PL168885B1 - Sposób wytwarzania S-/+/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamidu PL PL PL PL - Google Patents

Sposób wytwarzania S-/+/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamidu PL PL PL PL

Info

Publication number
PL168885B1
PL168885B1 PL92293716A PL29371692A PL168885B1 PL 168885 B1 PL168885 B1 PL 168885B1 PL 92293716 A PL92293716 A PL 92293716A PL 29371692 A PL29371692 A PL 29371692A PL 168885 B1 PL168885 B1 PL 168885B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
microorganisms
dmcpca
dimethylcyclopropanecarboxamide
dsm
cell
Prior art date
Application number
PL92293716A
Other languages
English (en)
Other versions
PL293716A1 (en
Inventor
Karen Robins
Thomas Gilligan
Original Assignee
Lonza Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza Ag filed Critical Lonza Ag
Publication of PL293716A1 publication Critical patent/PL293716A1/xx
Publication of PL168885B1 publication Critical patent/PL168885B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/874—Pseudomonas

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania S-/+/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamidu, znamienny tym, ze w racem icznym R, S-/±/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamidzie R-/-/-2,2- dimetylocyklopropanokarboksamid poddaje sie biotransformacji do kwasu R-/-/-2.2- dimetylocyklopropanokarboksylowego i wydziela sie optycznie czynny S -/+ /-2,2-di- metylocyklopropanokarboksamid, przy czym biotransformacje prowadzi sie za pomoca mikroorganizmów gatunku Comamonas acidovorans A: 18 (DSM-Nr. 6315) albo ich potom- ków i mutantów, albo za pomoca bezkomórkowych enzymów z tych mikroorganizmów lub za pomoca mikroorganizmów gatunku Bacterium sp. V I I I : I I (DSM-Nr 6316) albo ich potomków i mutantów, albo za pomoca bezkomórkowych enzymów z tych mikroorgani- zmów. R ZECZPO SPO LITA POLSKA Urzad Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy biotechnologiczny sposób wytwarzania S-/+/-2,2dimetylocyklopropanokarboksamidu.
Dalej w opisie stosuje się skrót 2,2-DMCPCA dla 2,2-dimetylocyklopropanokarboksamidu i 2,2-DMCPCS dla kwasu 2,2-dimetylocykloproprnokarboksylowego.
Optycznie czysty S-/+/-2,2-DMCPCA służy jako substancja wyjściowa do wytwarzania inhibitora dehydropeptydazy cylastatyny, który podaje się w lecznictwie razem z antybiotykami Penem względnie Carbapenem w celu zapobiegania dezaktywacji antybiotyków przez nerkową dehydropeptydazę w nerkach (europejski opis patentowy EP 048 301).
Dotychczas znane są tylko chemiczne sposoby wytwarzania S-/+/-2,2-DMCPCA. Sposoby te mają tę wadę, że wymagają dużych nakładów i przebiegają przez wiele etapów (europejski opis patentowy EP 155 779).
Celem wynalazku jest opracowanie biotechnologicznego sposobu, za pomocą którego wychodząc z łatwo dostępnego racemicznego R, S-/±/-2,2-DMCPCA można by otrzymać w jednym etapie żądany izomer o wysokim stopniu czystości.
168 885
Cel ten osiągnięto za pomocą nowego sposobu według wynalazku i przy użyciu nowych mikroorganizmów.
Mikroorganizmy stosowane w sposobie według wynalazku są zdolne do tego, aby w racemicznym R, S-/±/-2.2-DMCPCA R-/-/-2,2-DMCPCA poddawać biotransformacji do R-/-/2,2-DMCPCS, przy czym wydziela się optycznie czynny S-/+/-2,2-DMCPCA.
Mikroorganizmy te można na przykład wyodrębniać z próbek gleby, osadów ściekowych lub ścieków przy użyciu tradycyjnych technik mikrobiologicznych.
Zgodnie z wynalazkiem wytwarza się optycznie czynny S-/+/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamid przez poddanie w racemicznym R, S-/+/-2,2-dimetylocyklo propanokarboksamidzie R-/-/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamidu biotransformacji do kwasu R-/-/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksylowego i wydziela się żądany S-/+/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamid, przy czym biotransformację prowadzi się za pomocą mikroorganizmów gatunku Comamonas acidovorans A: 18 (DSM-Nr 6315) albo ich potomków i mutantów, albo za pomocą bezkomórkowych enzymów z tych mikroorganizmów lub za pomocą mikroorganizmów gatunku Bacterium sp. VIII:II (DSM-Nr 6316) albo ich potomków i mutantów, albo za pomocą bezkomórkowych enzymów z tych mikroorganizmów. Biotransformację prowadzi się również za pomocą mikroorganizmów gatunku Comamonas acidovorans TG 308 (DSM-Nr 6552) albo ich potomków i mutantów, albo za pomocą bezkomórkowych enzymów z tych mikroorganizmów lub za pomocą mikroorganizmów gatunku Pseudomonas sp NSAK:42 (DSM-Nr 6433) albo ich potomków i mutantów, albo za pomocą bezkomórkowych enzymów z tych mikroorganizmów.
Zgodnie z wynalazkiem do wytwarzania S-/+/-2,2-DMCPCA bierze się pod uwagę mikroorganizmy, które wykorzystują R-/-/-DMCPCA jako substrat.
Mikroorganizmy te otrzymuje się według następującej metody selekcji:
a) mikroorganizmy, które wzrastają przy użyciu 2,2-DMCPCa w postaci racematu lub izomerów optycznych jako źródła azotu i przy użyciu źródła węgla, hoduje się w znany sposób,
b) z kultury otrzymanej w tej hodowli selekcjonuje się te mikroorganizmy, które są trwałe i wykorzystują 2,2-DMCPCA w postaci racematu lub izomerów optycznych jako jedyne źródło azotu.
Korzystnie selekcjonuje się te mikroorganizmy, które akceptują R-/-/-2,2-DMCPCA jako źródło azotu.
Jako źródło węgla dla mikroorganizmów można stosować na przykład cukry, alkohole cukrowe, kwasy karboksylowe lub alkohole jako substrat wzrostu. Jako cukry można stosować na przykład fruktozę lub glikozę.
Jako alkohole cukrowe można stosować na przykład erytryt, mannit lub sorbit. Jako kwasy karboksylowe można stosować kwasy mono-, di- lub trikarboksylowe, takie jak na przykład kwas octowy, kwas malonowy lub kwas cytrynowy. Jako alkohole można stosować alkohole jedno-, dwu- lub trójwartościowe, takie jak na przykład etanol, glikole lub gliceryna. . . _
Korzystnie jako źródło węgla stosuje się alkohol trójwartościowy, taki jak na przykład gliceryna.
Korzystnie stosunek C/N w środowisku selekcyjnym wynosi 5:1 do 10:1.
Jako środowisko selekcyjne można stosować środowiska zwykle stosowane przez fachowców, na przykład środowisko soli mineralnych, opisane w Kulla i in., Arch. Microbiol. 135, str. 1-7, 1983.
Jako mikroorganizmy, które wzrastają przy użyciu 2,2-DMCPCA w postaci racematu lub jego izomerów optycznych jako źródła azotu i przy użyciu źródła węgla wymienia się: Comamonas acidovorans A: 18 (DSM-Nr 6315). Comamonas acidovorans TG 308 (DSM-Nr 6552). Pseudomonas sp NSAK:42 (DSM-Nr 6433) i mikroorganizm Bacterium sp. VIII:II (DSM-Nr 6316) oraz ich potomkowie i mutanty.
Szczepy DSM-Nr 6315 i 6316 zostały zdeponowane w dniu 29.01.1991, DSM-Nr 6433 w dniu 25.03.1991 i DSM-Nr 6552 w dniu 6.04.1991 w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascherodeweg IB, D-3300 Braunschweig.
168 885
Naukowa charakterystyka Comamonas acidovorans A: 18 (DSM-Nr 6315):
Postać komórek Sztabki Hydroliza
. 1 _ z ' 0 5 0 7 sr__u:~
Szerokość μm U,J'U, z OMUUld
Długość pm 1,5-3,0 Żelatyna -
Ruchliwość + Kazeina -
Rzęski polarne 1 DNA -
Gram-reakcja - Tween 80 -
Liza za pomocą 3% KOH + Eskulina -
Aminopeptydaza (Cerny) + Odbudowa tyrozyny -
Zarodniki - Wykorzystanie substratu
Oksydaza + Octan +
Katalaza + Adypinian +
Wzrost Kapryman +
anaerobowy - Cytrynian +
37/41°C +/- Glikolan +
pH 5,6 + Lewulinian +
Agar Mac Conkey + Jabłczan +
SS-agar + Malonian -
Agar cetrimidowy + Fenylooctan +
Pigmenty L-arabinoza -
nie dyfundujące - Fruktoza +
dyfundujące - Glukoza -
fluoryzujące - Mannoza -
piocyjanina - Maltoza -
Kwas z (test OF) Ksyloza -
glukoza aerobowa - Inozytol -
glukoza anaerobowa - Mannitol +
Gaz z glukozy - Glukonian +
Kwas z N-acetyloglukozamina -
Glukoza - L-seryna -
Fruktoza + L-tryptofan +
Ksyloza - Acetamid +
Mannit + Mezakonian +
Gliceryna + Cytrakonian +
ONPG - L-winian +
ADH - Źródło azotu
VP - NHą+ ++
Indol - R, S-l±J-2,2-dimety locyklo-
NO2 z- NO3 + propanokarboksamid +
Denitryfikacja - Butyramid ++
Fenyloalaninodezaminaza - Acetamid +
Lewan z sacharozy - Propionamid +
Lecytynaza - Formamid ±
Ureaza - Benzamid Nikotynamid + +
API 20NE — Cs.acidovorans 99,0%
168 885
Naukowy opis Comamonas acidovorans TG 308 (DSM-Nr 6552) Postać komórki Sztabki
Gram-reakcja (test KOH) Gram-zabarwienie Zarodniki Ruchliwość +
Wzrost °C
37°C +
41°C 45°C Katalaza +
Oksydaza +
Fermentacja w Glukoza (test OF)
Redukcja azotanu
Wytwarzanie indolu
Kwas z glukozy
Argininodehydrolaza
Ureaza
Hydroliza eskuliny
Hydroliza żelatyny β-galaktozydaza
Asymilacja glukozy
Asymilacja arabinozy
Asymilacja mannozy
Asymilacja mannitolu
Asymilacja N-acetylo-glukozaminy Asymilacja maltozy Asymilacja glukonianu Asymilacja kaprynianu Asymilacja adypinianu Asy milacj a j ablczanu Asymilacja cytrynianu Asymilacja fenylooctanu Oksydaza cytochromowa NO2 z NO3 Hydroliza mocznika Wykorzystanie fruktozy Alkalizowanie acetamidu Alkali zowunie winianu Alkalizowenie c^ayaianu Simmona Alkaliaowanie malonianu Hy słabo dodanie
Izolaty TG308 + +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
/+/
168 885
Naukowy opis Pseudomonas sp NSAK:42 (DSM-Nr 6433):
Postać komórkowa Sztabki Hydroliza
Szerokość μιη 0 6 0 8 υ,ο-υ,ο Skrobia -
Długość μη 1,5-3,0 Żelatyna -
Ruchliwość + Kazeina -
Gram-reakcja - DNA -
Liza przez 3% KOH Tween 80 -
Aminopeptydaza + Eskulina -
Zarodniki - Odbudowa tyrozyny -
Oksydaza + Zapotrzebowanie na substancje woskowe
Katalaza + Wykorzystanie substratów
Wzrost Octan +
anaerobowy - Kaprynian +
37/41°C +/- Cytrynian +
pH 5,6 + Glikolan +
agar Mac-Conkey + Mleczan +
SS-agar - Lewulinian +
agar cetrimidowy - Jabłczan +
Pigmenty żółte Malonian +
Kwas z (test OF) Fenylooctan +
Glukoza aerobowa - Suberynian +
Glukoza anaerobowa - L-arabinoza -
Gaz z glukozy - Fruktoza +
Kwas z Glukoza -
Glukoza - Mannoza -
Fruktoza - Maltoza -
Ksyloza - Ksyloza -
ONPG - Mannitol -
ODC - Glukonian +
ADH - 2-ketoglukonian +
VP - N-acetyloglukozamina -
Indol - L-seryna +
NO2 z NO 3 - L-histydyna +
Denitryfikacj a - Hydroksymaślan +
Fenyloalaninodezaminaza - Źródło azotu
Lewan z sacharozy - NH4+ ++
Lecytynaza - R,S-/±/-2,2-dimetylocyklo-
Ureaza - propanokarboksamid +
168 885
Naukowy opis Bacterium sp. (DSM-Nr 6316)
Gram-zabarwienie +
Gram-reakcja (test KOH) -
Oksydaza -
Katalaza -
Redukcja azotanów -
Tryptofan —indol -
Glukoza (anaerobowa) -
Arginina -
Ureaza -
Eskulina +
Żelatyna -
β-galaktozydaza +
Glukoza +
Arabinoza -
Mannoza /+/
Mannit +
N-acetyloglukozamina -
Maltoza +
Glukonian -
Kaprynian -
Adypinian -
Jabłczan -
Cytrynian -
Fenylooctan -
Hodowla wstępna. Zazwyczaj po selekcji zakłada się hodowlę wstępną tych mikroorganizmów, za pomocą której można zaszczepić też dalsze hodowle. Tę hodowlę wstępną można prowadzić w tych samych pożywkach, z tym samym stosunkiem C/N i z tymi samymi związkami jako źródłem węgla, jak w postępowaniu selekcyjnym.
Korzystnie pożywka dla hodowli wstępnej zawiera skład podany w tabeli 2 albo skład podany w tabeli 3 z lub bez uniwersalnego peptonu. Jako źródło azotu dla hodowli wstępnej stosuje się substancje zwykle stosowane przez fachowców, korzystnie sól amonową, na przykład siarczan amonu.
Wartość pH hodowli wstępnej wynosi korzystnie 4-10 w temperaturze korzystnie 20-40°C.
Po okresie hodowania wynoszącym na ogół 10-100 godzin mikroorganizmy pobudza się i przygotowuje do biotransformacji.
Pobudzanie. Zazwyczaj tą hodowlą wstępną zaszczepia się pożywkę indukcyjną, która aż do źródła azotu ma ten sam skład, co pożywka hodowli wstępnej. Korzystnie pożywka ta w celu pobudzenia aktywnych enzymów mikroorganizmów zawiera 2,2-DMCPCA w postaci racematu albo izomerów optycznych stosowany zarówno jako źródło azotu jak i jako enzym-induktor. Jako induktory można jednak stosować też inne związki, takie jak na przykład cyklopropanokarboksamid, kaprolaktam, benzamid, cykloheksanokarboksamid, amid kwasu nikotynowego lub krotonamid. Pobudzanie prowadzi się korzystnie przy użyciu 0,05-0,15% wagowych, korzystnie 0,1-0,15% wagowych 2,2-DMCPCA w postaci racematu lub jego izomerów optycznych.
Proces pobudzania prowadzi się w ciągu 15-80 godzin, po czym mikroorganizmy oddziela się na przykład drogą odwirowania lub ultrafiltracji i następnie zawieszaje ponownie w pożywce do właściwego sposobu.
168 885
Biotransformacja. Zasadniczy sposób wytwarzania S-/+/-2,2-DMCPCA prowadzi się zgodnie z wynalazkiem w ten sposób, że w racemicznym R, S-/±/-2,2-DMCpCa R-/-/-2,2DMCPCA poddaje się biotraedformacji do R-A/^^-DMCpCS, przy czym wydziela się optycznie czynny S-/+/-2,2-DMCPCA, który wyodrębnia się.
Racemiczny R,S-/±/-2,2-DMCpCA można na przykład wytwarzać chemicznie lub enzymatycznie wychodząc z nitrylu kwasu R,S-/±/-2,2-dimetelocyklopropaeonarbondylowego.
Biotraedformację prowadzi się za pomocą mikroorganizmów albo za pomocą enzymów w układzie bezkomórkowym.
Enzymy do układu bezkomórkowego można uzyskiwać drogą znanego roztwarzania komórek mikroorganizmów. Można tu stosować na przykład metodę ultradźwiękową, metodę Frencha, metodę ciśnieniową lub metodę lizozymową. Te bezkomórkowe enzymy można następnie na przykład dla przeprowadzenia sposobu unieruchomić na odpowiednim materiale nośnikowym.
W sposobie według wynalazku stosuje się mikroorganizmy gatunku Comamonas aciSovordes A: 18 (DSM-Nr 6315), Comamonas dciSovordes TG 308 (DSM-Nr 6552), PseuSomoead sp NSAK:42 (DSM-Nr 6433) i gatunku Bacterium sp VIII;II (DSM-Nr 6316, ich potomstwo i mutanty.
Można również stosować bezkomórkowe enzymy z tych mikroorganizmów.
Proces prowadzi się korzystnie albo za pomocą komórek mikroorganizmów w stanie spoczynku (komórki nie wzrastające), nie potrzebujących już źródła węgla i azotu, albo za pomocą enzymów w układzie bezkomórkowym, przy czym enzymy te otrzymuje się w sposób wyżej opisany, na przykład drogą roztwarzania pobudzonych mikroorganizmów.
Pożywka zawiera korzystnie ^emicmy 2,2-DMCPCA w ilości 0,2-5% wagowych, korzystnie 0,2-2% wagowych.
Jako pożywkę można stosować pożywki znane fachowcom, takie jak na przykład niskomolowe bufory fosforanowe, wyżej opisana pożywka z soli mineralnych albo bufor HEPES (kwas N-2-hydrokdyetylopiperazyeo-2’-etaeosulfonoky). Korzystnie proces prowadzi się w eiskomolowem buforze fosforanowym.
Wartość pH pożywki może wynosić 6-11, korzystnie 6,5-10.
Biotraesformację prowadzi się korzystnie w temperaturze 15-55°C, zwłaszcza 20-40°C.
Po upływie 1-30 godzin, korzystnie 5-25 godzin R-/-/-2,2-DMCPCA ulega całkowicie przemianie w odpowiedni kwas, przy czym wydziela się optycznie czysty S-/+/-2,2-DMCPCA. Tak otrzymany S-/+/o2,2-DMCPcA można następnie wyodrębniać na przykład za pomocą ekstrakcji, elektrodializy lub suszenia.
Przykład I. Wyodrębnianie i selekcja mikroorganizmów za pomocą R-/-/^^DMCPCA-hedrolazy
Do rozdrobnionych próbek 1 g ziemi dodaje się 9 ml izotonicznego roztworu soli kuchennej i całość pozostawia na okres około 5 minut. Następnie za pomocą 0,5 ml cieczy znad osadu zaszczepia się 25 ml pożywki z soli mineralnych /Kulla i in., Arch. Mikrobiol. 135, str. 1-7, 1983/, zawierającej glicerynę i R,S-/±/-DMCPCa w stosunku C/N 5:1. Następnie prowadzi się hodowlę aż do utworzenia kultury mieszanej, która jest w stanie użytkować R, S-/±/-2,2DMCPCa jako źródło azotu. Czyste hodowle tych mikroorganizmów otrzymuje się za pomocą tradycyjnych technik mikrobiologicznych. Tak otrzymane szczepy mikroorganizmów testuje się na płytkach agarowych na ich wzrost na R, S-/±/-2,2-DMCPcA, S-/+/-2,2-DMCPCA i R-/-/2,2-DMCPCA w celu znalezienia szczepów niepożądanych, które na obydwu izomerach R-/-/2,2-DMCPCA i S-/+/-2,2-DMCPCA wzrastają z jednakową prędkością. Pozostałe szczepy poddaje się dalszemu testowaniu. Za pomocą tych szczepów zaszczepia się pożywkę hodowli wstępnej. Mikroorganizmy otrzymane w tej hodowli wstępnej przenosi się do pożywki z soli mineralnych i następnie testuje ich zdolność do selektywnego wykorzystania R-/-/-2,2DMCPCA jako jedynego źródła azotu, przy czym ciecz znad osadu bada się za pomocą GC na tworzenie R-/-/-2,2-DMCPCS i wzbogacanie S-/+/-2,2DMCPCA.
168 885
Przykład II. Określanie aktywności R-/-/-2,2-DMCPCA-hydrolazy W celu określenia aktywności hydrolazy zawiesinę mikroorganizmów nastawia się na mtypznr pęstnśr 0 5 nrzv 65Ω nm. Tal<0 nnyvwkp tfnujii p ςΐρ 1Ω miruślnwbi hiifnt· f/oranmyno, r>
~ r ~J-----C c>^~-----7- r--j--- ----- -----X---J *“X - “ -*J “ --T * ~ ·. j v*A o i JI ^LJlViUllV »» J V/ _____^ττ τ n _____t\ ^nr ____________2 t> 202 da a ^ · · ,1 · .
^ιυ^ι pn /,u i z,ewdnv:>ui4 v,±yv w aguw^n rx, zawiesinę tę poaaęje się inkubacji, wstrząsając, w ciągu 3 godzin w temperaturze 30°C. Dokonuje się pomiaru uwolnionego przez hydrolazę NHZ albo R-zz-/-2,2-DMCPCS i aktywność wyraża jako ilość g przereagowanego R-/-/-2,2-DMCPCA na litr na godzinę przy gęstości optycznej przy 650 nm, z założeniem, że 1 mmol utworzonego NH/ odpowiada 1 mmolowi przereasowanego R-/-/-2,2DMCPCA. ~
W tabeli 1 podaje się oznaczanie aktywności hydrolazy w zależności od temperatury (szczep Comamonas τcidovorans A: 18, DSM-Nr 6315).
Tabela 1
Temperatura w °C Aktywność g/litr/grdzinα/OD650
1 2
25 0,25
30 0,5
37 1,0
45 1,5
48 1,8
55 1,9
65 0
Przykład III. Wytwarzanie S-/+/-2,2-DMCPCA
Comamonas acidovorans A: 18 poddaje się inkubacji na płytkach agarowych z pożywką z soli mineralnych, z gliceryną jako źródłem węgla i siarczanem amonu jako źródłem azotu w ciągu 2 dni w temperaturze 30°C. Skład tej pożywki z soli mineralnych podaje tabela 2. Za pomocą tych mikroorganizmów na płytkach zaszczepia się pożywkę hodowli wstępnej o takim samym składzie i poddaje inkubacji w ciągu 2 dni w temperaturze 30°C.
Tę samą pożywkę z soli mineralnych z NA2SO4 zamiast/NH/2SO4 w ilości 100 ml zawierającą 0,2% wagowych gliceryny i 0,15% wagowych R, S-/+/-2,2-DMCPCA zaszczepia się w celu pobudzenia 5 ml tej hodowli wstępnej i poddaje inkubacji w temperaturze 30°C w ciągu 45 godzin. Następnie komórki oddziela się drogą odwirowania i roztwarza w 0,9% roztworze NaCl. Po ponownym zawieszeniu komórek w 800 ml 10 mmolowego buforu fosforanowego o wartości pH 7,0 nastawia się gęstość optyczną przy 650 nm na 1,3 i dodaje 2% wagowych R, S-/±/-2,2-DMCPCA. Po inkubacji w ciągu około 25 godzin w temperaturze 37°C R-/-/-2,2-DMCPCA ulega całkowitej przemianie w R-/-/-2,2-DMCPCS, co odpowiada optycznej czystości (ee) wynoszącej 100%o i analitycznie zmierzonej wydajności S-/+/-2,2-DMCPCA46,7%.
Przebieg reakcji siedzi się na podstawie uwalniania NH4 1 przez analizę cieczy znad osadu za pomocą chromatografii gazowej.
Po odwirowaniu komórek w cieczy znad osadu nastawia się wartość pH na 9,5 i produkt wyodrębnia drogą ekstrakcji octanem etylu.
Przykład!/. W sposób analogiczny do przykładu I wyodrębnia się mikroorganizm Bacterium sp. VHI:n. Czas trwania hodowli wstępnej wynosi w przypadku tego mikroorganizmu 4 dni, a okres pobudzania 3 dni, przy pozostałych warunkach według przykładu III. W przeciwieństwie do przykładu III biotrτnsformτcja za pomocą tego mikroorganizmu prowadzi się z 0,2% wagowych R, S-/±/-2,2DMCPCA, przy czym aktywność hydrolazy określa się na 0,13 g/litr/grdzinτ/OD650 nm.
168 885
Tabela 2
Skład pożywki hodowli wstępnej (Kulla i in., Arch. Microbiol. 135, str 1-7, 1983) g/litr wody destylowanej nH 7 0 __Γ ~ 1 ,
2,0 (NH4)2SO4
2,5 Na2HPO4 2H2O
1,0 KH2PO4
3,0 NaCl
0,4 MgCl2 6H2C
0,015 CaCl2 2H2O
0.0008 FeCl2 6H2O
0,0001 ZnSO4 7H2O
0,00009 MnCl2 4H2O
0,0003 H3BO3
0,0002 CoCl2· 6H2O
0,00001 CuCl2 2H2O
0,00002 NiCl> 6H2O
0,00003 Na2MoO4 2H2O
0,005 Na2EDTA 2H2O
0,002 FeSO4 7H2O
2 ; gliceryna
Przykład V. W sposób analogiczny do przykładu I wyodrębnia się Pseudomonas sp NSAK:42 (DSM-Nr 6433). Czas trwania hodowli wstępnej wynosi 2 dni, a okres pobudzania 18 godzin. Pozostałe warunki stosuje się takie, jak w przykładzie III z tym wyjątkiem, że pożywka indukcyjna zawiera 1% wagowy gliceryny zamiast 0,2% wagowych i dodatkowo zawiera 0,2% wagowych Universalpeptonu (Merck). Biotransformację prowadzi się przy użyciu 0,2% wagowych R, S-/±/-2,2-DMCPCA, przy czym aktywność hydrolazy określa się na 0,34 g/liif/g^oxbin-ia/C^I66so nm*
Przykład VI. Comamonas acidovofans TG 308 (DSM-Nr 6552) hoduje się w ciągu dni w temperaturze 30°C w 4 ml pożywki kompleksowej Nutrient Broth (Oxoid Ltd, Wielka Brytania). Za pomocą tych mikroorganizmów zaszczepia się pożywkę z soli mineralnych z tabeli i poddaje inkubacji w ciągu 2 dni w temperaturze 30°C. Następnie komórki oddziela się w sposób opisany w przykładzie III. W przeciwieństwie do przykładu III biotransformację prowadzi się w 10 mmolowym buforze HEPES o wartości pH 7,0 przy użyciu 0,5% wagowych R, S -/±/-2,2-DMCPCA, przy czym pozostałe warunki są takie jak w przykładzie III. Po inkubacji w ciągu 4,5 godzin w temperaturze 37°C R-/-/-2,2-DMCPCA ulega całkowitej reakcji do R-/-/-2,2DMCPCS, co odpowiada analitycznie zmierzonej wydajności S-//+/-DMCPCA 45,5% i czystości optycznej (ee) 99,0%.
Tabela 3 Skład pożywki wstępnej g/litr wody destylowanej wartość pH 7,0
2,0 K2HPO4
2,0 KH2PO4
2,0 MgSO4-7H2O
0,5 wyciągu drozdŻOwegO
2,0 Universalpeptonu (Merck)
2,0 NaCl
0,01 FeCl2 H2O
10 glutaminianu sodu
5 krotonamidu
168 885
Przykład bezkomórkowym
VII. Wytwarzanie S-/+/-2,2-DMCPCA za pomocą enzymów w układzie
Ό/”\ n aUu ταη i n A V v*
1/λ™ΑγΙμ Cnmam/rnac
A*1C ę uu » v^no za.j.v» τηίατ'
Oio rł o ^orłA^/·»» WV 5^OU/3V1 optycznej 210 przy 650 nm do 95 mi w 10 mmolowym buforze HEPES o wartości pH 7,0. Następnie komórki roztwarza się dwukrotnie w prasie Frencha pod ciśnieniem 1200 x 105 Pa. W celu uzyskania bezkomórkowego wyciągu enzymowego całość poddaje się wirowaniu przy 20000 rpm w ciągu 20 minut. W tym bezkomórkowym wyciągu enzymowym oznacza się następnie ilość protein metodą Bradforda na 39,3 mg protein/ml. Dla oznaczenia aktywności tego bezkomórkowego enzymu roztwarza się 20 μΐ · (około 0,8 mg protein) tych bezkomórkowych wyciągów enzymowych w 4 ml 10 mmolowego buforu fosforanowego o wartości pH 7,0, zawierającego 0,2% wagowych R, S-/±/-2.2-DMCPCA i poddaje inkubacji w temperaturze 30°C, przy czym w bezkomórkowym wyciągu 2,5 g R-/-/-2,2DMCPCA/godzina/g protein [3,64 μmole/minuta/g protein] ulega przemianie do odpowiedniego kwasu.
Przykład VIII. Wytwarzanie S-/+/-2,2-DMCPCA z unieruchomionymi komórkami Po indukcji według przykładu III oddziela się komórki Comamonas rcidovorans A: 18.
Komórki te poddaje się unieruchomieniu drogą traktowania polietylenoiminą/aldehydem glutarowym/odpowiednio do opisu patentowego CS 251 111. Unieruchomiony biokatalizator wykazuje aktywność 1,6 μmoli/minutα/g ciężaru substancji suchej. Ciężar substancji suchej biokatalizatora odpowiada 32% ciężaru substancji wilgotnej. Następnie biokatalizator o 55 g ciężaru substancji wilgotnej zawiesza się w 800 ml kwasu borowego (10 mM, pH 9,0) z 16 g R, S-/±/-2,2-DMCPCA. Po okresie inkubacji wynoszącym 68,8 godzin w temperaturze 37°C i przy prędkości mieszania 200 rpm R-/-/-2,2-DMCPCA ulega całkowitej przemianie w R-/-/-2,2-DMCPCS, co odpowiada optycznej czystości (ee) 98,2% i analitycznie zmierzonej wydajności S-/+/-2,2-DMCPCA 40%.
168 885
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims (6)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób 'wytwarzania S-/+/-2.2-dimetylocyklopropanokarboksamidu, znamienny tym, że w racemicznym R, S-/±/-2,2-dimetylocykłopropanokarboksamidzie R-/-/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamid poddaje się biotransformacji do kwasu R-/-/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksylowego i wydziela się optycznie czynny S-/+/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamid, przy czym biotransformację prowadzi się za pomocą mikroorganizmów gatunku Comamonas acidovorans A: 18 (DSM-Nr 6315) albo ich potomków i mutantów, albo za pomocą bezkomórkowych enzymów z tych mikroorganizmów lub za pomocą mikroorganizmów gatunku Bacterium sp. VTIT-TI (DSM-Nr 6316) albo ich potomków i mutantów, albo za pomocą bezkomórkowych enzymów z tych mikroorganizmów.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biotransformację prowadzi się w pożywce zawierającej racemiczny 2,2-dimetylocyklopropanokarboksamid w ilości 0,2-5% wagowych. '
  3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biotransformację prowadzi się przy wartości pH wynoszącej 6-11 iw temperaturze 15-55°C.
  4. 4. Sposób wytwarzania S-/+/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamidu, znamienny tym, że w racemicznym R, S-/±/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamidzie R-/-/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamid poddaje się biotransformacji do kwasu R-/-/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksylowego i wydziela się optycznie czynny S-/+/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamid, przy czym biotransformację prowadzi się za pomocą mikroorganizmów gatunku Comamonas acidovorans TG 308 (DSM -Nr 6552) albo ich potomków i mutantów, albo za pomocą bezkomórkowych enzymów z tych mikroorganizmów lub za pomocą mikroorganizmów gatunku Pseudomonas sp NSAK:42 (DSM-Nr 6433) albo ich potomków i mutantów, albo za pomocą bezkomórkowych enzymów z tych mikroorganizmów.
  5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym,że prowadzi się w pożywce zawierającej racemiczny 2,2-dimetylocyklopropanokarboksamid w ilości 0,2-5% wagowych.
  6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że biotransformację prowadzi się przy wartości pH wynoszącej 6-11 iw temperaturze 15-55°C.
PL92293716A 1991-03-06 1992-03-05 Sposób wytwarzania S-/+/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamidu PL PL PL PL PL168885B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH67891 1991-03-06
CH185491 1991-06-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL293716A1 PL293716A1 (en) 1992-12-28
PL168885B1 true PL168885B1 (pl) 1996-04-30

Family

ID=25685343

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL92293716A PL168885B1 (pl) 1991-03-06 1992-03-05 Sposób wytwarzania S-/+/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamidu PL PL PL PL

Country Status (17)

Country Link
US (2) US5273903A (pl)
EP (1) EP0502525B1 (pl)
JP (1) JP3249566B2 (pl)
AT (1) ATE139800T1 (pl)
CA (1) CA2062281C (pl)
CZ (1) CZ279306B6 (pl)
DE (1) DE59206633D1 (pl)
DK (1) DK0502525T3 (pl)
ES (1) ES2088512T3 (pl)
HU (1) HU214125B (pl)
IE (1) IE74179B1 (pl)
IL (1) IL101129A (pl)
MX (1) MX9200910A (pl)
PL (1) PL168885B1 (pl)
RO (1) RO113663B1 (pl)
RU (1) RU2096460C1 (pl)
SK (1) SK279053B6 (pl)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0524604B1 (de) * 1991-07-26 1998-10-14 Lonza A.G. Gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von S-(+)-2,2-Dimethylcyclopropancarboxamid mittels Mikroorganismen
KR100441137B1 (ko) * 2001-11-22 2004-07-21 동국제약 주식회사 키랄 2,2-디메틸시클로프로판카르복실의 유도체의 제조방법
KR100511534B1 (ko) * 2002-07-05 2005-08-31 임광민 아미드 화합물의 새로운 제조방법
DE10260456A1 (de) * 2002-12-18 2004-07-08 Ufz-Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle Gmbh Mutanten des Bakterienstammes Delftia acidovorans MC1 und deren Verwendung zur Produktion von hochreinen R-Enantiomeren von 2-Phenoxypropionsäure-Derivaten
CN100345974C (zh) * 2005-11-24 2007-10-31 浙江工业大学 S－(+)－2,2－二甲基环丙甲酰胺的微生物制备方法
KR100650797B1 (ko) * 2005-12-12 2006-11-27 (주)케미코월드 광학활성 사이클로프로판 카복사미드의 제조방법
KR100654923B1 (ko) 2005-12-15 2006-12-06 (주)씨엘에스랩 고순도의 광학활성아미드를 연속적으로 제조하는 방법
CN100547067C (zh) * 2007-08-10 2009-10-07 浙江工业大学 表皮短杆菌zjb-07021及其在制备(s)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺中的应用
CN111621541B (zh) * 2019-02-27 2025-10-31 广安摩珈生物科技有限公司 使用电渗析技术拆分光学异构体的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2511867A (en) * 1949-12-19 1950-06-20 Method fob separating enantiomers
DE48301T1 (de) * 1980-09-24 1983-01-20 Merck & Co., Inc., 07065 Rahway, N.J. 2-(cyclopropancarboxamido)-2-alkensaeuren, deren ester und salze und daraus bestehende bakterienhemmende zusammensetzungen mit einer verbindung des typs thienamycin.
EP0155779B1 (en) * 1984-02-28 1989-04-26 Sumitomo Chemical Company, Limited A method for the optical purification of an optically active 2,2-dimethylcyclopropanecarboxylic acid amide
EP0488999B1 (en) * 1986-04-16 1997-07-09 Sumitomo Chemical Company Limited A method for producing optically active cyclopropane carboxylic acid

Also Published As

Publication number Publication date
IE920669A1 (en) 1992-09-09
IL101129A (en) 1996-05-14
IE74179B1 (en) 1997-07-16
EP0502525A1 (de) 1992-09-09
US5273903A (en) 1993-12-28
CZ279306B6 (cs) 1995-04-12
CA2062281C (en) 2000-07-11
SK279053B6 (sk) 1998-06-03
DK0502525T3 (da) 1996-07-29
JP3249566B2 (ja) 2002-01-21
MX9200910A (es) 1994-03-31
CS66292A3 (en) 1992-09-16
US5360731A (en) 1994-11-01
EP0502525B1 (de) 1996-06-26
ES2088512T3 (es) 1996-08-16
IL101129A0 (en) 1992-11-15
CA2062281A1 (en) 1992-09-07
HU9200744D0 (en) 1992-05-28
HUT64587A (en) 1994-01-28
HU214125B (en) 1997-12-29
DE59206633D1 (de) 1996-08-01
RO113663B1 (ro) 1998-09-30
ATE139800T1 (de) 1996-07-15
PL293716A1 (en) 1992-12-28
RU2096460C1 (ru) 1997-11-20
JPH0576391A (ja) 1993-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4637982A (en) Process for biological preparation of amides
PL168885B1 (pl) Sposób wytwarzania S-/+/-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamidu PL PL PL PL
Nishida et al. Enzymatic production of L-tryptophan from DL-5-indolylmethylhydantoin by Flavobacterium sp.
US5916782A (en) Process for producing aspartase and process for producing L-aspartic acid
US5766893A (en) Biotechnological process for the preparation of cyclic s-alpha-imino carboxylic acids and r-alpha-imino carboxamides
Yoshida et al. Isolation and identification of a pyrogallol producing bacterium from soil
US3391059A (en) Process for producing l-aspartic acid
US4006057A (en) Method of producing L-cysteine and L-cystine
DE69738080T2 (de) Biokatalysatoren mit amin-acylase aktivität
JPH04304892A (ja) グリシンの生物学的製造法
JPH04365491A (ja) ４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造法
JP2698936B2 (ja) Ｒ（‐）―マンデル酸誘導体の製造法
Wu et al. Enzymatic production of Dp-hydroxyphenylglycine from DL-5-p-hydroxyphenylhydantoin by Sinorhizobium morelens S-5
US7592164B2 (en) Process for preparing unsaturated amides and carboxylic acids
JPS6143997B2 (pl)
CN1089807C (zh) 生产l－天冬氨酸的方法
Plachý et al. Production of L-aspartic acid from fumaric acid by Alcaligenes metalcaligenes CCEB 312
JP3437879B2 (ja) 細菌の培養法
JPH0574353B2 (pl)
JP2983695B2 (ja) ４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸の製造法
WO2001009365A1 (en) Process for the preparation of 2-cyano-5-hydroxypyrazine
SK172698A3 (en) Process for preparation of d-proline derivatives by means of micro-organisms
JPH09131196A (ja) 新規微生物及びその利用
JPS61257196A (ja) ２−オキソ−オキサゾリジン−４−カルボン酸のラセミ化法
JPH02100687A (ja) プロトカテキュ酸およびその塩の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20100305