JPH02100687A - プロトカテキュ酸およびその塩の製造方法 - Google Patents

プロトカテキュ酸およびその塩の製造方法

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JPH02100687A
JPH02100687A JP25254188A JP25254188A JPH02100687A JP H02100687 A JPH02100687 A JP H02100687A JP 25254188 A JP25254188 A JP 25254188A JP 25254188 A JP25254188 A JP 25254188A JP H02100687 A JPH02100687 A JP H02100687A
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JP
Japan
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acid
salt
protocatechuic acid
pseudomonas
phthalic acid
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JP25254188A
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English (en)
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Susumu Masukawa
増川 享
Miki Hori
堀 美樹
Minoru Matsubara
稔 松原
Norihiko Adachi
足立 典彦
Masao Kariya
刈屋 雅雄
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JSR Corp
Original Assignee
Japan Synthetic Rubber Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は、種々のポリマーの原料モノマーや食品用抗酸
化剤や医薬品類の原料として有用なプロトカテキュ酸お
よびその塩の製造方法に関する。
[従来の技術] プロトカテキュ酸は、種々のポリマーの原料モノマーや
食品用抗酸化剤や医薬品の原料として有用である。
従来、このプロトカテキュ酸の製造方法としては、バニ
リンのアルカリ融解方法、バニリン酸の脱メチル化方法
、m−クロル−p−ヒドロキシ安息香酸を水酸化カリウ
ムと共に加圧下で加熱する方法、カテコールを炭酸アン
モニウムと共に加熱する方法などの各種方法が知られて
いる。
[発明が解決すべき課題] しかしながら、従来のプロトカテキュ酸の製造方法は、
いずれも反応効率が充分ではないという問題があった。
[課題を解決するための手段] かかる実状において、本発明者らはプロトカテキュ酸お
よび/またはその塩を効率よくフタル酸および/または
その塩から製造する方法を開発すべく研究した結果、フ
タル酸および/またはその塩を炭素源として生育できる
シュードモナス属に属する菌体の変異株がフタル酸を分
解し、プロトカテキュ酸および/またはその塩を効率よ
く製造することを見出し本発明を完成した。
すなわち本発明は、プロトカテキュ酸および/またはそ
の塩の分解活性が消失もしくは低下しているシュードモ
ナス属に属する微生物を用いて、フタル酸および/また
はその塩からプロトカテキュ酸および/またはその塩を
製造することを特徴とするプロトカテキュ酸および/ま
たはその塩の製造方法を提供するものである。
なお、本発明において塩とは、ナトリウム塩、カリウム
塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などを示すものであ
る。
本発明に用いられる微生物はシュードモナス属に属し、
プロトカテキュ酸および/またはその塩(以下、これら
を「プロトカテキュ酸」と総称する)の分解活性が消失
もしくは低下しているものであり、例えばフタル酸およ
び/またはその塩(以下、これらを「フタル酸」と総称
する)を増殖のための炭素源として利用し得る能力を有
するシュードモナス属に属する微生物を親株として、プ
ロトカテキュ酸の分解活性が消失もしくは低下するよう
に変異せられたものが挙げられる。
ここで親株の例としては、例えばシュードモナスφアシ
トポランス(Pseudomonas acidovo
rana)、シュードモナス・プチダ(Pseudom
onas putida)、シュードモナス・テストス
テロニ(Pseudomonastestostero
ni) 、シュードモナス・セパシア(Pseudom
onas cepacia)などが挙げられ、これらの
うちではシュードモナス・テストステロニが好ましく、
最も好ましい親株の例として、シュードモナス・テスト
ステロニM4−1(微工研菌寄第10176号)が挙げ
られる。M4−1は本発明者らが新たに見出した菌株で
あり、フタル酸のほかに4.5−ジヒドロキシフタル酸
またはプロトカテキュ酸を炭素源として生育でき、また
フタル酸で培養した菌体は、4,5−ジヒドロキシフタ
ル酸またはプロトカテキュ酸をすみやかに代謝すること
ができる。
M4−1の菌学的性質を示すと次のとおりである。
a)形態的性質 (1)形、大きさ   桿菌CL5X1〜0,5×2μ
m (2)運動性 鞭    毛 (3)胞 子 (4)ダラム染色 b)培養的性質 (1)肉汁寒天平板 (2)肉汁寒天斜面 (3)肉汁液体 あり 極鞭毛 1本 なし 陰性 C) 生育良好、円形、金縁、 淡黄褐色 生育良好、糸状 生育良好、白濁、被膜形 成、沈渣あり 生育良好、液化せず アルカリ性 肉汁ゼラチン穿刺 リドマスミルク 生理的性質 脱窒反応  陰性 好塩性 なし メタノールの資化性   なし エタノールから酢酸の生産 ペプトン培地の生育   陽性 3−ケトラクトースの生産 ゼラチン加水分解能   なし 陰性 なし YMA培地   あり(白) 色素の生成   なし オキシダーゼ   陽性 カタラーゼ   陽性 リパーゼ   陽性 アルギニンジヒドロラーゼ プロトカテキュ酸の開裂 41℃での生育   陰性 pH3,6での生育   陰性 栄養要求性   なし 酸素に対する態度   好気的 資化性(+;陽性、−;陰性) p−ヒドロキシ安息香酸;+ ラクトース;− プロピオン酸;十 グルコース;− クエン酸;十 L−アラビノース;− D−フラクトース;− D−マンニトール;− 陰性 メタ開裂 シュクロース;− フタル酸;+ なお、以上の菌学的性質はバージイーズ・マニュアル・
オブ・システマチック・バクテリオロジー第1巻(Be
rgey’s Manual of Systemat
ic Bacteriology Vol、1)記載の
シュードモナス拳テストステロニの菌学的性質とよく一
致するものである。
本発明では、このような菌学的性質を有する菌株を親株
として変異誘導処理して得たプロトカテキュ酸の分解活
性が消失もしくは低下している変異株(以下、単に「特
定変異株」という)が用いられる。
親株の変異誘導処理は、例えば紫外線照射、X線照射、
γ線などの放射線照射、突然変異誘起剤による処理、ま
たはトランスポゾンによる処理を適用することができる
。ここで突然変異誘起剤としては、エチルメタンスルホ
ネート、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグア
ニジン、ジメチルサルフェート、2−アミノプリン、ア
クリフラビン、アクリジンオレンジ、ヒドラジン、4−
ニトロキノリン−N−オキシド、塩化マンガンなどが挙
げられる。
また放射線を照射する場合、例えば紫外線の場合、1〜
9mJ/cJ程度の量の紫外線を照射する。
また変異株の確認は、例えば変異処理を行った細胞を培
養し、形成されたコロニーについて変異の有無を検討す
る直接的な方法のほか、この方法を改良したレプリカ法
、さらにはペニシリンなどの抗生物質を使用する濃縮法
、特殊な基質を用いる自殺基質処理法ならびにこれらを
適宜組合せた方法などが挙げられる。
また、これらの変異株の中から特定変異株を見出す方法
としては、増殖菌体または休止菌体にフタル酸を適当な
条件下で接触させ、そのときの蓄積物を適当な分析手段
を用いて分析する方法を挙げることができる。ここで分
析手段としては、紫外線吸収スペクトルを測定する方法
、TLC,HPLCなどのクロマトグラフィーによる方
法、および蓄積物のフェノール性水酸基を検出する方法
が例示でき、特定変異株か否かの判定は、これらの分析
結果から総合的に判断される。
かくして得られる特定変異株の例として、親株としてM
4−1を用いた紫外線処理による変異株であるシュード
モナス・テストステロニM4−IA−13(微工研菌寄
第1031S号)が挙げられる。この特定変異株の増殖
菌体または休止菌体はフタル酸からプロトカテキュ酸を
製造し、蓄積させることができるものである。
このM4−IA−13の菌学的性質は、親株であるM4
−1のそれと極めて近似しているが、フタル酸の資化能
を失っている点で親株と相違する。
なお、本発明では増殖菌体または休止菌体がプロトカテ
キュ酸を製造し、蓄積することのできる特性を有する菌
株であれば任意に使用でき、シュードモナス属に属する
他の親株を用い、各種の変異誘導処理を行って得られる
変異株も同様に使用することができる。さらに、上記特
性を有する菌株であれば自然界から分離された菌体であ
ってもよい。
本発明ではこのような特定変異株を用い、液体培養法、
休止菌体法、固定化菌体法などによりフタル酸からプロ
トカテキュ酸を製造する。
液体培養法は、フタル酸の存在下に特定変異株を培養し
ながらプロトカテキュ酸を生成させる方法である。この
方法で用いられる培地には、炭素源として酢酸、コハク
酸、クエン酸などの有機酸、安息香酸、m−ヒドロキシ
安息香酸、p−ヒドロキシ安息香酸などの芳香族化合物
、グルコースなどの糖類が用いられ、窒素源としてアン
モニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、尿素などの有機窒素源などが用
いられ、無機塩類としてリン酸カリウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化カリウム、塩化第二鉄、塩化カルシウムなど
が用いられる。
フタル酸の培地への添加は、−括添加または逐次添加が
採用されるが、その合計添加量は、通常、培地の5重量
%以下である。また、逐次添加する場合にその添加周期
は、プロトカテキュ酸が十分生成し培地中に蓄積される
範囲内で適宜選定され、1回の添加量は、通常、培地の
0.01〜0.5重量%である。
また培養温度は、通常、25〜37℃、pHは5〜9で
あり、好気的条件下で培養が行われる。
休止菌体法は、予め培養しておいた特定変異株を用いて
、フタル酸をプロトカテキュ酸に変換させる方法である
この方法では、特定変異株の培養は液体培養法と同様に
して行うことができるが、培養時にフタル酸を添加しな
くてもよい。すなわち、特定変異株の培養後、特定変異
株は遠心分離または凝集法によって集められ、適当な緩
衝液、例えばリン酸緩衝液あるいはトリス(ヒドロキシ
メチル)アミノメタン緩衝液中に再懸濁される。再懸濁
された液中でのプロトカテキュ酸の産生反応(以下、単
に「産生反応」という)はフタル酸の添加により開始さ
れ、温度25〜37℃、pH5〜9の範囲で好気的に行
われる。なお、産生反応前に特定変異株を産生反応に用
いる緩衝液で集菌し、再懸濁を繰り返し、洗浄してから
用いても良い。
また固定化菌体法の場合、特定変異株の担体への固定化
方法としては、包括法、吸着法、マイクロカプセル法な
どいずれも適用することができる。
包括用担体としてはカラギーナンなどの多糖類、ポリア
クリルアミドなどの合成高分子があり、吸着用担体とし
てはDEAEセルロースなどがある。
固定化菌体法の場合の培養または産生反応の条件は、液
体培養法または休止菌体法の場合と同様である。
上記の各方法などによる培養または産生反応終了後、プ
ロトカテキュ酸は溶媒による抽出または晶析により、培
養液または産生反応液から回収される。なお抽出の際、
培養液または産生反応液は、好ましくはpH2以下に調
整される。
ここで、抽出の際に使用しうる溶媒としては、テトラヒ
ドロフラン、アセトン、ブタノール、酢酸エチル、ジエ
チルエーテル、メチルエチルケトンなどの極性溶媒が挙
げられる。この抽出液を濃縮乾固することにより、プロ
トカテキュ酸の粗結晶が得られる。この粗結晶は、さら
に適当な溶媒、例えば水、酢酸エチル、ジエチルエーテ
ル、トルエン、クロロホルム、ヘキサンなどにより再結
晶させて精製してもよい。
[実 施 例] 次に実施例を挙げて本発明の詳細な説明するが、本発明
はこれら実施例により何ら制限されるものではない。
参考例1 菌体の変異誘導処理と特定変異株の分離(1)下記組成
のpH7の培地(以下、「培地A」という)にフタル酸
ナトリウム10mMを添加した培地10m1にシュード
モナス・テストステロニM4−1を1白菌耳接種し、3
0℃で12時間振とう培養を行った。
NH4Cl          1.0  gKH2P
O42,Og MgSO4・7H200,5g KCl            0.5gFeCl3 
・6H200,01g CaCl2         0.1  gEDTA 
         O,1gCuSO4・5H205μ
g H3BO21μg MnC121μg 蒸留水    1N (2)工程(1)で得られた培養液0.1mlを培地A
10m1に添加し、30℃で6時間振とう培養を行った
(3)工程(2)の培養液の遠心分離によりM4−1を
集菌し、0.85重量%塩化ナトリウム水溶液で洗浄後
、菌体密度が2X109個/mlとなるように0.85
重量%塩化ナトリウム水溶液に懸濁した。
(4)上記懸濁液に紫外線ランプ(波長2537人)を
用いて3.0mJ/c♂の照射量の紫外線を照射した。
(5)紫外線を照射した懸濁液0.1mlを10m1の
ブイヨン液体培地に接種し、30℃で一夜振とう培養を
行った。
(6)工程(5)の培養液の遠心分離により放射線を照
射したM4−1を集菌し、0.85重量%塩化ナトリウ
ム水溶液で洗浄後、菌体密度が2×109個/mlにな
るようにフタル酸ナトリウム10mMを添加した培地A
に接種した。
(7)30°Cで1時間培養を行った後、ベンジルペニ
シリンカリウムを7 mg / mlの濃度になるよう
に添加し、さらに4時間培養を行った。
(8)工程(7)の培養液を培地Aで10000倍に希
釈し、直径90mmのブイヨン寒天平板に061ml塗
布し、30℃で一夜培養を行った。
(9)工程(8)の培養で生じたコロニーを、コハク酸
ナトリウム含有寒天平板およびフタル酸ナトリウム含有
寒天平板に移植して、30℃で2日間培養を行った後、
コハク酸ナトリウム寒天平板には生育し、フタル酸ナト
リウム寒天平板上には生育しないM4−1の変異株から
なるコロニー100個を拾い上げ、別々のブイヨンスラ
ントに移植した。
00)工程(9)でブイヨンスラントに移植されたM4
−1の変異株をブイヨンスラントから、フタル酸ナトリ
ウム1mMおよびコハク酸ナトリウム10mMを含む培
地Aに1白金耳接種し、30℃で24時間振どう培養を
行った。
(11)工程00)の培養中にM4−1の変異株から産
生された蓄積物を紫外線吸収スペクトル、薄層クロマト
グラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーにより分
析し、プロトカテキュ酸と性質が一致した蓄積物を与え
るM4−1の変異株を選別した。
以上のようにして得られた特定変異株の中から、最もプ
ロトカテキュ酸の生産能が高い特定変異株のひとつとし
て、シュードモナス・テストステロニM4−IA−13
が得られた。
実施例I M4−IA−13を1白金耳、ブイヨン液体培地50m
1で培養した培養液を、5mMのフタル酸ナトリウムを
含むブイヨン液体培地2f!、に添加し、30℃で20
時間振とう培養を行った。次いで遠心分離によりM4−
IA−13を集菌し、50mMトリス−酢酸緩衝液(p
H7,5)200mlで2回洗浄を行った後、20mM
のフタル酸ナトリウムを含む50mMトリス−酢酸緩衝
液12に再懸濁した。その後、回転振とうを行いながら
、30℃で24時間産生反応を行い、遠心分離によりM
4−IA−13を除去した。
得られた上澄液を48℃で回転蒸発法により50m1に
濃縮し、硫酸アンモニウムを飽和に達するまで加え、濃
塩酸でpH2に調整した。続いて酢酸エチル100m1
による抽出を5回行い、得られた抽出液を集め、40℃
で回転蒸発法により濃縮乾固し、プロトカテキュ酸の粗
結晶2.5gを得た。得られた粗結晶は水により再結晶
させて精製して、プロトカテキュ酸の精製結晶2gを得
た。
[発明の効果コ 本発明の方法によれば、フタル酸から効率良くプロトカ
テキュ酸を製造することができる。
特許出願人  日本合成ゴム株式会社

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)プロトカテキュ酸および/またはその塩の分解活
    性が消失もしくは低下しているシュードモナス属に属す
    る微生物を用いて、フタル酸および/またはその塩から
    プロトカテキュ酸および/またはその塩を製造すること
    を特徴とする、プロトカテキュ酸および/またはその塩
    の製造方法。
JP25254188A 1988-10-06 1988-10-06 プロトカテキュ酸およびその塩の製造方法 Pending JPH02100687A (ja)

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