitrile a dare il rispettivo acido.

Una ulteriore conversione utilizzante il biocatalizzatore della presente invenzione è la conversione di nitrili nelle rispettive ammidi. Per questa conversione, si fa reagire il substrato nitrilico alifatico, arialalchilnitrilico oppure arilnitrilico come sopra assieme al biocatalizzatore in una soluzione tampone come sopra controllando con adatti mezzi analitici la formazione dell’acido desiderato. La reazione viene interrotta mediante centrifugazione e/o decantazione del biocatalizzatore dopo ottenimento della resa di ammide desiderata e l’ammide viene isolata. I tempi nonché le temperature di reazione variano a seconda del substrato specifico scelto e potranno essere adeguatamente ottimizzati dall’esperto del ramo in maniera tale da fare prevalere la attività nitrile idratasica, in maniera da ottenere una frazione ammidica pari almeno al 15% del substrato nitrilico iniziale. Secondo una forma di realizzazione preferita, a tali fini, è possibile per esempio inibire l’attività amidasica del biocatalizzatore mediante aggiunta di dietilfosforamidato alla miscela di reazione.

Una ulteriore conversione utilizzante il biocatalizzatore della presente invenzione è la conversione di ammidi nei rispettivi acidi. Per questa conversione, si fa reagire il substrato ammidico alifatico, arialalchilammidico oppure arilammidico come sopra assieme al biocatalizzatore in una soluzione tampone come sopra controllando con adatti mezzi analitici la formazione dell’acido desiderato. La reazione viene interrotta mediante centrifugazione e/o decantazione del biocatalizzatore dopo ottenimento della resa di acido desiderata e l’acido viene isolato. I tempi nonché le temperature di reazione variano a seconda del substrato specifico scelto e potranno essere adeguatamente ottimizzati dall’esperto del ramo.

Una ulteriore conversione utilizzante il biocatalizzatore della presente invenzione è l’idratazione o idrolisi regioselettiva di dinitrili a dare i rispettivi derivati mononitril-monoammidici e/o mononitril-monoacidici e/o monoammidici-monoacidici. Per questa conversione, si fa reagire il substrato dinitrilico come sopra assieme al biocatalizzatore in una soluzione tampone come sopra controllando con adatti mezzi analitici la formazione del derivato mononitril-ammidico e/o mononitrilacidico e/o monoammidico-monoacidico desiderato. La reazione viene interrotta mediante centrifugazione e/o decantazione del biocatalizzatore dopo ottenimento della resa di prodotto desiderato ed il prodotto viene isolato. I tempi nonché le temperature di reazione variano a seconda del substrato specifico scelto e potranno essere adeguatamente ottimizzati dall’esperto del ramo.

Secondo una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, si sottopone alle conversioni come sopra utilizzanti il biocatalizzatore secondo l’invenzione dei substrati (nitrilici, ammidici o dinitrilici) chirali in forma racemica. La enantioselettività dei biocatalizzatori secondo la presente invenzione determina la conversione preferita di uno dei due enantiomeri contenuti nel substrato racemico. Ad esempio, si è trovato nell’ambito della sperimentazione condotta dagli inventori che i biocatalizzatori ottenuti dal microorganismo Agrobacterìum radiobacter 30”60 NCIMB 41108, particolarmente preferito nell’ambito della presente invenzione, mostrano una spiccata S-enantioselettività per entrambe attività enzimatiche, ossia l’attività nitrile idratasica e amidasica.

Secondo una ulteriore forma di realizzazione preferita della presente invenzione, si sottopone alle conversioni come sopra utilizzanti il biocatalizzatore secondo l’invenzione dei substrati dinitrilici prochirali. Enantioselettività per l’S-enantiomero.

Secondo una realizzazione preferita, la conversione enantioselettiva di nitriti in forma racemica a dare i rispettivi S-acidi avviene in una unica reazione che comprende due fasi susseguenti: una fase a) di conversione enantioselettiva di nitrili racemici ad S-ammidi e una fase b) di conversione enantioselettiva di S-ammidi ad S-acidi. Poiché le due fasi a) e b) sono attive anche indipendentemente l’una dall’altra, due ulteriori aspetti dell’invenzione sono costituiti rispettivamente da: a’) un procedimento per la conversione enantioselettiva di nitrili racemici a dare le S-ammidi e b’) un procedimento per la conversione di ammidi race miche a dare gli S-acidi, caratterizzato dal fatto di utilizzare i microorganismi secondo l’invenzione. È da notare che nel caso della conversione di nitrili racemici a dare i rispettivi S-acidi, risulta spesso anche isolabile una percentuale di R-ammide che, benché venga formata molto più lentamente nella prima fase a) sotto influenza dell’attività nitrite idratasica (specifica, appunto per l'S-nitrile), una volta formata non viene più processata daN’amidasi in fase b) che è specifica per la S-ammide che viene convertita nell S-acido. È da notare comunque che nei casi in cui si volesse isolare specificamente la R-ammide con rese elevate, è auspicabile partire con l'ammide racemica come substrato (fase b’)) e quindi recuperare l’R-enantiomero non processato a formazione delI’S-acido compiuta. Il procedimento di conversione enantioselettiva dei nitrili racemici ai rispettivi S-acidi tramite le rispettive S-ammidi utilizza come substrati nitrili in forma racemica, scelti tra: nitrili aril-alchilici e nitrili alifatici come definiti sopra.

Particolarmente preferiti tra i nitrili aril-alchilici nella reazione di conversione comprendente le due fasi a) e b) sono gli ocmetilarilacetonitrili (“propionitrili"). Appartengono a questa classe i nitrili racemici precursori dei profeni, molecole di notevole interesse farmaceutico in forma enantiomericamente pura. Pertanto, secondo questo aspetto particolarmente preferito, l’invenzione riguarda i procedimenti per la preparazione enantioselettiva dell’acido S-a-metil-3-fenoxibenzen-acetico (fenoprofene), dell’acido S-2-fluoro-oc-metil[1 ,1’-bifenil]-4-acetico (flurbiprofene), dell’acido S-4-(1 ,3)-diidro-1-oxo-2H-isoindol-2il)-a-metilbenzenacetico (indoprofene), dell’acido S-a-metil-4-(2-tienilcarbonil)benzenacetico (suprofene), dell’acido S-a-metil-4-(2-metilpropil)benzenacetico (ibuprofene).

In particolare è stato osservato che la reazione di conversione enantioselettiva, in particolare degli α-metil-arilacetonitrili presenta un optimum di temperatura a temperature comprese tra 38 e 42°C: in queste condizioni la resa di conversione dell’acido in forma enantiomericamente pura è particolarmente vantaggiosa.

È inoltre da notare che nella reazione di conversione secondo la fase b’) sono particolarmente preferite, tra le ammidi aril-alchiliche, le ametilarilacetoammidi (“propioammidi”). Appartengono a questa classe le ammidi racemiche precursori dei profeni, molecole di notevole interesse farmaceutico in forma enantiomericamente pura. Pertanto, secondo questo aspetto particolarmente preferito, l’invenzione riguarda anche i procedimenti per la preparazione enantioselettiva dell’acido S-oc-metil-3-fenoxibenzen-acetico (fenoprofene), dell’acido S-2-fluoro-a-metil[1 ,1’-bifenil]-4-acetico (flurbiprofene), dell’acido S-4-(1,3)-diidro-1-oxo-2H-isoindol-2il)-oc-metilbenzenacetico (indoprofene), dell’acido S-a-metil-4-(2^tienilcarbonil)benzenacetico (suprofene), dell’acido S-a-metil-4-(2-metilpropil)benzenacetico (ibuprofene) che si basano sull’utilizzo dei relativi precursori ammidici come substrato.

Nella reazione di conversione da nitrili racemici ad S-acidi e in quella da ammidi racemiche ad S-acidi sono anche particolarmente preferiti i precursori alitatici (nitrili o ammidi). Tra i nitrili alifatici come sopra e tra le ammidi alifatiche come sopra sono particolarmente preferite quelle che sono precursori di acidi o relativi esteri utilizzabili come aromatizzanti quali l’acido 2-metilbutirrico (che da un sapore di frutta), l’acido 2-metilpentanoico (che da un sapore di formaggio), l’estere metilico dell’acido 2-metilpentanoico (che viene utilizzato in cibi cotti al forno, prodotti di carne e dolci), l’estere etilico dell’acido 2-metilpentanoico (che da sapore di ananas e mela), l’estere etilico dell’acido 3-metilpentanoico (che da sapore di ananas e mela) e l’acido 2-metilesanoico (che da sapore di formaggio oppure di frutti tropicali) e che in passato, per motivi di semplicità, venivano spesso impiegati in forma racemica. La presente invenzione mette quindi a disposizione un accesso elegante alla sintesi enantioselettiva degli aromatizzanti (oppure, nel caso dei rispettivi esteri, di loro precursori) come sopra. E’ stato inoltre osservato che i microorganismi secondo l’invenzione sono in grado di convertire in modo regioselettivo (e preferibilmente enantioselettivo) dinitrili come sopraa dare i rispettivi derivati mononitril-monoammidici e/o mononitrilacidici e/o monoammidici-monoacidici. Pertanto secondo un suo ulteriore aspetto, l’invenzione riguarda un procedimento per la conversione regioselettiva (preferibilmente enantioselettiva) di dinitrili di formula generale come sopra definita.

PARTE SPERIMENTALE.

Esempio 1. Mutagenesi del ceppo parentale.

Il ceppo parentale, caratterizzato come Agrobacterìum radiobacter, fu isolato da un estratto batterico grezzo con attività antibiotica. Per individuare qualche attività verso substrati nitrilici, esso fu sottocoltivato in terreno contenente butirronitrile e dopo qualche passaggio e induzione con valeronitrile, fu evidenziata una debole attività nitrileidratasica/amidasica su benzoilfenilpropionitrile (BPN) del ceppo “wildtype” cosi selezionato. Per ottenere un ceppo semicostitutivo un aliquota del ceppo parentale “wild-type” fu assoggettata ad un trattamento di mutagenesi, costituito da due cicli di trattamento con etilmetansulfonato, un ciclo con nitrosoguanidina e due di mutagenesi con irradiazione UV. Ad ogni passaggio di mutagenesi una aliquota della coltura fu saggiata per verificare l’attività di conversione dei nitrili (Figura 1).

I protocolli di mutagenesi furono adattati al’Agrobacterium radiobacter da Ausubel, F.M. et al. "Current Protocols in Molecular Biology” Edizioni Wiley Interscience voi. 2, sez. 13.3.1 , 1994 e sono qui riportati brevemente per completezza.

1 ) Trattamento con Etilmetan-sulfonato (EMS).

Una coltura cresciuta a saturazione fu centrifugata e lavata due volte con tampone potassio fosfato 0.05 M, pH 7.2. Aliquote di 1.7 mi di batteri in tampone sterile (circa 6.6 x 107 cellule) furono addizionate con 50 μml di EMS e incubate a 30°C per 1 h sotto agitazione. 200 μιml della sospensione batterica mutagenizzata furono aggiunti a 8 mi di una soluzione-di Na2S203 al 5% per bloccare la reazione. I batteri furono quindi centrifugati e lavati due volte per allontanare l’agente mutageno.

2)Trattamento con nitrosoguanidina (N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina, NTG).

Una coltura cresciuta a saturazione fu centrifugata e lavata due volte con tampone di potassio fosfato 0.05 M, pH 7.2. Aliquote di 1.7 mi di batteri in tampone sterile (circa 6.6 x 107 cellule), furono addizionate con 150 pg/ml di NTG ed incubate a 30°C 1 h sotto agitazione. 200 μΙ della sospensione batterica mutagenizzata furono aggiunti a 8 mi di una soluzione di Na2S203 al 5 %, per bloccare la reazione. I batteri furono quindi centrifugati e lavati due volte per allontanare l’agente mutageno.

3)Trattamento con UV.

Una coltura cresciuta a saturazione fu centrifugata e lavata due volte con tampone di potassio fosfato 0.05 M, pH 7.2. Dopo centrifugazione, i batteri (circa 2 x 10<8>) furono risospesi in 5 mi di H2O bidistillata sterile e soggetti ad irradiazione UV a 254 nm, utilizzando 300 ergs/mm<2>. Il tempo di irradiazione variava da 15” a 90”. In queste condizioni la sopravvivenza della coltura batterica andava dal 40 al 70%.

Il trattamento di mutagenesi completo comprendente 5 passaggi, ossia che comprendeva due passaggi di trattamento con EMS, uno con NTG, nonché due irradiazioni con UV, la prima di 30 secondi, e la seconda di 60 secondi, è rappresentato schematicamente in Figura 2.

Per selezionare l’attività nitrile-idratasica/amidasica, circa 100 batteri/ piastra furono fatti crescere utilizzando composti nitrilici 0 ammidici come unica fonte di azoto e fonti di carbonio minime. Circa 200 colonie furono isolate<l>e saggiate per l’attività di conversione dei nitrili.

In Figura 1 è riportato lo schema del trattamento completo con cui fu ottenuto il ceppo semicostitutivo 41108 dotato di attività di conversione dei nitrili, denominato Agrobacterium radiobacter 30”60, e depositato presso il centro abilitato NCIMB, in data 3 Maggio 2001.

Esempio 2. Caratterizzazione del ceppo semicostitutivo Agrobacterium radiobacter 30’ΰΟ n° 41108.

Le caratteristiche relative al ceppo isolato sono riassunte in tabella 1 e sono inoltre qui di seguito brevemente commentate.

Caratteristiche morfologiche.

Il ceppo Agrobacterium radiobacter 30”60 si presenta come un bastoncello di circa 0.8 μιτι per 1.5-3 μιτι. Al microscopio appare mobile, non forma spore ed è Gram-negativo dopo opportuna colorazione. Partendo dal ceppo liofilizzato, dopo 48 ore di crescita su terreno solido (seed-agar) il ceppo forma colonie rugose, tonde, di 1.2 mm di diametro e di colore bianco avorio.

Proprietà colturali e di crescita. Il ceppo rappresenta un aerobio obbligato e non riduce i nitrati. E’ ossidasi negativo e catalasi positivo, contrariamente ai ceppo parentale. Il ceppo cresce ad un pH compreso tra 6-9 e ad una temperatura compresa tra 5 e 45°C. Non produce acido da: glicerolo ed dai seguenti zuccheri: glucosio, fruttosio, maltosio, saccarosio, sorbitolo, mannitolo, lattosio, amido Non riduce i nitrati, non produce indolo o solfuro di idrogeno, né produce gas da un singolo zucchero. Utilizza fonti di azoto inorganiche e mannosio, fruttosio, galattosio, maltosio, lattosio, amido, gluconato, malato e succinato e come fonte di carbonio unica. Caprato, adipato e citrato non sono utilizzati.

Tabella 1. Caratteristiche morfologiche colturali e fisiologiche del batterio Agrobacterium radiobacter 3C"60 (NCIMB 41108) secondo la classificazione API 20 NE (% id = 99,6; T = 0,72; 99% - very good Identification).

Esempio 3. Preparazione del biocatalizzatore batterico dal ceppo mutagenizzato NCIMB 41108.

L’attività enzimatica fu valutata utilizzando un pellet batterico ottenuto dopo fermentazione per 48 ore in terreno di fermentazione come descritto di seguito. In breve la coltura fu amplificata da una singola colonia dapprima in un piccolo volume di terreno di inoculo e quindi, a scopo preparativo, in terreno di fermentazione da 100 mi.

Terreno di inoculo', peptone 10g/L, Estratto di lievito 10 g/L, NaCI 5g/L, glucosio 5g/L. Il pH del terreno fu portato a pH7.2 con NaOH e sterilizzato.

di fermentazione da soli o in combinazione, sterilmente, ad una concentrazione finale compresa tra 0.5-5 g/L. In particolare valeronitrile, N-butirronitrile e caprolattame furono utilizzati ad una concentrazione rispettivamente di 2.5 g/l ed aggiunto in unica soluzione all’avvio del processo. Per misurare l’attività basale del ceppo 41108, non fu aggiunto alcun induttore al terreno di fermentazione.

Pre-inocuio. Fu effettuata da uno slant batterico in agar in 50 mi di terreno di inoculo, in una fiasca da 250 mi e cresciuto a 30°C, per 16-24 ore a 180 rpm.

Inoculo. 10 mi del pre-inoculo, furono inoculati in 100 mi di terreno di fermentazione contenente o meno l’induttore, in una fiasca da 0.5L e cresciuti a 30°C, per 24-72 ore, con agitazione di 300 rpm. (Se eseguita in scala più grande, ad esempio in fermentatore da 10 I, l’areazione veniva effettuata alla pressione di 0.5 Kg/cm2 e ad una portata di 1.0 wm con aria essiccata e sterilizzata per filtrazione.) I batteri furono recuperati mediante centrifugazione ed il precipitato {pellet ) batterico lavato due volte con soluzione fisiologica salina e mantenuto a 4°C fino al momento dell’uso (pellet batterico umido o pasta batterica). Tale precipitato batterico costituisce il biocatalizzatore batterico.

Esempio 4. Caratterizzazione dell’attività enzimatica del ceppo NCIMB 41108.

Metodi analitici.

Schema di reazione. Alla pasta cellulare (250 mg, se non indicato diversamente) in tampone fosfato 35 mM, pH 7.7 (5 mi, se non indicato diversamente), contenente Triton X-100 o Tween 80 in concentrazione finale 2.66%, fu aggiunta la soluzione del substrato sciolto in metanolo in un volume pari a 5-10% del volume finale (250 μΙ, se non indicato diversamente) e la miscela di reazione fu incubata a 30°C oppure ad altre temperature, come indicato negli esempi. Ad intervalli di tempo prestabiliti, aliquote della miscela furono prelevate sterilmente con una siringa, utilizzando il filtro Minisart RC 25 filter 0,22 mm (Sartorius, Germany) ed analizzate direttamente tramite HPLC. L’attività enzimatica fu determinata dall’attività media misurata nella fase iniziale lineare della curva di conversione, relativamente al peso umido della pasta batterica. Le attività specifiche U (μmol min"1) per grammo di peso umido furono indicate come lU g'1.

Misurazione delle percentuali di conversione e degli eccessi enatiomerici. Le percentuali di conversione del substrato furono misurate mediante HPLC in fase inversa utilizzando una colonna a fase inversa di dimensioni: 250 x 4.6 mm; 10 μm (Lichrosorb 10 RP18), e tampone fosfato in varie percentuali (10 mM, pH 2.5 e 3.5) con acetonitrile al 40 o 50% a secondo delle molecole da rilevare. Fu utilizzata una velocità di flusso di 1.0 mi min"1, e lunghezza d’onda di rivelazione a 220-254 nm. I valori e.e. dei derivati del benzoilfenilpropionitrile furono determinati mediante HPLC dotata di colonna chirale (dimensioni: 100 x 4 mm; Chromtech AGP-column) ed utilizzando come eluente tampone fosfato (10 mM, pH 7.0) con isopropanolo (1%, v/v) e dimetiloctilammina (0.02%, v/v). Eccessi enantiomerici di acido α-fenilpropionico furono determinati mediante HPLC sulla stessa colonna (100 x 4 mm; Chromtech AGP-column), utilizzando come eluente tampone fosfato (10 mM, pH 5.0, ) con dimetiloctilammina (0.04%, v/v). Il valore e.e. di nitrili alitatici fu determinato mediante gas-cromatografia su apparecchio Mega avente le seguenti caratteristiche: dimensioni della colonna 25 m x 0.25 mm; idrogeno 0.4 bar; temperatura di partenza: 40 °C, isoterma 5 min, 1.5 °C/min per i 180 °C. Temperature di iniezione: 220 °C; temperatura di detectamento 250 °C; fase: diacetil tertbutilsilil-β-ciclodestrina (OV1701).

Esempio 5. Utilizzo del biocatalizzatore batterico per la conversione di nitrili arilalchilici (2-(3-benzoilfenil)propionitrile).

5.1. Produzione di acido S-(+)-ketoprofenico da benzoH-fenil-propionitrìle in condizioni basali utilizzando come biocatalizzatore il pellet batterico del ceppo NCIMB 41108 non indotto.

Al fine di determinare quali fossero le rese e la specificità enantiomerica in condizioni basali (attività enzimatica costitutiva) fu utilizzato il pellet batterico del ceppo 41108 non indotto, secondo lo schema di reazione indicato in esempio 4: a 50 mg di benzoilfenilpropionitrile in 250 μΙ di metanolo, furono aggiunti 5 mi di tampone ΚΗ2ΡΟ4 pH 7.7, contenente il 2.66% di Triton X-100 e 250 mg di pellet batterico umido, non indotto, preparato come descritto nell’esempio 3. La soluzione fu incubata a 30°C ed agitata. Dopo 17 ore di reazione l’analisi HPLC dimostrò la presenza di benzoilfenilpropionammide (2%) e di acido S-(+)-benzoilfenilpropionico (ketoprofene) (8%, e. e. > 99%) ed un’attività enzimatica di 0.08 lU g<‘1 >di cellule umide.

5.2. Produzione di acido S-(+)-ketoprofenico da benzoil-fenil-propionitrile utilizzando come biocatalizzatore il pellet batterico del ceppo NCIMB 41108 indotto con valeronitrìle.

Fu utilizzato lo schema di reazione descritto nell’esempio 4: a 50 mg di benzoilfenilpropionitrile racemico in 250 μΙ di metanolo, furono aggiunti 5 mi di tampone KH2PO4, pH 7.7 , contenente il 2.66% di Triton X-100 e 250 mg di pellet batterico umido, derivato da cellule indotte con valeronitrìle, preparate come descritto nell’esempio 3. La soluzione fu incubata a 30°C in agitazione. Dopo 17 ore di reazione l’analisi HPLC dimostrò la totale conversione del substrato e la presenza di S-(+)-benzoilfenilpropionammide (55%) e di acido S-(+)-benzoilfenilpropionico (S-ketoprofene) (45%, e.e. > 96 %) ed un’attività enzimatica di 0.83 ILI g<" >

<1 >di cellule umide.

5.3. Produzione di ammide S-(+)-ketoprofenica da benzoil-fenilpropionitrile utilizzando come biocatalizzatore il pellet batterico del ceppo NCIMB 41108 indotto con valeronitrile.

L’attività enzimatica fu valutata dopo reazione effettuata secondo lo schema riportato in Esempio 4: a 50 mg di benzoilfenilpropionitrile racemico in 250 μΙ di metanolo, furono aggiunti 5 mi di tampone KH2P04, pH 7.7, contenente il 2.66% di Triton X-100 e 250 mg di pellet batterico umido, derivato da cellule indotte con valeronitrile, preparato come descritto nell’esempio 3. La soluzione fu incubata a 30°C per 1 ora. Trascorso questo tempo l’HPLC mostrò la presenza di S-benzoilfenilpropionammide (40%, e.e. >95%) ed un’attività enzimatica pari a 5.66 lU g<'1 >di cellule umide.

5.4. Effetto della temperatura sulla conversione di benzoil-fenilpropionitrile utilizzando come biocatalizzatore il pellet batterico del ceppo NCIMB 41108 indotto con valeronitrile.

Per comparare<; >l’effetto- della temperatura sull’attività enzimatica l’esperimento fu ripetuto in modo uguale a quanto descritto nel paragrafo precedente, eccetto che per la temperatura di reazione che fu di 40°C. La rilevazione dei prodotti della reazione fu effettuata dopo 1 ora e dopo 17 ore. Dopo 1 ora l’HPLC mostrò la presenza di acido S-(+)-benzoilfenilpropionico (6%, e.e. >99%), di S-(+)-benzoilfenilpropionammide (30%, e.e. >95%) e benzoilfenilpropionitrile (64%). Dopo 17 ore l’HPLC mostrò la presenza di acido S-(+)-2-(3-benzoilfenil)propionico (S-(+)-ketoprofen) (44%, e.e. >98%) e benzoilfenilpropionitrile (56%). I dati dimostrano che a 40°C l’attività amidasica è maggiore che a 30°C. Tale caratteristica, oltre che alla temperatura, è legata alla disponibilità del solo enantiomero di preferenza e ciò, grazie alla elevata enantioselettività che la nitrile idratasi acquista a tale temperatura.

5.5. Effetto dell’induzione con valeronitrile e ε-caprolattame.

L’esperimento fu ripetuto utilizzando come estratti batterici totali, nelle stesse condizioni di reazione già descritte, a 30°C per 17 ore, il pellet batterico indotto con valeronitrile e ε-caprolattame nella fase di fermentazione. Dopo tale periodo l’analisi HPLC mostrò benzoilfenilpropionammide (51 %) e acido S-(+)-benzoilfenilpropionico (48%, e.e. >80%). I dati dimostrarono che l'efficienza enantioselettiva della reazione può essere modulata dalla struttura della molecola induttrice e/o dall'associazione di più molecole con funzione induttrice, nonché a seconda del substrato che si intende processare.

Esempio 6. Produzione di profeni dai corrispondenti nitrili.

6. 1.Conversione del precursore del fenoprofene utilizzando come biocatalizzatore il pellet batterico del ceppo NCIMB 41108 indotto con valeronitrile.

A 50 mg di a-metil-3-fenoxibenzen-acetonitrile racemico in 250 μΙ di metanolo, furono aggiunti 5 mi di tampone KH2P04, pH 7.7 e contenente il 2.66% di Triton X-100 e 250 mg di pellet batterico umido, derivato da cellule indotte con valeronitrile, preparato come descritto nell’esempio 3, secondo lo schema di reazione descritto La soluzione fu incubata a 30°C per 1 ora. Trascorso questo tempo l’HPLC mostrò la presenza di ametil-3-fenoxibenzen-acetoammide (25%) ed un’attività enzimatica pari a 5.23 lU g'1 di cellule umide, di acido S-a-metil-3-fenoxibenzen-acetico (S-fenoprofene) (10.4%, e.e.>98%) e di nitrile pari al 64%.

Esempio 7. Produzione di acido S-(+)-2-fenilpropionico da αmetilbenzil-cianuro utilizzando come biocatalizzatore il pellet batterico del ceppo NCIMB 41108 indotto con valeronitrile ed εcaprolattame.

La reazione fu condotta secondo lo schema di reazione descritto, ma variando i rapporti substrato/pellet batterico come segue: a 100 mg di αmetilbenzilcianuro in 250 μΙ di metanolo, furono aggiunti 5 mi di tampone KH2PO4, pH 7.7, contenente il 2.66% di Triton X-100 e 100 mg di pellet batterico umido, indotto con valeronitrile ed ε-caprolattame, preparato come descritto nell’esempio 3. La soluzione fu incubata a 30°C ed agitata. Dopo 8 ore di reazione l’analisi HPLC dimostrò la presenza di fenilpropionammide (55%) e di acido S-(+)-2-fenilpropionico (45%, e.e.=96%) ed un’attività enzimatica di 15.88 lU g"1 di cellule umide. ·

I dati dimostrano che tale molecola viene trasformata con una velocità circa 20 volte superiore.

Esempio 8. Conversione di dinitrili utilizzando come biocatalizzatore il pellet batterico del ceppo NCIMB 41108 indotto con valeronitrile.

8.1. Produzione di 2-metil-fenil-malononitrile-monoamide da 2-metil-fenilmalononitrile.

La reazione fu condotta come descritto nell’esempio 4 al paragrafo: Misurazione dell’attività enzimatica: a 100 mg di metilfenilmalononitrile sciolti in 250 μΙ di metanolo, furono aggiunti 5 mi di tampone KH2PO4, pH 7.7, contenente il 2.66% di Triton X-100 e 100 mg di pellet batterico umido, indotto con valeronitrile preparato come descritto nell’esempio 3. La soluzione fu incubata a 30°C ed agitata. Dopo 1,5 ore di reazione l’analisi HPLC dimostrò la presenza di 2-metilfenilmalononitrile (20%) e di 2-metilfenilmalononitrileammide (80%).

I dati dimostrano che la reazione è regioselettiva.

Esempio 9. Conversione di nitrili alitatici utilizzando come biocatalizzatore il pellet batterico del ceppo NCIMB 41108 indotto con valeronitrile.

9.1. Produzione di acido S-(+)-2-metil-pentanoico da 2-metilpentanonitrìle.

La reazione fu condotta secondo lo schema di reazione dell’esempio 4, con le seguenti variazioni: a 100 mg di 2-metil-pentanonitrile sciolti in 250 μΙ di metanolo, furono aggiunti 5 mi di tampone KH2PO4, pH 7.7, contenente il 2.66% di Triton X-100 e e 100 mg di pellet batterico umido indotto con valeronitrile, preparato come descritto nell’esempio 3. La soluzione fu incubata a 30°C ed agitata. Dopo 4 ore di reazione l’analisi al Gas-cromatografo mostrò la presenza di 2-metil-pentanoammide (53%) e di acido (S-(+)-2-metil-pentanoico (47%, e.e.=96), con un’attività enzimatica di 35.9 lU g'1 di cellule umide.

9.2. Produzione di acido (S)-(+)2-etil esanoico da 2-etilesano nitrite .

La reazione fu condotta come descritto nell’esempio 4 al paragrafo: Misurazione dell’attività enzimatica con le seguenti variazioni: a 100 mg di 2-etil-esanonitrile sciolti in250 μΙ di metanolo, furono aggiunti 5 mi di tampone KH2P04, pH 7.7, contenente il 2.66% di Triton X-100 e 100 mg di pellet batterico umido, indotto con valeronitrile, preparato come descritto nell’esempio 3. La soluzione fu incubata a 30PC ed agitata. Dopo 32 ore di reazione l’analisi al Gas-cromatografo mostrò la presenza di (R)-2-etilesano ammide (52%) e di acido (S)-(+)-2-etilesanoico (45%, e.e.> 98) e con un’attività enzimatica di 3.61 IU g"1 di cellule umide.

Esempio 10. Conversione di nitrili aromatici utilizzando come biocatalizzatore il pellet batterico del ceppo NCIMB 41108 indotto con valeronitrile.

10.1. Produzione di acido benzoico a partire da benzonitrile.

La reazione fu condotta secondo lo schema di reazione dell’esempio 4, con le seguenti variazioni: a 50 mg di benzonitrile sciolti in 250 μΙ di metanolo, furono aggiunti 5 mi di tampone KH2PO4, pH 7.7 contenente il 2.66% di Triton X-100 e 250 mg di pellet batterico umido indotto con valeronitrile, preparato come descritto nell’esempio 3. La soluzione fu incubata a 30°C ed agitata. Dopo 17 ore di reazione l’analisi all’HPLC mostrò la presenza di benzonitrile (40%) e di acido benzoico (60%), con un’attività enzimatica di 1.14 IU g 1 di cellule umide.

10.2. Produzione di acido benzoico a partire da benzoammide.

La reazione fu condotta come descritto nell’esempio 4 al paragrafo: Misurazione dell’attività enzimatica con le seguenti variazioni: a 50 mg di benzoammide sciolti in 250 μΙ di metanolo, furono aggiunti 5 mi di tampone KH2PO4, pH 7.7 contenente il 2.66% di Triton X-100 e 250 mg di pellet batterico umido, indotto con valeronitrile, preparato come descritto nell’esempio 3. La soluzione fu incubata a 40°C ed agitata. Dopo 17 ore, fu condotta la prima analisi al’HPLC mostrante che la conversione deH’ammide in acido benzoico era già quantitativa.

Claims (5)

1. Microorganismo appartenente al genere Agrobacterium radiobacter, capace di convertire nitrili e/o ammidi nei rispettivi acidi.

2. Microorganismo secondo la rivendicazione 1 mutagenizzato caratterizzato dalla positività al marcatore enzimatico catalasi e dalla negatività al marcatore enzimatico ossidasi.

3. Microorganismo mutagenizzato Agrobacterium radiobacter 30”60 secondo la rivendicazione 1 o 2 depositato presso il NCIMB con numero di accesso 41108.

4. Procedimento per la conversione di nitrili nei rispettivi acidi caratterizzato dal fatto di utilizzare i microorganismi secondo le rivendicazioni 1-3.

5. Procedimento secondo la rivendicazione 4 in cui tale conversione è enantioselettiva. 6r Procedimento secondo la rivendicazione 4 o 5 dove tale conversione comprende la fase a) di conversione di nitrili ad ammidi e quella b) di conversione di ammidi ad acidi. 7. Procedimento per la conversione di ammidi nei rispettivi acidi caratterizzato dal fatto di utilizzare i microorganismi secondo le rivendicazioni 1-3. 8. Procedimento secondo la rivendicazione 7 in cui la conversione è enantioselettiva. 9. Procedimento secondo la rivendicazione 7 o 8 caratterizzato dal fatto che tali ammidi sono scelte da ammidi alifatiche, ammidi arilalchiliche ed ammidi aromatiche. 10. Procedimento secondo le rivendicazioni 4-6 caratterizzato dal fatto che tali nitrili sono scelti tra: nitrili arilalchilici, nitrili aromatici e nitrili alifatici. 11. Procedimento secondo la rivendicazione 9 o 10 dove tali nitrili arilalchilici o tali ammidi arilalchiliche sono α-metii-arilacetonitrili (“arilpropionitrili”) o α-metil-arilacetoammidi (arilpropioammidi”), preferibilmente precursori di profeni. 12. Procedimento secondo la rivendicazione 11 per la preparazione enantioselettiva dell’acido S-(+)-2-(3-benzoilfenil)propionico (enantiomero farmacologicamente attivo del ketoprofene), dell’acido S-α-metil-3-fenoxibenzen-acetico (enantiomero farmacologicamente attivo del fenoprofene), dell’acido S-2-fluoroα-metil[1,1’-bifenil]-4-acetico (enantiomero farmacologicamente attivo del flurbiprofene), dell’acido S-4-(1,3)-diidro-1-oxo-2H-isoindol-2il)-α-metilbenzenacetico (enantiomero farmacologicamente attivo dell’indoprofen), dell’acido S-α-metil-4-(2-metilpropil)benzenacetico (enantiomero farmacologicamente attivo dell’ibuprofen) oppure dell’acido S-α-metil-4-(2-tienilcarbonil)benzenacetico (enantiomero farmacologicamente attivo del suprofen), in cui la forma racemica del rispettivo precursore α-arilpropionitrilico oppure α-arilpropioammidico viene convertito nel rispettivo S-acido. 13. Procedimento secondo la rivendicazione 9 o 10 dove tali nitrili alifatici o ammidi alifatiche sono precursori di acido 2-metilbutirrico, di acido 2-metilpentanoico, di acido 3-metil-pentanoico e di acido 2-metilesanoico. 14. Procedimento secondo la rivendicazione 9 o 10 caratterizzato dal fatto che tali nitrili arilalchilici e tali ammidi arilalchiliche sono scelti da: mandelonitrile o mandeloammide quali precursori dell’acido mandelico, β-(aminometil)-4-clorobenzenpropionitrile o β-(aminometil)-4-clorobenzenpropionammide quali precursori del baclofen e oc-fenil-2-piperidilacetonitrile o α-fenil-2-piperidilacetammide o α-fenil-2-piridilacetonitrile o α-fenil-2-piridilacetammide quali precursori del methylphenidate. 15. Procedimento secondo la rivendicazione 9 o 10 caratterizzato dal fatto che tali nitrili aromatici e tali ammidi aromatiche sono scelti da: benzonitrile o benzammide, 2-furilnitrile o 2-furilammide, 2-piridilnitrile o 2-piridilammide. 16. Procedimento per la conversione di nitrili ad ammidi caratterizzato dal fatto di utilizzare i microorganismi secondo le rivendicazioni 1-3. 17. Procedimento secondo la rivendicazione 16 caratterizzato dal fatto che tali nitrili sono scelti tra: nitrili arilalchilici, nitrili aromatici o nitrili alifatici. 18. Procedimento secondo la rivendicazione 18 in cui la conversione è enantioselettiva. 19. Procedimento per l’idratazione e/o idrolisi regioselettiva di dinitrili, caratterizzato dal fatto di utilizzare microorganismi secondo le rivendicazioni 1-3. 20. Procedimento secondo la rivendicazione 19 per la conversione regioselettiva e preferibilmente enantioselettiva di dinitrili a dare i rispettivi derivati mononitril-monoammidici e/o mononitril-monoacidi e/o monoammidici-monoacidici. 21. Procedimento secondo la rivendicazione 20 dove tali dinitrili sono scelti da 2-metilfenilmalononitrile e 1 ,3-benzodinitrile. 22. Procedimento secondo le rivendicazioni 4-21 caratterizzato dal fatto che tali microorganismi sono indotti con nitrili o ammidi preferibilmente semplici. 23. Procedimento secondo la rivendicazione 22 nella misura in cui si riferisce alla rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che tali nitrili oppure ammidi induttori sono scelti nel gruppo costituito da: εcaprolattame, isobutirammide, benzammide, valeroammide, butirammide, lattammide, valeronitrile, isovaleronitrile, butirronitrile ed isobutirronitrile. 24. Procedimento secondo la rivendicazione 22 nella misura in cui si riferisce alle rivendicazioni 2 e/o 3, caratterizzato dal fatto che tali nitrili oppure ammidi induttori sono scelti nel gruppo costituito da: εcaprolattame, isobutirammide, benzammide, valeroammide, butirammide, lattammide, valeronitrile, isovaleronitrile, butirronitrile, isobutirronitrile e succinonitrile. 25. Procedimento secondo con le rivendicazioni 4-24 caratterizzato dal fatto che i microorganismi sono utilizzati come coltura batterica pura oppure come omogenato o lisato batterico oppure come estratto cellulare grezzo o semi purificato. 26. Procedimento secondo le rivendicazioni 4-25 caratterizzato dal fatto che tale conversione avviene ad un pH compreso tra 5 e 9.5, preferibilmente compreso tra 7 e 8. 27. Procedimento secondo la rivendicazione 26 caratterizzato dal fatto che tale conversione avviene ad una temperatura compresa tra 5°C e 45°C. 28. Procedimento secondo la rivendicazione 27 dove tale temperatura è compresa tra 28°C e 42°C. 29. Procedimento secondo la rivendicazione 28 dove tale temperatura è compresa tra 28°C -31 °C. 30. Procedimento secondo la rivendicazione 28 dove tale temperatura è compresa tra 38°C -42°C.