JP3249566B2 - S−(+)−2,2−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドの生物工学的製造方法 - Google Patents
S−(+)−2,2−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドの生物工学的製造方法Info
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Description
2−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド中のR−
(−)−2,2−ジメチルシクロプロパンカルボキサミ
ドをR−(−)−2,2−ジメチルシクロプロパンカル
ボン酸に生物変換し、その際二所望するS−(+)−
2,2−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドが沈殿
することを利用した、光学的に活性なS−(+)−2,
2−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドの新規な製
造方法に関する。
ルボキサミドを略号「2,2−DMCPCA」で、2,
2−ジメチルシクロプロパンカルボン酸を「2,2−D
MCPCS」であらわす。
CPCAは、腎臓における腎臓デヒドロペプチダーゼに
よる抗生物質の活性低下を防止するためにペネム−ない
しカルバペネム抗生物質とともに投与される、デヒドロ
ペプチダーゼ抑制剤のシラスタチンを製造する原料とし
て使用される(文献EP048301)。これまでは、
S−(+)−2,2−DMCPCAの化学的製造方法だ
けが知られている。これらの方法には、経費がかかり、
多くの工程を要するという欠点がある(EP15577
9)。
性R,S−(±)−2,2−DMCPCAから出発し、
一工程で、必要とする異性体を高純度で得ることができ
る生物工学的方法を提供することである。
規な方法および請求項10の新規な微生物により達成さ
れる。
(±)−2,2−DMCPCA中のR−(−)−2,2
−DMCPCAをR−(−)−2,2−DMCPCSに
生物変換する能力を有し、その際所望のS−(+)−
2,2−DMCPCAが沈殿する。これらの微生物は、
たとえば土壌、スラッジまたは排水から、従来の微生物
学的手法により分離することができる。
Aの製造には、R−(−)−DMCPCAを基質として
利用するすべての微生物が含まれる。
得ることができる。
の光学異性体の形の2,2−DMCPCA、およびC供
給源により成長する微生物を通常の方法で培養し、 b)この培養菌から、安定しており、ラセミ化合物また
はその光学異性体の形の2,2−DMCPCAを唯一の
N供給源として利用する菌を選択する。
給源として受け入れる微生物を選択するのが有利であ
る。
とえば糖、糖アルコール、カルボン酸またはアルコール
を成長基質として利用することができる。 糖として
は、たとえばフラクトースまたはグルコースを使用でき
る。 糖アルコールとしては、エリスリトール、マンニ
トールまたはソルビトールを使用できる。 カルボン酸
としては、モノ−、ジ−またはトリカルボン酸、たとえ
ば酢酸、マロン酸またはクエン酸を使用できる。 アル
コールとしては1,2または3価のアルコール、たとえ
ばエタノール、グリコールまたはグリセリンを使用でき
る。 好ましくは、C供給源として、3価のアルコー
ル、たとえばグリセリンを使用する。
0:1の範囲内が有利である。
rch. Microbiol.135,1〜7頁,1
983に記載されている鉱物塩培養基のような、この専
門分野で一般的な培養基を使用できる。
異性体の形の2,2−DMCPCA、およびC供給源に
より成長する好ましい微生物は、コマモナス・アシドボ
ランス A:18(DSM−No.6315)、コマモ
ナス・アシドボランスTG308(DSM−No.65
52)、シュードモナス・spNSAK:42(DSM
−No.6433)および微生物バクテリウム・spV
III:II(DSM−No.6316)ならびにそれ
らの子孫および突然変異体である。 菌種DSM−N
o.6315および6316は1991年1月29日
に、DSM−No.6433は1991年3月25日
に、DSM−No.6552は1991年4月6日に、
ドイチェン・ザムルング・フォン・ミクロオルガニズメ
ン・ウント・ツェルクルトゥーレン・GmbH,マシェ
ローデヴェーク1B,D−3300,ブラウンシュバイ
クに寄託してある。
SM−No.6315)の科学的データ: 細胞形状 棒状 幅 μm 0.5〜0.7 長さ μm 1.5〜3.0 移動性 + 鞭毛 極性>1 グラム反応 − 3%KOHによる分解 + アミノペプチダーゼ(Cerny) + 胞子 − オキシダーゼ + カタラーゼ + 成長 嫌気的 − 37/41℃ +/− pH5.6 + マック−コンキー寒天 + SS寒天 + セトリミド寒天 + 色素 非散乱 − 散乱 − 蛍光発生 − ピオシアニン − 酸発生(OF試験) グルコース好気的 − グルコース嫌気的 − グルコースからのガス発生 − 酸発生 グルコース − フラクトース + キシロース − マンニトール + グリセリン + ONPG − ADH − VP − インドール − NO3からNO2 − 脱窒 − フェニルアラニンデスアミナーゼ − サッカロースからのレバン − レシチナーゼ − ウレアーゼ − 加水分解: デンプン − ゼラチン − カゼイン − DNA − ツイーン80 − エスクリン − チロシン分解 − 基質利用 酢酸塩 + アジピン酸塩 + カプリン酸塩 + クエン酸塩 + グリコール酸塩 + レブリン酸塩 + リンゴ酸塩 + マロン酸塩 − フェニル酢酸塩 + L−アラビノース − フラクトース + グルコース − マンノース − マルトース − キシロース − イノシトール − マンニトール + グルコン酸塩 + N−アセチルグルコサミン − L−セリン − L−トリプトファン + アセトアミド + メサコン酸塩 + シトラコン酸 + L−酒石酸 + N供給源 NH4+ ++ R,S−(±)−2,2−ジメチル− シクロプロパンカルボキサミド + ブチルアミド ++ アセトアミド + プロピオンアミド + ホルムアミド ± ベンズアミド + ニコチンアミド + API20NE→Cs.アシドボランス 99.0%コマモナス・アシドボランス TG308(DSM−N
o.6552)の科学的データ: 細胞形状 棒状 グラム−反応(KOH試験) − グラム着色 − 胞子 − 移動性 + ℃成長 37℃ + 41℃ − 45℃ − カタラーゼ + オキシダーゼ + カタラーゼ + グルコース中の発酵(OF試験) − 硝酸塩還元 + インドール生産 − グルコースの酸 − アルギニンデヒドロラーゼ − ウレアーゼ − エスクリン加水分解 − ゼラチン加水分解 − β−ガラクトシダーゼ − グルコース同化 − アラビノース同化 − マンノース同化 − マンニトール同化 + N−アセチルグルコースアミン同化 − マルトース同化 − グルコン酸塩同化 + カプリン酸塩同化 + アジピン酸塩同化 + リンゴ酸塩同化 + クエン酸塩同化 − フェニル酢酸塩同化 + シトクロムオキシダーゼ + NO3からのNO2 + 尿素の加水分解 − フラクトースの利用 + アセトアミドのアルカリ性化 + 酒石酸塩のアルカリ性化 + シモンのクエン酸塩のアルカリ性化 + マロン酸のアルカリ性化 (+) (+)やや陽性シュードモナス・sp NSAK:42(DSM−No.
6433)の科学的データ: 細胞形状 棒状 幅 μm 0.6〜0.8 長さ μm 1.5〜3.0 移動性 + グラム−反応 − 3%KOHによる分解 + アミノペプチダーゼ(Cerny) + 胞子 − オキシダーゼ + カタラーゼ + 成長 嫌気的 − 37/41℃ +/− pH5.6 + マック−コンキー寒天 + SS寒天 − セトリミド寒天 − 色素 黄色 酸発生(OF試験) グルコース好気的 − グルコース嫌気的 − グルコースからのガス発生 − 酸発生 グルコース − フラクトース − キシロース − ONPG − ODC − ADH − VP − インドール − NO3からNO2 − 脱窒 − フェニルアラニンデスアミナーゼ − サッカロースからのレバン − レシチナーゼ − ウレアーゼ − 加水分解: デンプン − ゼラチン − カゼイン − DNA − ツイーン80 − エスクリン − チロシン分解 − 成長ホルモン需要 − 基質利用 酢酸塩 + カプリン酸塩 + クエン酸塩 + グリコール酸塩 + 乳酸塩 + レブリン酸塩 + リンゴ酸塩 + マロン酸塩 + フェニル酢酸塩 + スベリン酸塩 + L−アラビノース − フラクトース + グルコース − マンノース − マルトース − キシロース − マンニトール − グルコン酸塩 + 2−ケトグルコン酸塩 + N−アセチルグルコサミン − L−セリン − L−ヒスチジン + オキシ酪酸 + N供給源 NH4 ++ R,S−(±)−2,2−ジメチル− シクロプロパンカルボキサミド +バクテリウム・sp VIII:II(DSM−No.6
316)の科学的データ グラム着色 + グラム−反応(KOH試験) − オキシダーゼ − カタラーゼ − 硝酸塩還元 − トリプトファン→インドール − グルコース(けん気性) − アルギニン − ウレアーゼ − エスクリン − ゼラチン − β−ガラクトシダーゼ + グルコース + アラビノース − マンノース (+) マンニトール + N−アセチルグルコースアミン − マルトース + グルコン酸塩 − カプリン酸塩 − アジピン酸塩 − リンゴ酸塩 − クエン酸塩 − フェニル酢酸塩 −予備培養 通常どおり、選択法によりこの微生物の予備培養を行な
い、その予備培養菌でさらに別の培養基に接種できる。
この予備培養は、同じ培養基中で、同じC/N比率
で、C供給源として同じ化合物により、選択法と同様に
培養することができる。
は、表2または表3に記載の組成であって、ユニバーサ
ルペプトンを含み、または含まない組成を有する。 予
備培養のためのN供給源としては、この専門分野で一般
的な供給源を使用できるが、好ましくはN供給源として
アンモニウム塩、たとえば硫酸アンモニウムを使用す
る。
は20〜40℃が有利である。
後、微生物を誘発させ、生物変換の準備をすることがで
きる。
導培養基は、N供給源を除いて、予備培養基と同じ組成
を有する。 この培養基は、その微生物の有効酵素を誘
発するために、N供給源として、ならびに酵素誘発剤と
して作用し得る2,2−DMCPCAをラセミ体または
その光学的異性体の形で含むのが有利である。 しか
し、誘発剤として、たとえばシクロプロパンカルボキサ
ミド、カプロラクタム、ベンズアミド、シクロヘキサン
カルボキサミド、ニコチン酸アミドまたはクロトンアミ
ドのような他の化合物も考えられる。 誘発は、0.0
5〜0.15重量%、好ましくは0.1〜0.15重量
%の、ラセミ化合物またはその光学異性体の形の2,2
−DMCPCAで行なうのが有利である。 通常の15
〜80時間の誘発期間の後、微生物を遠心分離または限
外濾過により採取し、次いで本方法のための培養基中に
再分散させる。
方法では、ラセミ性R,S−(±)−2,2−DMCP
CA中でR−(−)−2,2−DMCPCAをR−
(−)−2,2−DMCPCSに生物変換させ、その際
に光学活性のS−(+)−2,2−DMCPCAが沈殿
するので、これを分離する。 ラセミ性R,S−(±)
−2,2−DMCPCAは、たとえばR,S−(±)−
2,2−ジメチルシクロプロパンカルボン酸ニトリルを
原料として、化学的または酵素的に製造することができ
る。
うか、あるいは酵素により細胞を含まない系で行なう。
細胞を含まない系に使用する酵素は、当業者には一般
的な微生物細胞の溶解により得ることができる。 これ
には、たとえば超音波法、フレンチプレス法またはリゾ
チーム法を使用することができる。 次いで、本方法を
実行するために、この細胞を含まない酵素を好適な担体
材料上に固定することができる。
A:18(DSM−No.6315)、コマモナス・ア
シドボランスTG308(DSM−No.6552)、
シュードモナス・spNSAK:42(DSM−No.
6433)およびバクテリウム・spVIII:II
(DSM−No.6316)ならびにそれらの子孫およ
び突然変異体、ならびにここに記載する方法により選択
される他の微生物が、とくに好適である。 また、これ
らの微生物から得られる、細胞を含まない酵素も同様に
好適である。
源をもはや必要としない、休止している微生物細胞(成
長していない細胞)を使用して行なうか、あるいは先に
述べたように、たとえば誘発した微生物の溶解により得
られる酵素を使用し、細胞を含まない系で行なう。
0.2〜5重量%、好ましくは0.2〜2重量%の量で
含む。
門分野で一般的な培養基、たとえば低分子量のリン酸塩
緩衝剤、上記の鉱物塩培養基またはHEPES緩衝剤
(N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−2’−エタン
スルホン酸)を使用できる。
衝剤中で行なう。
は6.5〜10の間である。
〜40℃の温度で行なうのが有利である。
時間の変換期間の後、R−(−)−2,2−DMCPC
Aは完全に相当する酸に変換され、その際光学的に純粋
なS−(+)−2,2−DMCPCAが沈殿する。 そ
のようにして得られるS−(+)−2,2−DMCPC
Aは、たとえば抽出、電気透析または乾燥により得られ
る。
を有する微生物の分離および選択 土壌から得た、細かく砕いた試料(1g)に等張食塩溶
液(9ml)を加え、全体を約5分間放置した。 その
後、上澄み液(0.5ml)を、グリセリンおよびR,
S−(±)−2,2−DMCPCAをC/N比5:1で
含む鉱物塩培養基(25ml)(クラら、Arch.
Microbiol. 135、1〜7頁,1983)
に接種した。 続いてこの培養基を、R,S−(±)−
2,2−DMCPCAをN供給源として利用できる混合
培養菌が生じるまで培養した。これらの微生物の純粋培
養物は、従来の微生物学的手法により得た。 次いで、
このようにして得た微生物種を、寒天皿上でそれらの
R,S−(±)−2,2−DMCPCA、S−(+)−
2,2−DMCPCAおよびR−(−)−2,2−DM
CPCAによる成長を試験し、両異性体(R−(−)−
2,2−DMCPCAおよびS−(+)−2,2−DM
CPCA)により同様に急速に成長する好ましくない菌
種を探し出した。 残りの菌種をさらに試験した。この
菌種で予備培養基に接種した。 この予備培養基中で得
られた微生物を鉱物塩培養基上に移し、そのR−(−)
−2,2−DMCPCAを唯一のN供給源として選択的
に利用できる能力を検査した。 その際、上澄み液を、
GCによりR−(−)−2,2−DMCPCSの形成お
よびS−(+)−2,2−DMCPCAの蓄積に関して
検査した。
の活性の測定 加水分解酵素の活性を測定するために、微生物分散液を
650nmにおける光学密度が0.5になるように調整
した。 培養基として0.2重量%のR,S−2,2−
DMCPCAを含むリン酸塩緩衝液(10ミリモル)、
pH7.0を使用した。 この分散液を30℃で3時間
振とうしながら培養した。加水分解により放出されたN
H4+またはR−(−)−2,2−DMCPCSを測定
し、1ミリモルの形成されたNH4+が1ミリモルの変換
されたR−(−)−2,2−DMCPCAに相当すると
仮定して、活性を、変換されたR−(−)−2,2−D
MCPCAのg/l/650nmにおける光学密度とし
て表わした。
てグリセリン、N供給源として硫酸アンモニウムを含む
鉱物塩培養基−寒天皿上で、30℃で2日間培養した。
この鉱物塩培養基の組成を表2に示す。 この表面を
覆った微生物で同じ組成を有する予備培養基に接種し、
30℃で2日間培養した。 誘発させるために0.2重
量%のグリセリンおよび0.15重量%のR,S−
(±)−2,2−DMCPCAを含み、(NH4)2SO
4の代りにNa2SO4を含む同じ鉱物塩培養基にこの予
備培養基5mlを接種し、30℃で45時間培養した。
続いて、細胞を遠心分離により採取し、0.9%Na
Cl溶液中に入れた。 細胞を10ミリモルのリン酸塩
緩衝液(800ml)、pH7.0中に再分散させた
後、650nmにおける光学密度を1.3に調整し、2
重量%のR,S−(±)−2,2−DMCPCAを加え
た。 37℃で約25時間培養した後、R−(−)−
2,2−DMCPCAは完全にR−(−)−2,2−D
MCPCSに変換されたが、これは100%の光学純度
(ee)および分析により測定したS−(+)−2,2
−DMCPCAの収量46.7%に相当した。 反応の
推移は、NH4+放出および上澄み液のGC分析により追
跡した。 細胞を遠心分離により除去した後、上澄み液
をpH値9.5に調節し、生成物を酢酸エチルで抽出す
ることにより分離した。
ム・spVIII:IIを分離した。この微生物では予
備培養期間が3日間、誘発期間が3日間で、その他の条
件は実施例3と同じであった。 実施例3と異なり、こ
の微生物では生物変換を0.2重量%のR,S−(±)
−2,2−DMCPCAで行ない、その際、加水分解酵
素の活性は0.13g/l/h/OD650と測定され
た。
ナス・spNSAK:42(DSM−No.6433)
を分離した。予備培養期間が2日間、誘発期間が18時
間で、その他の条件は実施例3と同じであったが、誘発
培養基は1重量%のグリセリン(0.2重量%の代り
に)および0.3重量%のユニバーサルペプトン(メル
ク)を含むものであった。 生物変換は、0.2重量%
のR,S−(±)−2,2−DMCPCAで行ない、そ
の際、加水分解酵素の活性は0.34g/l/h/OD
650と測定された。
(DSM−No.6552)を複合培養基(4ml)
「ニュートリエント・ブロス」(オキソイド社、GB)
中で30℃で2日間培養した。 この微生物で鉱物塩培
養基(表3)に接種し、30℃で2日間培養した。 続
いて細胞を実施例3に応じて採取した。 実施例3と異
なり、生物変換を0.5重量%のR,S−(±)−2,
2−DMCPCAを含む10ミリモルのHEPES緩衝
液(pH7.0)中で、その他は実施例3と同じ条件下
で行なった。 37℃で4.5時間の培養後、R−
(−)−2,2−DMCPCAが完全にR−(−)−
2,2−DMCPCSに変換されたが、これは分析によ
り測定したS−(+)−DMCPCAの収量45.5%
および光学純度(ee)99.0%に相当した。
−(+)−DMCPCAの製造 コマモナス・アシドボランス A:18の細胞を、誘発
後、HEPES緩衝液(10mM、pH7.0)中で9
5ml、650nmにおける光学密度210に濃縮し
た。 続いて、細胞を2回フレンチプレス中で1200
バールの圧力で溶解させた。 細胞を含まない酵素の抽
出物を得るために、全体を20000rpmで遠心分離
した。 この細胞を含まない酵素抽出物中のタンパク質
量は(ブラッドフォード法で測定して)39.3mgタ
ンパク質/mlであることが確認された。 この細胞を
含まない酵素の活性を測定するために、この細胞を含ま
ない酵素抽出物20μl(約0.8mgタンパク質)
を、0.2重量%のR,S−(±)−2,2−DMCP
CAを含む4mlのリン酸塩緩衝液中に入れ、30℃で
培養した。 その際、細胞を含まない酵素中で、2.5
gのR−(−)−2,2−DMCPCA/h/gタンパ
ク質(3.64μモル/m/gタンパク質)が相当する
酸に変換された。
の製造 誘発後(実施例3により)、コマモナス・アシドボラン
スA:18の細胞を採取した。 これらの細胞をポリエ
チレンイミン/グルタルアルデヒド処理(CS−PS2
51111に準じて)により固定した。 この固定した
生物触媒は1.6μモル/min・g乾燥重量の活性を
有していた。 この生物触媒の乾燥重量は湿重量の32
%に相当していた。 次いで、この生物触媒(湿重量5
5g)を、16gのR,S−(±)−2,2−DMCP
CAを含む800mlのホウ酸(10mM、pH9.
0)に分散させた。 撹拌速度200rpm、37℃で
68.8hの培養期間の後、R−(−)−2,2−DM
CPCAは完全にR−(−)−2,2−DMCPCSに
変換されたが、これは光学純度(ee)98.2%、分
析により測定したS−(+)−2,2−DMCPCA収
量40%に相当していた。
Claims (15)
- 【請求項1】 ラセミ性R,S−(±)−2,2−ジメ
チルシクロプロパンカルボキサミド中のR−(−)−
2,2−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドをR−
(−)−2,2−ジメチルシクロプロパンカルボン酸に
生物変換することができ、その際に光学活性の(S)−
(+)−2,2−ジメチルシクロプロパンカルボキサミ
ドが得られることを特徴とする、コマモナス・アシドボ
ランス種の微生物、シュードモナス・sp.NSAK:
42(DSM−No.6433)に該当する種の微生
物、およびバクテリウム・sp.VIII:II(DS
M−No.6316)に該当する種の微生物、並びに前記微生物と同じ上述の生物変換活性を有する、
前記微生物の突然変異体。 - 【請求項2】 請求項1の微生物であって、 a)N供給源としてのラセミ体またはその光学異性体の
形である2,2−ジメチルシクロプロパンカルボキサミ
ド、およびC供給源により成長する微生物を培養し、 b)この培養菌から、安定しており、ラセミ化合物また
はその光学異性体の形の2,2−ジメチルシクロプロパ
ンカルボキサミドを唯一のN供給源として利用する菌を
選択する選択方法により得られることを特徴とする微生
物。 - 【請求項3】 C供給源としての糖、糖アルコール、カ
ルボン酸、アルコールまたは他のC供給源を成長基質と
して利用することを特徴とする請求項1または2の微生
物。 - 【請求項4】 N供給源としてR−(−)−2,2−ジ
メチルシクロプロパンカルボキサミドを受け入れること
を特徴とする請求項1〜3のいずれかの微生物。 - 【請求項5】 微生物コマモナス・アシドボランスA:
18(DSM−No.6315)。 - 【請求項6】 微生物コマモナス・アシドボランスTG
308(DSM−No.6552)。 - 【請求項7】 微生物シュードモナス・sp.NSA
K:42(DSM−No.6433)。 - 【請求項8】 微生物バクテリウム・sp.VIII:
II(DSM−No.6316)。 - 【請求項9】 S−(+)−2,2−ジメチルシクロプ
ロパンカルボキサミドの製造方法において、 コマモナス属、シュードモナス属、およびバクテリウム
属の少なくとも一の微生物により、またはこれらの微生
物から得た無細胞系酵素により、ラセミ性R,S−
(±)−2,2ジメチルシクロプロパンカルボキサミド
中のR−(−)−2,2−ジメチルシクロプロパンカル
ボキサミドをR−(−)−2,2−ジメチルシクロプロ
パンカルボン酸に生物変換し、その際に沈殿する光学活
性のS−(+)−2,2−ジメチルシクロプロパンカル
ボキサミドを分離することを特徴とする方法。 - 【請求項10】 生物変換を、ラセミ性2,2−ジメチ
ルシクロプロパンカルボキサミドを0.2〜5重量%の
量で含む培地中で行なうことを特徴とする請求項9に記
載の方法。 - 【請求項11】 生物変換を、6〜11のpH値および
15〜55℃の温度で行なうことを特徴とする請求項9
または10のいずれかの方法。 - 【請求項12】 生物変換を、コマモナス・アシドボラ
ンスA:18(DSM−No.6315)種により、ま
たは該微生物から得た無細胞系酵素により行なうことを
特徴とする請求項9〜11のいずれかの方法。 - 【請求項13】 生物変換を、コマモナス・アシドボラ
ンスTG308(DSM−No.6552)種により、
または該微生物から得た無細胞系酵素により行なうこと
を特徴とする請求項9〜11のいずれかの方法。 - 【請求項14】 生物変換を、シュードモナス・sp.
NSAK:42(DSM−No.6433)種により、
または該微生物から得た無細胞系酵素により行なうこと
を特徴とする請求項9〜11のいずれかの方法。 - 【請求項15】 生物変換を、バクテリウム・sp.V
III:II(DSM−No.6316)種により、ま
たは該微生物から得た無細胞系酵素により行なうことを
特徴とする請求項9〜11のいずれかの方法。
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