JPH0576391A - Ｓ−（＋）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドの生物工学的製造方法 - Google Patents
Ｓ−（＋）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドの生物工学的製造方法Info
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- JPH0576391A JPH0576391A JP4049997A JP4999792A JPH0576391A JP H0576391 A JPH0576391 A JP H0576391A JP 4049997 A JP4049997 A JP 4049997A JP 4999792 A JP4999792 A JP 4999792A JP H0576391 A JPH0576391 A JP H0576391A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ジメチルシクロプ
ロパンカルボキサミドからＳ−（＋）−２，２−ジメチ
ルシクロプロパンカルボキサミドを製造するための新規
な微生物学的方法を提供する。 【構成】 ラセミ性２，２−ジメチルシクロプロパンカ
ルボキサミド中のＲ−（−）−２，２−ジメチルシクロ
プロパンカルボキサミドをＲ−（−）−２，２−ジメチ
ルシクロプロパンカルボン酸に生物変換する能力を有す
る新規な微生物を利用する。 この方法は、この微生物
によっても、この微生物から得た、細胞を含まない酵素
によっても実施できる。
ロパンカルボキサミドからＳ−（＋）−２，２−ジメチ
ルシクロプロパンカルボキサミドを製造するための新規
な微生物学的方法を提供する。 【構成】 ラセミ性２，２−ジメチルシクロプロパンカ
ルボキサミド中のＲ−（−）−２，２−ジメチルシクロ
プロパンカルボキサミドをＲ−（−）−２，２−ジメチ
ルシクロプロパンカルボン酸に生物変換する能力を有す
る新規な微生物を利用する。 この方法は、この微生物
によっても、この微生物から得た、細胞を含まない酵素
によっても実施できる。
Description
【０００１】本発明は、ラセミ性Ｒ，Ｓ−（±）−２，
２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド中のＲ−
（−）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミ
ドをＲ−（−）−２，２−ジメチルシクロプロパンカル
ボン酸に生物変換し、その際二所望するＳ−（＋）−
２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドが沈殿
することを利用した、光学的に活性なＳ−（＋）−２，
２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドの新規な製
造方法に関する。
２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド中のＲ−
（−）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミ
ドをＲ−（−）−２，２−ジメチルシクロプロパンカル
ボン酸に生物変換し、その際二所望するＳ−（＋）−
２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドが沈殿
することを利用した、光学的に活性なＳ−（＋）−２，
２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドの新規な製
造方法に関する。
【０００２】以下、２，２−ジメチルシクロプロパンカ
ルボキサミドを略号「２，２−ＤＭＣＰＣＡ」で、２，
２−ジメチルシクロプロパンカルボン酸を「２，２−Ｄ
ＭＣＰＣＳ」であらわす。
ルボキサミドを略号「２，２−ＤＭＣＰＣＡ」で、２，
２−ジメチルシクロプロパンカルボン酸を「２，２−Ｄ
ＭＣＰＣＳ」であらわす。
【０００３】光学的に純粋なＳ−（＋）−２，２−ＤＭ
ＣＰＣＡは、腎臓における腎臓デヒドロペプチダーゼに
よる抗生物質の活性低下を防止するためにペネム−ない
しカルバペネム抗生物質とともに投与される、デヒドロ
ペプチダーゼ抑制剤のシラスタチンを製造する原料とし
て使用される（文献ＥＰ０４８３０１）。これまでは、
Ｓ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡの化学的製造方法だ
けが知られている。これらの方法には、経費がかかり、
多くの工程を要するという欠点がある（ＥＰ１５５７７
９）。
ＣＰＣＡは、腎臓における腎臓デヒドロペプチダーゼに
よる抗生物質の活性低下を防止するためにペネム−ない
しカルバペネム抗生物質とともに投与される、デヒドロ
ペプチダーゼ抑制剤のシラスタチンを製造する原料とし
て使用される（文献ＥＰ０４８３０１）。これまでは、
Ｓ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡの化学的製造方法だ
けが知られている。これらの方法には、経費がかかり、
多くの工程を要するという欠点がある（ＥＰ１５５７７
９）。
【０００４】本発明の目的は、容易に入手できるラセミ
性Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡから出発し、
一工程で、必要とする異性体を高純度で得ることができ
る生物工学的方法を提供することである。
性Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡから出発し、
一工程で、必要とする異性体を高純度で得ることができ
る生物工学的方法を提供することである。
【０００５】この目的は、本発明により、請求項１の新
規な方法および請求項１０の新規な微生物により達成さ
れる。
規な方法および請求項１０の新規な微生物により達成さ
れる。
【０００６】本発明の微生物は、ラセミ性Ｒ，Ｓ−
（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ中のＲ−（−）−２，２
−ＤＭＣＰＣＡをＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＳに
生物変換する能力を有し、その際所望のＳ−（＋）−
２，２−ＤＭＣＰＣＡが沈殿する。これらの微生物は、
たとえば土壌、スラッジまたは排水から、従来の微生物
学的手法により分離することができる。
（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ中のＲ−（−）−２，２
−ＤＭＣＰＣＡをＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＳに
生物変換する能力を有し、その際所望のＳ−（＋）−
２，２−ＤＭＣＰＣＡが沈殿する。これらの微生物は、
たとえば土壌、スラッジまたは排水から、従来の微生物
学的手法により分離することができる。
【０００７】本発明のＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣ
Ａの製造には、Ｒ−（−）−ＤＭＣＰＣＡを基質として
利用するすべての微生物が含まれる。
Ａの製造には、Ｒ−（−）−ＤＭＣＰＣＡを基質として
利用するすべての微生物が含まれる。
【０００８】これらの微生物は、下記の選択方法により
得ることができる。
得ることができる。
【０００９】ａ）Ｎ供給源としてラセミ化合物またはそ
の光学異性体の形の２，２−ＤＭＣＰＣＡ、およびＣ供
給源により成長する微生物を通常の方法で培養し、 ｂ）この培養菌から、安定しており、ラセミ化合物また
はその光学異性体の形の２，２−ＤＭＣＰＣＡを唯一の
Ｎ供給源として利用する菌を選択する。
の光学異性体の形の２，２−ＤＭＣＰＣＡ、およびＣ供
給源により成長する微生物を通常の方法で培養し、 ｂ）この培養菌から、安定しており、ラセミ化合物また
はその光学異性体の形の２，２−ＤＭＣＰＣＡを唯一の
Ｎ供給源として利用する菌を選択する。
【００１０】Ｒ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡをＮ供
給源として受け入れる微生物を選択するのが有利であ
る。
給源として受け入れる微生物を選択するのが有利であ
る。
【００１１】Ｃ供給源としては、これらの微生物は、た
とえば糖、糖アルコール、カルボン酸またはアルコール
を成長基質として利用することができる。 糖として
は、たとえばフラクトースまたはグルコースを使用でき
る。 糖アルコールとしては、エリスリトール、マンニ
トールまたはソルビトールを使用できる。 カルボン酸
としては、モノ−、ジ−またはトリカルボン酸、たとえ
ば酢酸、マロン酸またはクエン酸を使用できる。 アル
コールとしては１，２または３価のアルコール、たとえ
ばエタノール、グリコールまたはグリセリンを使用でき
る。 好ましくは、Ｃ供給源として、３価のアルコー
ル、たとえばグリセリンを使用する。
とえば糖、糖アルコール、カルボン酸またはアルコール
を成長基質として利用することができる。 糖として
は、たとえばフラクトースまたはグルコースを使用でき
る。 糖アルコールとしては、エリスリトール、マンニ
トールまたはソルビトールを使用できる。 カルボン酸
としては、モノ−、ジ−またはトリカルボン酸、たとえ
ば酢酸、マロン酸またはクエン酸を使用できる。 アル
コールとしては１，２または３価のアルコール、たとえ
ばエタノール、グリコールまたはグリセリンを使用でき
る。 好ましくは、Ｃ供給源として、３価のアルコー
ル、たとえばグリセリンを使用する。
【００１２】選択培養基中のＣ／Ｎ比率は５：１〜１
０：１の範囲内が有利である。
０：１の範囲内が有利である。
【００１３】選択培養基としては、たとえばクラら、Ａ
ｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５，１〜７頁，１
９８３に記載されている鉱物塩培養基のような、この専
門分野で一般的な培養基を使用できる。
ｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５，１〜７頁，１
９８３に記載されている鉱物塩培養基のような、この専
門分野で一般的な培養基を使用できる。
【００１４】Ｎ供給源としてのラセミ体またはその光学
異性体の形の２，２−ＤＭＣＰＣＡ、およびＣ供給源に
より成長する好ましい微生物は、コマモナス・アシドボ
ランス Ａ：１８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６３１５）、コマモ
ナス・アシドボランスＴＧ３０８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５
５２）、シュードモナス・ｓｐＮＳＡＫ：４２（ＤＳＭ
−Ｎｏ．６４３３）および微生物バクテリウム・ｓｐＶ
ＩＩＩ：ＩＩ（ＤＳＭ−Ｎｏ．６３１６）ならびにそれ
らの子孫および突然変異体である。 菌種ＤＳＭ−Ｎ
ｏ．６３１５および６３１６は１９９１年１月２９日
に、ＤＳＭ−Ｎｏ．６４３３は１９９１年３月２５日
に、ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５２は１９９１年４月６日に、
ドイチェン・ザムルング・フォン・ミクロオルガニズメ
ン・ウント・ツェルクルトゥーレン・ＧｍｂＨ，マシェ
ローデヴェーク１Ｂ，Ｄ−３３００，ブラウンシュバイ
クに寄託してある。
異性体の形の２，２−ＤＭＣＰＣＡ、およびＣ供給源に
より成長する好ましい微生物は、コマモナス・アシドボ
ランス Ａ：１８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６３１５）、コマモ
ナス・アシドボランスＴＧ３０８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５
５２）、シュードモナス・ｓｐＮＳＡＫ：４２（ＤＳＭ
−Ｎｏ．６４３３）および微生物バクテリウム・ｓｐＶ
ＩＩＩ：ＩＩ（ＤＳＭ−Ｎｏ．６３１６）ならびにそれ
らの子孫および突然変異体である。 菌種ＤＳＭ−Ｎ
ｏ．６３１５および６３１６は１９９１年１月２９日
に、ＤＳＭ−Ｎｏ．６４３３は１９９１年３月２５日
に、ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５２は１９９１年４月６日に、
ドイチェン・ザムルング・フォン・ミクロオルガニズメ
ン・ウント・ツェルクルトゥーレン・ＧｍｂＨ，マシェ
ローデヴェーク１Ｂ，Ｄ−３３００，ブラウンシュバイ
クに寄託してある。
【００１５】コマモナス・アシドボランスＡ：１８（Ｄ
ＳＭ−Ｎｏ．６３１５）の科学的データ： 細胞形状 棒状 幅 μｍ ０．５〜０．７ 長さ μｍ １．５〜３．０ 移動性 ＋ 鞭毛 極性＞１ グラム反応 − ３％ＫＯＨによる分解 ＋ アミノペプチダーゼ（Ｃｅｒｎｙ） ＋ 胞子 − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ 成長 嫌気的 − ３７／４１℃ ＋／− ｐＨ５．６ ＋ マック−コンキー寒天 ＋ ＳＳ寒天 ＋ セトリミド寒天 ＋ 色素 非散乱 − 散乱 − 蛍光発生 − ピオシアニン − 酸発生（ＯＦ試験） グルコース好気的 − グルコース嫌気的 − グルコースからのガス発生 − 酸発生 グルコース − フラクトース ＋ キシロース − マンニトール ＋ グリセリン ＋ ＯＮＰＧ − ＡＤＨ − ＶＰ − インドール − ＮＯ3からＮＯ2 − 脱窒 − フェニルアラニンデスアミナーゼ − サッカロースからのレバン − レシチナーゼ − ウレアーゼ − 加水分解： デンプン − ゼラチン − カゼイン − ＤＮＡ − ツイーン８０ − エスクリン − チロシン分解 − 基質利用 酢酸塩 ＋ アジピン酸塩 ＋ カプリン酸塩 ＋ クエン酸塩 ＋ グリコール酸塩 ＋ レブリン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ マロン酸塩 − フェニル酢酸塩 ＋ Ｌ−アラビノース − フラクトース ＋ グルコース − マンノース − マルトース − キシロース − イノシトール − マンニトール ＋ グルコン酸塩 ＋ Ｎ−アセチルグルコサミン − Ｌ−セリン − Ｌ−トリプトファン ＋ アセトアミド ＋ メサコン酸塩 ＋ シトラコン酸 ＋ Ｌ−酒石酸 ＋ Ｎ供給源 ＮＨ4+ ＋＋ Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ジメチル− シクロプロパンカルボキサミド ＋ ブチルアミド ＋＋ アセトアミド ＋ プロピオンアミド ＋ ホルムアミド ± ベンズアミド ＋ ニコチンアミド ＋ ＡＰＩ２０ＮＥ→Ｃｓ．アシドボランス ９９．０％コマモナス・アシドボランス ＴＧ３０８（ＤＳＭ−Ｎ
ｏ．６５５２）の科学的データ： 細胞形状 棒状 グラム−反応（ＫＯＨ試験） − グラム着色 − 胞子 − 移動性 ＋ ℃成長 ３７℃ ＋ ４１℃ − ４５℃ − カタラーゼ ＋ オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ グルコース中の発酵（ＯＦ試験） − 硝酸塩還元 ＋ インドール生産 − グルコースの酸 − アルギニンデヒドロラーゼ − ウレアーゼ − エスクリン加水分解 − ゼラチン加水分解 − β−ガラクトシダーゼ − グルコース同化 − アラビノース同化 − マンノース同化 − マンニトール同化 ＋ Ｎ−アセチルグルコースアミン同化 − マルトース同化 − グルコン酸塩同化 ＋ カプリン酸塩同化 ＋ アジピン酸塩同化 ＋ リンゴ酸塩同化 ＋ クエン酸塩同化 − フェニル酢酸塩同化 ＋ シトクロムオキシダーゼ ＋ ＮＯ3からのＮＯ2 ＋ 尿素の加水分解 − フラクトースの利用 ＋ アセトアミドのアルカリ性化 ＋ 酒石酸塩のアルカリ性化 ＋ シモンのクエン酸塩のアルカリ性化 ＋ マロン酸のアルカリ性化 （＋） （＋）やや陽性シュードモナス・ｓｐ ＮＳＡＫ：４２（ＤＳＭ−Ｎｏ．
６４３３）の科学的データ： 細胞形状 棒状 幅 μｍ ０．６〜０．８ 長さ μｍ １．５〜３．０ 移動性 ＋ グラム−反応 − ３％ＫＯＨによる分解 ＋ アミノペプチダーゼ（Ｃｅｒｎｙ） ＋ 胞子 − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ 成長 嫌気的 − ３７／４１℃ ＋／− ｐＨ５．６ ＋ マック−コンキー寒天 ＋ ＳＳ寒天 − セトリミド寒天 − 色素 黄色 酸発生（ＯＦ試験） グルコース好気的 − グルコース嫌気的 − グルコースからのガス発生 − 酸発生 グルコース − フラクトース − キシロース − ＯＮＰＧ − ＯＤＣ − ＡＤＨ − ＶＰ − インドール − ＮＯ3からＮＯ2 − 脱窒 − フェニルアラニンデスアミナーゼ − サッカロースからのレバン − レシチナーゼ − ウレアーゼ − 加水分解： デンプン − ゼラチン − カゼイン − ＤＮＡ − ツイーン８０ − エスクリン − チロシン分解 − 成長ホルモン需要 − 基質利用 酢酸塩 ＋ カプリン酸塩 ＋ クエン酸塩 ＋ グリコール酸塩 ＋ 乳酸塩 ＋ レブリン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ マロン酸塩 ＋ フェニル酢酸塩 ＋ スベリン酸塩 ＋ Ｌ−アラビノース − フラクトース ＋ グルコース − マンノース − マルトース − キシロース − マンニトール − グルコン酸塩 ＋ ２−ケトグルコン酸塩 ＋ Ｎ−アセチルグルコサミン − Ｌ−セリン − Ｌ−ヒスチジン ＋ オキシ酪酸 ＋ Ｎ供給源 ＮＨ4 ＋＋ Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ジメチル− シクロプロパンカルボキサミド ＋バクテリウム・ｓｐ ＶＩＩＩ：ＩＩ（ＤＳＭ−Ｎｏ．６
３１６）の科学的データ グラム着色 ＋ グラム−反応（ＫＯＨ試験） − オキシダーゼ − カタラーゼ − 硝酸塩還元 − トリプトファン→インドール − グルコース（けん気性） − アルギニン − ウレアーゼ − エスクリン − ゼラチン − β−ガラクトシダーゼ ＋ グルコース ＋ アラビノース − マンノース （＋） マンニトール ＋ Ｎ−アセチルグルコースアミン − マルトース ＋ グルコン酸塩 − カプリン酸塩 − アジピン酸塩 − リンゴ酸塩 − クエン酸塩 − フェニル酢酸塩 −予備培養 通常どおり、選択法によりこの微生物の予備培養を行な
い、その予備培養菌でさらに別の培養基に接種できる。
この予備培養は、同じ培養基中で、同じＣ／Ｎ比率
で、Ｃ供給源として同じ化合物により、選択法と同様に
培養することができる。
ＳＭ−Ｎｏ．６３１５）の科学的データ： 細胞形状 棒状 幅 μｍ ０．５〜０．７ 長さ μｍ １．５〜３．０ 移動性 ＋ 鞭毛 極性＞１ グラム反応 − ３％ＫＯＨによる分解 ＋ アミノペプチダーゼ（Ｃｅｒｎｙ） ＋ 胞子 − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ 成長 嫌気的 − ３７／４１℃ ＋／− ｐＨ５．６ ＋ マック−コンキー寒天 ＋ ＳＳ寒天 ＋ セトリミド寒天 ＋ 色素 非散乱 − 散乱 − 蛍光発生 − ピオシアニン − 酸発生（ＯＦ試験） グルコース好気的 − グルコース嫌気的 − グルコースからのガス発生 − 酸発生 グルコース − フラクトース ＋ キシロース − マンニトール ＋ グリセリン ＋ ＯＮＰＧ − ＡＤＨ − ＶＰ − インドール − ＮＯ3からＮＯ2 − 脱窒 − フェニルアラニンデスアミナーゼ − サッカロースからのレバン − レシチナーゼ − ウレアーゼ − 加水分解： デンプン − ゼラチン − カゼイン − ＤＮＡ − ツイーン８０ − エスクリン − チロシン分解 − 基質利用 酢酸塩 ＋ アジピン酸塩 ＋ カプリン酸塩 ＋ クエン酸塩 ＋ グリコール酸塩 ＋ レブリン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ マロン酸塩 − フェニル酢酸塩 ＋ Ｌ−アラビノース − フラクトース ＋ グルコース − マンノース − マルトース − キシロース − イノシトール − マンニトール ＋ グルコン酸塩 ＋ Ｎ−アセチルグルコサミン − Ｌ−セリン − Ｌ−トリプトファン ＋ アセトアミド ＋ メサコン酸塩 ＋ シトラコン酸 ＋ Ｌ−酒石酸 ＋ Ｎ供給源 ＮＨ4+ ＋＋ Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ジメチル− シクロプロパンカルボキサミド ＋ ブチルアミド ＋＋ アセトアミド ＋ プロピオンアミド ＋ ホルムアミド ± ベンズアミド ＋ ニコチンアミド ＋ ＡＰＩ２０ＮＥ→Ｃｓ．アシドボランス ９９．０％コマモナス・アシドボランス ＴＧ３０８（ＤＳＭ−Ｎ
ｏ．６５５２）の科学的データ： 細胞形状 棒状 グラム−反応（ＫＯＨ試験） − グラム着色 − 胞子 − 移動性 ＋ ℃成長 ３７℃ ＋ ４１℃ − ４５℃ − カタラーゼ ＋ オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ グルコース中の発酵（ＯＦ試験） − 硝酸塩還元 ＋ インドール生産 − グルコースの酸 − アルギニンデヒドロラーゼ − ウレアーゼ − エスクリン加水分解 − ゼラチン加水分解 − β−ガラクトシダーゼ − グルコース同化 − アラビノース同化 − マンノース同化 − マンニトール同化 ＋ Ｎ−アセチルグルコースアミン同化 − マルトース同化 − グルコン酸塩同化 ＋ カプリン酸塩同化 ＋ アジピン酸塩同化 ＋ リンゴ酸塩同化 ＋ クエン酸塩同化 − フェニル酢酸塩同化 ＋ シトクロムオキシダーゼ ＋ ＮＯ3からのＮＯ2 ＋ 尿素の加水分解 − フラクトースの利用 ＋ アセトアミドのアルカリ性化 ＋ 酒石酸塩のアルカリ性化 ＋ シモンのクエン酸塩のアルカリ性化 ＋ マロン酸のアルカリ性化 （＋） （＋）やや陽性シュードモナス・ｓｐ ＮＳＡＫ：４２（ＤＳＭ−Ｎｏ．
６４３３）の科学的データ： 細胞形状 棒状 幅 μｍ ０．６〜０．８ 長さ μｍ １．５〜３．０ 移動性 ＋ グラム−反応 − ３％ＫＯＨによる分解 ＋ アミノペプチダーゼ（Ｃｅｒｎｙ） ＋ 胞子 − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ 成長 嫌気的 − ３７／４１℃ ＋／− ｐＨ５．６ ＋ マック−コンキー寒天 ＋ ＳＳ寒天 − セトリミド寒天 − 色素 黄色 酸発生（ＯＦ試験） グルコース好気的 − グルコース嫌気的 − グルコースからのガス発生 − 酸発生 グルコース − フラクトース − キシロース − ＯＮＰＧ − ＯＤＣ − ＡＤＨ − ＶＰ − インドール − ＮＯ3からＮＯ2 − 脱窒 − フェニルアラニンデスアミナーゼ − サッカロースからのレバン − レシチナーゼ − ウレアーゼ − 加水分解： デンプン − ゼラチン − カゼイン − ＤＮＡ − ツイーン８０ − エスクリン − チロシン分解 − 成長ホルモン需要 − 基質利用 酢酸塩 ＋ カプリン酸塩 ＋ クエン酸塩 ＋ グリコール酸塩 ＋ 乳酸塩 ＋ レブリン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ マロン酸塩 ＋ フェニル酢酸塩 ＋ スベリン酸塩 ＋ Ｌ−アラビノース − フラクトース ＋ グルコース − マンノース − マルトース − キシロース − マンニトール − グルコン酸塩 ＋ ２−ケトグルコン酸塩 ＋ Ｎ−アセチルグルコサミン − Ｌ−セリン − Ｌ−ヒスチジン ＋ オキシ酪酸 ＋ Ｎ供給源 ＮＨ4 ＋＋ Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ジメチル− シクロプロパンカルボキサミド ＋バクテリウム・ｓｐ ＶＩＩＩ：ＩＩ（ＤＳＭ−Ｎｏ．６
３１６）の科学的データ グラム着色 ＋ グラム−反応（ＫＯＨ試験） − オキシダーゼ − カタラーゼ − 硝酸塩還元 − トリプトファン→インドール − グルコース（けん気性） − アルギニン − ウレアーゼ − エスクリン − ゼラチン − β−ガラクトシダーゼ ＋ グルコース ＋ アラビノース − マンノース （＋） マンニトール ＋ Ｎ−アセチルグルコースアミン − マルトース ＋ グルコン酸塩 − カプリン酸塩 − アジピン酸塩 − リンゴ酸塩 − クエン酸塩 − フェニル酢酸塩 −予備培養 通常どおり、選択法によりこの微生物の予備培養を行な
い、その予備培養菌でさらに別の培養基に接種できる。
この予備培養は、同じ培養基中で、同じＣ／Ｎ比率
で、Ｃ供給源として同じ化合物により、選択法と同様に
培養することができる。
【００１６】好ましくは、この予備培養のための培養基
は、表２または表３に記載の組成であって、ユニバーサ
ルペプトンを含み、または含まない組成を有する。 予
備培養のためのＮ供給源としては、この専門分野で一般
的な供給源を使用できるが、好ましくはＮ供給源として
アンモニウム塩、たとえば硫酸アンモニウムを使用す
る。
は、表２または表３に記載の組成であって、ユニバーサ
ルペプトンを含み、または含まない組成を有する。 予
備培養のためのＮ供給源としては、この専門分野で一般
的な供給源を使用できるが、好ましくはＮ供給源として
アンモニウム塩、たとえば硫酸アンモニウムを使用す
る。
【００１７】予備培養中のｐＨ値はｐＨ４〜１０、温度
は２０〜４０℃が有利である。
は２０〜４０℃が有利である。
【００１８】一般的に１０〜１００時間の培養期間の
後、微生物を誘発させ、生物変換の準備をすることがで
きる。
後、微生物を誘発させ、生物変換の準備をすることがで
きる。
【００１９】誘発 通常、この予備培養で誘導培養基に接種するが、この誘
導培養基は、Ｎ供給源を除いて、予備培養基と同じ組成
を有する。 この培養基は、その微生物の有効酵素を誘
発するために、Ｎ供給源として、ならびに酵素誘発剤と
して作用し得る２，２−ＤＭＣＰＣＡをラセミ体または
その光学的異性体の形で含むのが有利である。 しか
し、誘発剤として、たとえばシクロプロパンカルボキサ
ミド、カプロラクタム、ベンズアミド、シクロヘキサン
カルボキサミド、ニコチン酸アミドまたはクロトンアミ
ドのような他の化合物も考えられる。 誘発は、０．０
５〜０．１５重量％、好ましくは０．１〜０．１５重量
％の、ラセミ化合物またはその光学異性体の形の２，２
−ＤＭＣＰＣＡで行なうのが有利である。 通常の１５
〜８０時間の誘発期間の後、微生物を遠心分離または限
外濾過により採取し、次いで本方法のための培養基中に
再分散させる。
導培養基は、Ｎ供給源を除いて、予備培養基と同じ組成
を有する。 この培養基は、その微生物の有効酵素を誘
発するために、Ｎ供給源として、ならびに酵素誘発剤と
して作用し得る２，２−ＤＭＣＰＣＡをラセミ体または
その光学的異性体の形で含むのが有利である。 しか
し、誘発剤として、たとえばシクロプロパンカルボキサ
ミド、カプロラクタム、ベンズアミド、シクロヘキサン
カルボキサミド、ニコチン酸アミドまたはクロトンアミ
ドのような他の化合物も考えられる。 誘発は、０．０
５〜０．１５重量％、好ましくは０．１〜０．１５重量
％の、ラセミ化合物またはその光学異性体の形の２，２
−ＤＭＣＰＣＡで行なうのが有利である。 通常の１５
〜８０時間の誘発期間の後、微生物を遠心分離または限
外濾過により採取し、次いで本方法のための培養基中に
再分散させる。
【００２０】生物変換 本発明に従うＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡの製造
方法では、ラセミ性Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰ
ＣＡ中でＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡをＲ−
（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＳに生物変換させ、その際
に光学活性のＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡが沈殿
するので、これを分離する。 ラセミ性Ｒ，Ｓ−（±）
−２，２−ＤＭＣＰＣＡは、たとえばＲ，Ｓ−（±）−
２，２−ジメチルシクロプロパンカルボン酸ニトリルを
原料として、化学的または酵素的に製造することができ
る。
方法では、ラセミ性Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰ
ＣＡ中でＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡをＲ−
（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＳに生物変換させ、その際
に光学活性のＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡが沈殿
するので、これを分離する。 ラセミ性Ｒ，Ｓ−（±）
−２，２−ＤＭＣＰＣＡは、たとえばＲ，Ｓ−（±）−
２，２−ジメチルシクロプロパンカルボン酸ニトリルを
原料として、化学的または酵素的に製造することができ
る。
【００２１】好ましくは、この生物変換は微生物で行な
うか、あるいは酵素により細胞を含まない系で行なう。
細胞を含まない系に使用する酵素は、当業者には一般
的な微生物細胞の溶解により得ることができる。 これ
には、たとえば超音波法、フレンチプレス法またはリゾ
チーム法を使用することができる。 次いで、本方法を
実行するために、この細胞を含まない酵素を好適な担体
材料上に固定することができる。
うか、あるいは酵素により細胞を含まない系で行なう。
細胞を含まない系に使用する酵素は、当業者には一般
的な微生物細胞の溶解により得ることができる。 これ
には、たとえば超音波法、フレンチプレス法またはリゾ
チーム法を使用することができる。 次いで、本方法を
実行するために、この細胞を含まない酵素を好適な担体
材料上に固定することができる。
【００２２】本方法には、コマモナス・アシドボランス
Ａ：１８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６３１５）、コマモナス・ア
シドボランスＴＧ３０８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５２）、
シュードモナス・ｓｐＮＳＡＫ：４２（ＤＳＭ−Ｎｏ．
６４３３）およびバクテリウム・ｓｐＶＩＩＩ：ＩＩ
（ＤＳＭ−Ｎｏ．６３１６）ならびにそれらの子孫およ
び突然変異体、ならびにここに記載する方法により選択
される他の微生物が、とくに好適である。 また、これ
らの微生物から得られる、細胞を含まない酵素も同様に
好適である。
Ａ：１８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６３１５）、コマモナス・ア
シドボランスＴＧ３０８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５２）、
シュードモナス・ｓｐＮＳＡＫ：４２（ＤＳＭ−Ｎｏ．
６４３３）およびバクテリウム・ｓｐＶＩＩＩ：ＩＩ
（ＤＳＭ−Ｎｏ．６３１６）ならびにそれらの子孫およ
び突然変異体、ならびにここに記載する方法により選択
される他の微生物が、とくに好適である。 また、これ
らの微生物から得られる、細胞を含まない酵素も同様に
好適である。
【００２３】好ましくは、本方法は、ＣおよびＮの供給
源をもはや必要としない、休止している微生物細胞（成
長していない細胞）を使用して行なうか、あるいは先に
述べたように、たとえば誘発した微生物の溶解により得
られる酵素を使用し、細胞を含まない系で行なう。
源をもはや必要としない、休止している微生物細胞（成
長していない細胞）を使用して行なうか、あるいは先に
述べたように、たとえば誘発した微生物の溶解により得
られる酵素を使用し、細胞を含まない系で行なう。
【００２４】培養基はラセミ性２，２−ＤＭＣＰＣＡを
０．２〜５重量％、好ましくは０．２〜２重量％の量で
含む。
０．２〜５重量％、好ましくは０．２〜２重量％の量で
含む。
【００２５】本方法に使用する培養基としては、この専
門分野で一般的な培養基、たとえば低分子量のリン酸塩
緩衝剤、上記の鉱物塩培養基またはＨＥＰＥＳ緩衝剤
（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−２’−エタン
スルホン酸）を使用できる。
門分野で一般的な培養基、たとえば低分子量のリン酸塩
緩衝剤、上記の鉱物塩培養基またはＨＥＰＥＳ緩衝剤
（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−２’−エタン
スルホン酸）を使用できる。
【００２６】好ましくは、本方法は低分子量リン酸塩緩
衝剤中で行なう。
衝剤中で行なう。
【００２７】培養基のｐＨ値はｐＨ６〜１１、好ましく
は６．５〜１０の間である。
は６．５〜１０の間である。
【００２８】生物変換は１５〜５５℃、好ましくは２０
〜４０℃の温度で行なうのが有利である。
〜４０℃の温度で行なうのが有利である。
【００２９】通常、１〜３０時間、好ましくは５〜２５
時間の変換期間の後、Ｒ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣ
Ａは完全に相当する酸に変換され、その際光学的に純粋
なＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡが沈殿する。 そ
のようにして得られるＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣ
Ａは、たとえば抽出、電気透析または乾燥により得られ
る。
時間の変換期間の後、Ｒ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣ
Ａは完全に相当する酸に変換され、その際光学的に純粋
なＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡが沈殿する。 そ
のようにして得られるＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣ
Ａは、たとえば抽出、電気透析または乾燥により得られ
る。
【００３０】
【実施例１】Ｒ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを加水分解する酵素
を有する微生物の分離および選択 土壌から得た、細かく砕いた試料（１ｇ）に等張食塩溶
液（９ｍｌ）を加え、全体を約５分間放置した。 その
後、上澄み液（０．５ｍｌ）を、グリセリンおよびＲ，
Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡをＣ／Ｎ比５：１で
含む鉱物塩培養基（２５ｍｌ）（クラら、Ａｒｃｈ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３５、１〜７頁，１９８３）
に接種した。 続いてこの培養基を、Ｒ，Ｓ−（±）−
２，２−ＤＭＣＰＣＡをＮ供給源として利用できる混合
培養菌が生じるまで培養した。これらの微生物の純粋培
養物は、従来の微生物学的手法により得た。 次いで、
このようにして得た微生物種を、寒天皿上でそれらの
Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ、Ｓ−（＋）−
２，２−ＤＭＣＰＣＡおよびＲ−（−）−２，２−ＤＭ
ＣＰＣＡによる成長を試験し、両異性体（Ｒ−（−）−
２，２−ＤＭＣＰＣＡおよびＳ−（＋）−２，２−ＤＭ
ＣＰＣＡ）により同様に急速に成長する好ましくない菌
種を探し出した。 残りの菌種をさらに試験した。この
菌種で予備培養基に接種した。 この予備培養基中で得
られた微生物を鉱物塩培養基上に移し、そのＲ−（−）
−２，２−ＤＭＣＰＣＡを唯一のＮ供給源として選択的
に利用できる能力を検査した。 その際、上澄み液を、
ＧＣによりＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＳの形成お
よびＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡの蓄積に関して
検査した。
を有する微生物の分離および選択 土壌から得た、細かく砕いた試料（１ｇ）に等張食塩溶
液（９ｍｌ）を加え、全体を約５分間放置した。 その
後、上澄み液（０．５ｍｌ）を、グリセリンおよびＲ，
Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡをＣ／Ｎ比５：１で
含む鉱物塩培養基（２５ｍｌ）（クラら、Ａｒｃｈ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３５、１〜７頁，１９８３）
に接種した。 続いてこの培養基を、Ｒ，Ｓ−（±）−
２，２−ＤＭＣＰＣＡをＮ供給源として利用できる混合
培養菌が生じるまで培養した。これらの微生物の純粋培
養物は、従来の微生物学的手法により得た。 次いで、
このようにして得た微生物種を、寒天皿上でそれらの
Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ、Ｓ−（＋）−
２，２−ＤＭＣＰＣＡおよびＲ−（−）−２，２−ＤＭ
ＣＰＣＡによる成長を試験し、両異性体（Ｒ−（−）−
２，２−ＤＭＣＰＣＡおよびＳ−（＋）−２，２−ＤＭ
ＣＰＣＡ）により同様に急速に成長する好ましくない菌
種を探し出した。 残りの菌種をさらに試験した。この
菌種で予備培養基に接種した。 この予備培養基中で得
られた微生物を鉱物塩培養基上に移し、そのＲ−（−）
−２，２−ＤＭＣＰＣＡを唯一のＮ供給源として選択的
に利用できる能力を検査した。 その際、上澄み液を、
ＧＣによりＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＳの形成お
よびＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡの蓄積に関して
検査した。
【００３１】
【実施例２】Ｒ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを加水分解する酵素
の活性の測定 加水分解酵素の活性を測定するために、微生物分散液を
６５０ｎｍにおける光学密度が０．５になるように調整
した。 培養基として０．２重量％のＲ，Ｓ−２，２−
ＤＭＣＰＣＡを含むリン酸塩緩衝液（１０ミリモル）、
ｐＨ７．０を使用した。 この分散液を３０℃で３時間
振とうしながら培養した。加水分解により放出されたＮ
Ｈ4+またはＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＳを測定
し、１ミリモルの形成されたＮＨ4+が１ミリモルの変換
されたＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡに相当すると
仮定して、活性を、変換されたＲ−（−）−２，２−Ｄ
ＭＣＰＣＡのｇ／ｌ／６５０ｎｍにおける光学密度とし
て表わした。
の活性の測定 加水分解酵素の活性を測定するために、微生物分散液を
６５０ｎｍにおける光学密度が０．５になるように調整
した。 培養基として０．２重量％のＲ，Ｓ−２，２−
ＤＭＣＰＣＡを含むリン酸塩緩衝液（１０ミリモル）、
ｐＨ７．０を使用した。 この分散液を３０℃で３時間
振とうしながら培養した。加水分解により放出されたＮ
Ｈ4+またはＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＳを測定
し、１ミリモルの形成されたＮＨ4+が１ミリモルの変換
されたＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡに相当すると
仮定して、活性を、変換されたＲ−（−）−２，２−Ｄ
ＭＣＰＣＡのｇ／ｌ／６５０ｎｍにおける光学密度とし
て表わした。
【００３２】 表１ 加水分解酵素活性と温度との関係（菌種コマモナス・アシドボランスＡ：１８ ，ＤＳＭ−Ｎｏ．６３１５） 温度（℃） 活性ｇ／ｌ／ｈ／ＯＤ650 ２５ ０．２５ ３０ ０．５ ３７ １．０ ４５ １．５ ４８ １．８ ５５ １．９ ６５ ０
【００３３】
【実施例３】Ｓ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡの製造 コマモナス・アシドボランス Ａ：１８を、Ｃ供給源とし
てグリセリン、Ｎ供給源として硫酸アンモニウムを含む
鉱物塩培養基−寒天皿上で、３０℃で２日間培養した。
この鉱物塩培養基の組成を表２に示す。 この表面を
覆った微生物で同じ組成を有する予備培養基に接種し、
３０℃で２日間培養した。 誘発させるために０．２重
量％のグリセリンおよび０．１５重量％のＲ，Ｓ−
（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを含み、（ＮＨ4）2ＳＯ
4の代りにＮａ2ＳＯ4を含む同じ鉱物塩培養基にこの予
備培養基５ｍｌを接種し、３０℃で４５時間培養した。
続いて、細胞を遠心分離により採取し、０．９％Ｎａ
Ｃｌ溶液中に入れた。 細胞を１０ミリモルのリン酸塩
緩衝液（８００ｍｌ）、ｐＨ７．０中に再分散させた
後、６５０ｎｍにおける光学密度を１．３に調整し、２
重量％のＲ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを加え
た。 ３７℃で約２５時間培養した後、Ｒ−（−）−
２，２−ＤＭＣＰＣＡは完全にＲ−（−）−２，２−Ｄ
ＭＣＰＣＳに変換されたが、これは１００％の光学純度
（ｅｅ）および分析により測定したＳ−（＋）−２，２
−ＤＭＣＰＣＡの収量４６．７％に相当した。 反応の
推移は、ＮＨ4+放出および上澄み液のＧＣ分析により追
跡した。 細胞を遠心分離により除去した後、上澄み液
をｐＨ値９．５に調節し、生成物を酢酸エチルで抽出す
ることにより分離した。
てグリセリン、Ｎ供給源として硫酸アンモニウムを含む
鉱物塩培養基−寒天皿上で、３０℃で２日間培養した。
この鉱物塩培養基の組成を表２に示す。 この表面を
覆った微生物で同じ組成を有する予備培養基に接種し、
３０℃で２日間培養した。 誘発させるために０．２重
量％のグリセリンおよび０．１５重量％のＲ，Ｓ−
（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを含み、（ＮＨ4）2ＳＯ
4の代りにＮａ2ＳＯ4を含む同じ鉱物塩培養基にこの予
備培養基５ｍｌを接種し、３０℃で４５時間培養した。
続いて、細胞を遠心分離により採取し、０．９％Ｎａ
Ｃｌ溶液中に入れた。 細胞を１０ミリモルのリン酸塩
緩衝液（８００ｍｌ）、ｐＨ７．０中に再分散させた
後、６５０ｎｍにおける光学密度を１．３に調整し、２
重量％のＲ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを加え
た。 ３７℃で約２５時間培養した後、Ｒ−（−）−
２，２−ＤＭＣＰＣＡは完全にＲ−（−）−２，２−Ｄ
ＭＣＰＣＳに変換されたが、これは１００％の光学純度
（ｅｅ）および分析により測定したＳ−（＋）−２，２
−ＤＭＣＰＣＡの収量４６．７％に相当した。 反応の
推移は、ＮＨ4+放出および上澄み液のＧＣ分析により追
跡した。 細胞を遠心分離により除去した後、上澄み液
をｐＨ値９．５に調節し、生成物を酢酸エチルで抽出す
ることにより分離した。
【００３４】
【実施例４】実施例１と同様にして、微生物バクテリウ
ム・ｓｐＶＩＩＩ：ＩＩを分離した。この微生物では予
備培養期間が３日間、誘発期間が３日間で、その他の条
件は実施例３と同じであった。 実施例３と異なり、こ
の微生物では生物変換を０．２重量％のＲ，Ｓ−（±）
−２，２−ＤＭＣＰＣＡで行ない、その際、加水分解酵
素の活性は０．１３ｇ／ｌ／ｈ／ＯＤ650と測定され
た。
ム・ｓｐＶＩＩＩ：ＩＩを分離した。この微生物では予
備培養期間が３日間、誘発期間が３日間で、その他の条
件は実施例３と同じであった。 実施例３と異なり、こ
の微生物では生物変換を０．２重量％のＲ，Ｓ−（±）
−２，２−ＤＭＣＰＣＡで行ない、その際、加水分解酵
素の活性は０．１３ｇ／ｌ／ｈ／ＯＤ650と測定され
た。
【００３５】 表２ 予備培養基の組成（クラら、Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３５、１ 〜７頁、１９８３） 単位ｇ／ｌ蒸留水中 ｐＨ７．０ ２．０ （ＮＨ4）2ＳＯ4 ２．５ Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ １．０ ＫＨ2ＰＯ4 ３．０ ＮａＣｌ ０．４ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．０１５ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．０００８ ＦｅＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．０００１ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００００９ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．０００３ Ｈ3ＢＯ3 ０．０００２ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．００００１ ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．００００２ ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．００００３ Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．００５ Ｎａ2ＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ ０．００２ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ グリセリン
【００３６】
【実施例５】実施例１と同様にして、微生物シュードモ
ナス・ｓｐＮＳＡＫ：４２（ＤＳＭ−Ｎｏ．６４３３）
を分離した。予備培養期間が２日間、誘発期間が１８時
間で、その他の条件は実施例３と同じであったが、誘発
培養基は１重量％のグリセリン（０．２重量％の代り
に）および０．３重量％のユニバーサルペプトン（メル
ク）を含むものであった。 生物変換は、０．２重量％
のＲ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡで行ない、そ
の際、加水分解酵素の活性は０．３４ｇ／ｌ／ｈ／ＯＤ
650と測定された。
ナス・ｓｐＮＳＡＫ：４２（ＤＳＭ−Ｎｏ．６４３３）
を分離した。予備培養期間が２日間、誘発期間が１８時
間で、その他の条件は実施例３と同じであったが、誘発
培養基は１重量％のグリセリン（０．２重量％の代り
に）および０．３重量％のユニバーサルペプトン（メル
ク）を含むものであった。 生物変換は、０．２重量％
のＲ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡで行ない、そ
の際、加水分解酵素の活性は０．３４ｇ／ｌ／ｈ／ＯＤ
650と測定された。
【００３７】
【実施例６】コマモナス・アシドボランスＴＧ３０８
（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５２）を複合培養基（４ｍｌ）
「ニュートリエント・ブロス」（オキソイド社、ＧＢ）
中で３０℃で２日間培養した。 この微生物で鉱物塩培
養基（表３）に接種し、３０℃で２日間培養した。 続
いて細胞を実施例３に応じて採取した。 実施例３と異
なり、生物変換を０．５重量％のＲ，Ｓ−（±）−２，
２−ＤＭＣＰＣＡを含む１０ミリモルのＨＥＰＥＳ緩衝
液（ｐＨ７．０）中で、その他は実施例３と同じ条件下
で行なった。 ３７℃で４．５時間の培養後、Ｒ−
（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡが完全にＲ−（−）−
２，２−ＤＭＣＰＣＳに変換されたが、これは分析によ
り測定したＳ−（＋）−ＤＭＣＰＣＡの収量４５．５％
および光学純度（ｅｅ）９９．０％に相当した。
（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５２）を複合培養基（４ｍｌ）
「ニュートリエント・ブロス」（オキソイド社、ＧＢ）
中で３０℃で２日間培養した。 この微生物で鉱物塩培
養基（表３）に接種し、３０℃で２日間培養した。 続
いて細胞を実施例３に応じて採取した。 実施例３と異
なり、生物変換を０．５重量％のＲ，Ｓ−（±）−２，
２−ＤＭＣＰＣＡを含む１０ミリモルのＨＥＰＥＳ緩衝
液（ｐＨ７．０）中で、その他は実施例３と同じ条件下
で行なった。 ３７℃で４．５時間の培養後、Ｒ−
（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡが完全にＲ−（−）−
２，２−ＤＭＣＰＣＳに変換されたが、これは分析によ
り測定したＳ−（＋）−ＤＭＣＰＣＡの収量４５．５％
および光学純度（ｅｅ）９９．０％に相当した。
【００３８】 表３ 単位ｇ／ｌ蒸留水中 ｐＨ７．０ ２．０ Ｋ2ＨＰＯ4 ２．０ ＫＨ2ＰＯ4 ２．０ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ 酵母抽出物 ２．０ ユニバーサルペプトン（メルク） ２．０ ＮａＣｌ ０．０１ ＦｅＣｌ2・Ｈ2Ｏ １０ グルタミン酸ナトリウム ５ クロトンアミド
【００３９】
【実施例７】細胞を含まない系における、酵素によるＳ
−（＋）−ＤＭＣＰＣＡの製造 コマモナス・アシドボランス Ａ：１８の細胞を、誘発
後、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）中で９
５ｍｌ、６５０ｎｍにおける光学密度２１０に濃縮し
た。 続いて、細胞を２回フレンチプレス中で１２００
バールの圧力で溶解させた。 細胞を含まない酵素の抽
出物を得るために、全体を２００００ｒｐｍで遠心分離
した。 この細胞を含まない酵素抽出物中のタンパク質
量は（ブラッドフォード法で測定して）３９．３ｍｇタ
ンパク質／ｍｌであることが確認された。 この細胞を
含まない酵素の活性を測定するために、この細胞を含ま
ない酵素抽出物２０μｌ（約０．８ｍｇタンパク質）
を、０．２重量％のＲ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰ
ＣＡを含む４ｍｌのリン酸塩緩衝液中に入れ、３０℃で
培養した。 その際、細胞を含まない酵素中で、２．５
ｇのＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ／ｈ／ｇタンパ
ク質（３．６４μモル／ｍ／ｇタンパク質）が相当する
酸に変換された。
−（＋）−ＤＭＣＰＣＡの製造 コマモナス・アシドボランス Ａ：１８の細胞を、誘発
後、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）中で９
５ｍｌ、６５０ｎｍにおける光学密度２１０に濃縮し
た。 続いて、細胞を２回フレンチプレス中で１２００
バールの圧力で溶解させた。 細胞を含まない酵素の抽
出物を得るために、全体を２００００ｒｐｍで遠心分離
した。 この細胞を含まない酵素抽出物中のタンパク質
量は（ブラッドフォード法で測定して）３９．３ｍｇタ
ンパク質／ｍｌであることが確認された。 この細胞を
含まない酵素の活性を測定するために、この細胞を含ま
ない酵素抽出物２０μｌ（約０．８ｍｇタンパク質）
を、０．２重量％のＲ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰ
ＣＡを含む４ｍｌのリン酸塩緩衝液中に入れ、３０℃で
培養した。 その際、細胞を含まない酵素中で、２．５
ｇのＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ／ｈ／ｇタンパ
ク質（３．６４μモル／ｍ／ｇタンパク質）が相当する
酸に変換された。
【００４０】
【実施例８】固定した細胞によるＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ
の製造 誘発後（実施例３により）、コマモナス・アシドボラン
スＡ：１８の細胞を採取した。 これらの細胞をポリエ
チレンイミン／グルタルアルデヒド処理（ＣＳ−ＰＳ２
５１１１１に準じて）により固定した。 この固定した
生物触媒は１．６μモル／ｍｉｎ・ｇ乾燥重量の活性を
有していた。 この生物触媒の乾燥重量は湿重量の３２
％に相当していた。 次いで、この生物触媒（湿重量５
５ｇ）を、１６ｇのＲ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰ
ＣＡを含む８００ｍｌのホウ酸（１０ｍＭ、ｐＨ９．
０）に分散させた。 撹拌速度２００ｒｐｍ、３７℃で
６８．８ｈの培養期間の後、Ｒ−（−）−２，２−ＤＭ
ＣＰＣＡは完全にＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＳに
変換されたが、これは光学純度（ｅｅ）９８．２％、分
析により測定したＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ収
量４０％に相当していた。
の製造 誘発後（実施例３により）、コマモナス・アシドボラン
スＡ：１８の細胞を採取した。 これらの細胞をポリエ
チレンイミン／グルタルアルデヒド処理（ＣＳ−ＰＳ２
５１１１１に準じて）により固定した。 この固定した
生物触媒は１．６μモル／ｍｉｎ・ｇ乾燥重量の活性を
有していた。 この生物触媒の乾燥重量は湿重量の３２
％に相当していた。 次いで、この生物触媒（湿重量５
５ｇ）を、１６ｇのＲ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰ
ＣＡを含む８００ｍｌのホウ酸（１０ｍＭ、ｐＨ９．
０）に分散させた。 撹拌速度２００ｒｐｍ、３７℃で
６８．８ｈの培養期間の後、Ｒ−（−）−２，２−ＤＭ
ＣＰＣＡは完全にＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＳに
変換されたが、これは光学純度（ｅｅ）９８．２％、分
析により測定したＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ収
量４０％に相当していた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (17)
- 【請求項１】 Ｓ−（＋）−２，２−メチルシクロプロ
パンカルボキサミドの製造方法において、ラセミ性Ｒ，
Ｓ−（±）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキ
サミド中のＲ−（−）−２，２−ジメチルシクロプロパ
ンカルボキサミドをＲ−（−）−２，２−ジメチルシク
ロプロパンカルボン酸に生物変換し、その際に沈殿する
光学活性のＳ−（＋）−２，２−ジメチルシクロプロパ
ンカルボキサミドを分離することを特徴とする方法。 - 【請求項２】 生物変換を微生物によって行なうことを
特徴とする請求項１の方法。 - 【請求項３】 生物変換を、細胞を含まない系において
酵素により行なうことを特徴とする請求項１または２の
方法。 - 【請求項４】 生物変換を、ラセミ性２，２−ジメチル
シクロプロパンカルボキサミドを０．２〜５重量％の量
で含む培養基中で行なうことを特徴とする請求項１〜３
のいずれかの方法。 - 【請求項５】 生物変換を、６〜１１のｐＨ値および１
５〜５５℃の温度で行なうことを特徴とする請求項１〜
４のいずれかの方法。 - 【請求項６】 生物変換を、コマモナス・アシドボラン
スＡ：１８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６３１５）種もしくはそれ
らの子孫および突然変異体により、またはこれらの微生
物から得た、細胞を含まない酵素により行なうことを特
徴とする請求項１〜５のいずれかの方法。 - 【請求項７】 生物変換を、コマモナス・アシドボラン
スＴＧ３０８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５２）種もしくはそ
れらの子孫および突然変異体により、またはこれらの微
生物から得た、細胞を含まない酵素により行なうことを
特徴とする請求項１〜５のいずれかの方法。 - 【請求項８】 生物変換を、シュードモナス・ｓｐＮＳ
ＡＫ：４２（ＤＳＭ−Ｎｏ．６４３３）種もしくはそれ
らの子孫および突然変異体により、またはこれらの微生
物から得た、細胞を含まない酵素により行なうことを特
徴とする請求項１〜５のいずれかの方法。 - 【請求項９】 生物変換を、バクテリウム・ｓｐＶＩＩ
Ｉ：ＩＩ（ＤＳＭ−Ｎｏ．６３１６）種もしくはそれら
の子孫および突然変異体により、またはこれらの微生物
から得た、細胞を含まない酵素により行なうことを特徴
とする請求項１〜５のいずれかの方法。 - 【請求項１０】 ラセミ性Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ジ
メチルシクロプロパンカルボキサミド中のＲ−（−）−
２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドをＲ−
（−）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボン酸に
生物変換することができ、その際に光学活性のＳ−
（＋）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミ
ドが沈殿することを特徴とする微生物。 - 【請求項１１】 請求項１０の微生物であって、 ａ）Ｎ供給源としてのラセミ体またはその光学異性体の
形である２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミ
ド、およびＣ供給源により成長する微生物を培養し、 ｂ）この培養菌から、安定しており、ラセミ化合物また
はその光学異性体の形の２，２−ジメチルシクロプロパ
ンカルボキサミドを唯一のＮ供給源として利用する菌を
選択する 選択方法により得られることを特徴とする微生物。 - 【請求項１２】 Ｃ供給源としての糖、糖アルコール、
カルボン酸、アルコールまたは他のＣ供給源を成長基質
として利用することを特徴とする請求項１０または１１
の微生物。 - 【請求項１３】 Ｎ供給源としてＲ−（−）−２，２−
ジメチルシクロプロパンカルボキサミドを受け入れるこ
とを特徴とする請求項１０〜１２のいずれかの微生物。 - 【請求項１４】 微生物コマモナス・アシドボランス
Ａ：１８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６３１５）およびそれらの子
孫および突然変異体。 - 【請求項１５】 微生物コマモナス・アシドボランスＴ
Ｇ３０８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５２）およびそれらの子
孫および突然変異体。 - 【請求項１６】 微生物シュードモナス・ｓｐＮＳＡ
Ｋ：４２（ＤＳＭ−Ｎｏ．６４３３）およびそれらの子
孫および突然変異体。 - 【請求項１７】 微生物バクテリウム・ｓｐＶＩＩＩ：
ＩＩ（ＤＳＭ−Ｎｏ．６３１６）およびそれらの子孫お
よび突然変異体。
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