JPH0714355B2 - Ｌ−カルニチンの調製方法 - Google Patents
Ｌ−カルニチンの調製方法Info
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- JPH0714355B2 JPH0714355B2 JP60501876A JP50187685A JPH0714355B2 JP H0714355 B2 JPH0714355 B2 JP H0714355B2 JP 60501876 A JP60501876 A JP 60501876A JP 50187685 A JP50187685 A JP 50187685A JP H0714355 B2 JPH0714355 B2 JP H0714355B2
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- carnitine
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- microorganism
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/001—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by metabolizing one of the enantiomers
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はＬ−カルニチンの調製方法に関する。
より詳しくは、本発明は発酵法によるＬ−カルニチンの
調製方法に関する。さらに詳しくは、本発明はDL−カル
ニチンの微生物学的分割方法に関する。
調製方法に関する。さらに詳しくは、本発明はDL−カル
ニチンの微生物学的分割方法に関する。
また、DL−カルニチンの分割に使用することができる新
規な微生物も開示される。
規な微生物も開示される。
背景技術 各種の微生物がＬ−カルニチンを単独炭素源として利用
する能力を持っていることは十分立証されていることで
ある。例えば、汚染された河床から分離された一種の細
菌（試験的にシュードモナス科に属するとして分類学的
に同定された）はDL−混合カルニチンからＬ−カルニチ
ンを使用してＤ−カルニチンを高光学的収率で生産する
ことが報告されている（G.フランケル、S.フリードマン
Vitam Horm.N.Y.1957 16,73）。続いて、シュードモ
ナスプチダ（Pseudmonasu putida）およびアシネトバク
ターカルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticu
s）の静止細胞（resting cells）によるＤ−カルニチン
およびＬ−カルニチンの物質代謝の研究が行なわれた。
DL−カルニチン上に生育したPs.プチダの細胞はＬ−カ
ルニチンのみを分解してグリシンベタインを化学量論的
に蓄積した（J.ミウラフラボニイ、S.エンゲラードFEMS
Microbiology Lett.18（1983）113）。A.カルコアセ
チカスによるカルニチンの物質代謝については若干の明
白な論争がある。ある報文はこの生物がＬ−カルニチン
の上にのみ成長してトリメチルアミンを生成すると報告
している（H.P.クレバーら Arch.Microbiol.112（197
7）201）。もし、培養混合物中にＬ−カルニチンの如き
付加的な炭素源が存在するならば、あるいはもしその細
菌がＬ−カルニチンまたはDL−カルニチンで予め培養さ
れたならば、Ｄ−カルニチンが代謝作用を受けるが、Ｄ
−カルニチンが単独炭素源となる場合には成長は観察さ
れなかった。他方、J.ミウラフラボニイとS.エンゲラー
ドはA.カルコアセチカスは炭素源としてカルニチンの
Ｄ、Ｌ異性体のどちらもその生育のために利用し、化学
量論的にトリメチルアミンを生成すると報告している。
しかし、これまでのところ、DL−カルニチンを含有する
培養混合液中で非天然型のカルニチン、すなわち、Ｄ−
カルニチンを優先的に分解して、その培地中に所望の天
然型のＬ−カルニチンを蓄積する微生物についての報告
は全くない。
する能力を持っていることは十分立証されていることで
ある。例えば、汚染された河床から分離された一種の細
菌（試験的にシュードモナス科に属するとして分類学的
に同定された）はDL−混合カルニチンからＬ−カルニチ
ンを使用してＤ−カルニチンを高光学的収率で生産する
ことが報告されている（G.フランケル、S.フリードマン
Vitam Horm.N.Y.1957 16,73）。続いて、シュードモ
ナスプチダ（Pseudmonasu putida）およびアシネトバク
ターカルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticu
s）の静止細胞（resting cells）によるＤ−カルニチン
およびＬ−カルニチンの物質代謝の研究が行なわれた。
DL−カルニチン上に生育したPs.プチダの細胞はＬ−カ
ルニチンのみを分解してグリシンベタインを化学量論的
に蓄積した（J.ミウラフラボニイ、S.エンゲラードFEMS
Microbiology Lett.18（1983）113）。A.カルコアセ
チカスによるカルニチンの物質代謝については若干の明
白な論争がある。ある報文はこの生物がＬ−カルニチン
の上にのみ成長してトリメチルアミンを生成すると報告
している（H.P.クレバーら Arch.Microbiol.112（197
7）201）。もし、培養混合物中にＬ−カルニチンの如き
付加的な炭素源が存在するならば、あるいはもしその細
菌がＬ−カルニチンまたはDL−カルニチンで予め培養さ
れたならば、Ｄ−カルニチンが代謝作用を受けるが、Ｄ
−カルニチンが単独炭素源となる場合には成長は観察さ
れなかった。他方、J.ミウラフラボニイとS.エンゲラー
ドはA.カルコアセチカスは炭素源としてカルニチンの
Ｄ、Ｌ異性体のどちらもその生育のために利用し、化学
量論的にトリメチルアミンを生成すると報告している。
しかし、これまでのところ、DL−カルニチンを含有する
培養混合液中で非天然型のカルニチン、すなわち、Ｄ−
カルニチンを優先的に分解して、その培地中に所望の天
然型のＬ−カルニチンを蓄積する微生物についての報告
は全くない。
また興味を引くものとしては、オギノらは米国特許第4,
209,507において、それを適当な培地中で、培養した培
養物からある種の抗腫瘍活性を示す物質を得ることがで
きる変種系アシネトバクターカルコアセチカス変種ミク
ロフォーミスSC−1714（ATCC−31299）を報告してい
る。
209,507において、それを適当な培地中で、培養した培
養物からある種の抗腫瘍活性を示す物質を得ることがで
きる変種系アシネトバクターカルコアセチカス変種ミク
ロフォーミスSC−1714（ATCC−31299）を報告してい
る。
出願人は、オギノらの特許の変種は本発明の方法におい
てＬ−カルニチンを生産する場合に効果的でないことを
見い出した。
てＬ−カルニチンを生産する場合に効果的でないことを
見い出した。
発明の開示 ここに、DL−カルニチンラセミ混合物の分割が、その中
に含まれる非天然型のＤ−カルニチンを優先的に代謝
し、それにより所望の天然型のＬ−カルニチンを容易に
取り出すことができるように反応培地中に蓄積すること
ができる独特の能力により特徴づけられた微生物産出酵
素の発酵作用に付することにより可能であることが発見
された。この方法は図式的には次のように表わされる。
に含まれる非天然型のＤ−カルニチンを優先的に代謝
し、それにより所望の天然型のＬ−カルニチンを容易に
取り出すことができるように反応培地中に蓄積すること
ができる独特の能力により特徴づけられた微生物産出酵
素の発酵作用に付することにより可能であることが発見
された。この方法は図式的には次のように表わされる。
上に述べたような独特の特性を持つA.カルコアセチカス
の野生菌株は下水から単離された。既知のカルニチンを
代謝する微生物菌株はＤ−およびＬ−カルニチンを同速
度で代謝するから、DL−カルニチンを分割する機能を持
っていないが、ATCC39648という識別番号を持つこの野
生菌株は液体培地または固形培地中でＤ−カルニチンを
Ｌ−カルニチンよりも速い速度で代謝するという能力に
より特徴づけられる。従って、この菌種は本発明の工程
用としての微生物規準に適合するものであり、DL−カル
ニチンを分割して所望の天然型のカルニチン、すなわち
Ｌ−カルニチンの回収を可能にするという独特の能力を
有している。
の野生菌株は下水から単離された。既知のカルニチンを
代謝する微生物菌株はＤ−およびＬ−カルニチンを同速
度で代謝するから、DL−カルニチンを分割する機能を持
っていないが、ATCC39648という識別番号を持つこの野
生菌株は液体培地または固形培地中でＤ−カルニチンを
Ｌ−カルニチンよりも速い速度で代謝するという能力に
より特徴づけられる。従って、この菌種は本発明の工程
用としての微生物規準に適合するものであり、DL−カル
ニチンを分割して所望の天然型のカルニチン、すなわち
Ｌ−カルニチンの回収を可能にするという独特の能力を
有している。
上述した野生菌株に加えて、その菌の突然変異株ATCC39
647が作り出された。この変異株は発酵作用によるDL−
カルニチンの分割に付した時にその反応液中に野生菌株
の場合よりも多量のＬ−カルニチンを蓄積する能力を有
していることで野生菌株よりも優れている。
647が作り出された。この変異株は発酵作用によるDL−
カルニチンの分割に付した時にその反応液中に野生菌株
の場合よりも多量のＬ−カルニチンを蓄積する能力を有
していることで野生菌株よりも優れている。
突然変異株ATCC39647はA.カルコアセチカスATCC39648を
DL−カルニチン含有の適当な培地上で成長させ、ニトロ
ソグアニジン（NTG）突然変異化法（mutagenisis）処理
することにより得られる。この突然変異株は、次いで、
単独炭素源としてＤ−カルニチンまたはＬ−カルニチン
を含有する寒天プレート上で選別される。目的の突然変
異株A.カルコアセチカスATCC39647は単独炭素源として
Ｌ−カルニチンを含有する媒体上で僅かしか成長しない
が、単独炭素源としてＤ−カルニチンを含有するプレー
ト上では急速に成長する。この選別はレプリカ平板法
（D.F.スプーナー、G.サイケスMethods in Microbiolog
y Vol.7B p.244 1972）により行なわれた。本発明方法
に好適な突然変異株の生産に上記以外の突然変異誘導法
が十分利用できることは当業者には明白であろう。すな
わち、突然変異誘導用薬品として上記ニトロソグアニジ
ンの他に、例えば、亜硝酸ナトリウム、エチレンイミ
ン、８−アザグアニジン、Ｎ−メチルＮ′−ニトロソグ
アニジン、ナイトロ ジエンマスタードなどの薬品を選
択使用することができよう。その外、紫外線およびＸ
線、ガンマ線、電子ビームなどを用いるイオン化法また
は高エネルギー照射法などの物理的突然変異誘導法も適
用できよう。また、最近の分子生物学技術の適切なも
の、すなわち、形質導入（transduction）、形質転換
（transformation）、接合（conjugation）、細胞融
合、DNA組換え技術なども新しい微生物菌株を作る突然
変異誘導法として用いることができよう。
DL−カルニチン含有の適当な培地上で成長させ、ニトロ
ソグアニジン（NTG）突然変異化法（mutagenisis）処理
することにより得られる。この突然変異株は、次いで、
単独炭素源としてＤ−カルニチンまたはＬ−カルニチン
を含有する寒天プレート上で選別される。目的の突然変
異株A.カルコアセチカスATCC39647は単独炭素源として
Ｌ−カルニチンを含有する媒体上で僅かしか成長しない
が、単独炭素源としてＤ−カルニチンを含有するプレー
ト上では急速に成長する。この選別はレプリカ平板法
（D.F.スプーナー、G.サイケスMethods in Microbiolog
y Vol.7B p.244 1972）により行なわれた。本発明方法
に好適な突然変異株の生産に上記以外の突然変異誘導法
が十分利用できることは当業者には明白であろう。すな
わち、突然変異誘導用薬品として上記ニトロソグアニジ
ンの他に、例えば、亜硝酸ナトリウム、エチレンイミ
ン、８−アザグアニジン、Ｎ−メチルＮ′−ニトロソグ
アニジン、ナイトロ ジエンマスタードなどの薬品を選
択使用することができよう。その外、紫外線およびＸ
線、ガンマ線、電子ビームなどを用いるイオン化法また
は高エネルギー照射法などの物理的突然変異誘導法も適
用できよう。また、最近の分子生物学技術の適切なも
の、すなわち、形質導入（transduction）、形質転換
（transformation）、接合（conjugation）、細胞融
合、DNA組換え技術なども新しい微生物菌株を作る突然
変異誘導法として用いることができよう。
発明を実施するための最良の形態 本発明における好ましい方法は識別番号としてA.カルコ
アセチカスATCC39647を有する微生物を水性栄養化培地
中で単独炭素源としてDL−カルニチンを含有するミネラ
ル塩培地中の好気条件下で培養することよりなる。別法
として、この微生物を栄養化培地上で成長させた後、DL
−カルニチンを加えて培養することもできる。
アセチカスATCC39647を有する微生物を水性栄養化培地
中で単独炭素源としてDL−カルニチンを含有するミネラ
ル塩培地中の好気条件下で培養することよりなる。別法
として、この微生物を栄養化培地上で成長させた後、DL
−カルニチンを加えて培養することもできる。
DL−カルニチンの好ましい濃度（塩化水素塩として）
は、培地中のDL−カルニチンのアンモニアの濃度比に応
じて約0.1から約100g/の範囲にある。DL−カルニチン
塩化物の濃度が増すと、Ｄ−異性体の最適代謝速度を維
持するため、より多くのアンモニウムイオンが必要にな
ることが理解されるであろう。また、DL−カルニンチン
およびDL−カルニチン塩化物という二つの用語は本発明
において、特に指定しない限り、互換性に用いられるか
ら、本発明の明細書および請求の範囲項目中において互
換的に使用されていると理解すべきである。また、同様
な互換性はＤ−カルニチンまたはＬ−カルニチンそれぞ
れとその塩化物の間にも適用される。
は、培地中のDL−カルニチンのアンモニアの濃度比に応
じて約0.1から約100g/の範囲にある。DL−カルニチン
塩化物の濃度が増すと、Ｄ−異性体の最適代謝速度を維
持するため、より多くのアンモニウムイオンが必要にな
ることが理解されるであろう。また、DL−カルニンチン
およびDL−カルニチン塩化物という二つの用語は本発明
において、特に指定しない限り、互換性に用いられるか
ら、本発明の明細書および請求の範囲項目中において互
換的に使用されていると理解すべきである。また、同様
な互換性はＤ−カルニチンまたはＬ−カルニチンそれぞ
れとその塩化物の間にも適用される。
培養時間は24時間から５日間またはそれ以上の範囲にあ
る。温度は通常25℃から37℃である。微生物の成長を促
進しプロセスの効率を向上させるため、内容物は滅菌空
気による適切な通気および撹拌をうける。
る。温度は通常25℃から37℃である。微生物の成長を促
進しプロセスの効率を向上させるため、内容物は滅菌空
気による適切な通気および撹拌をうける。
発酵工程完了後、所望のＬ−カルニチンは当業者周知の
方法により取り出される。例えば、発酵液と細胞の分別
は通常の方法、すなわち濾過または遠心分離により行わ
れ、その後発酵液は減圧蒸留により乾固される。所望の
Ｌ−カルニチンを含有する残留固型物は無水エタノール
により抽出され、エタノール抽出物は減圧蒸発乾固さ
れ、その残留物を6NHClで処理することによりＬ−カル
ニチンはその塩化水素塩に転換される。この水溶液を蒸
発乾固した後、Ｌ−カルニチン塩化物が無水エタノール
−アセトン混液中で結晶分離される。これに代る方法と
して、Ｌ−カルニチン内塩はダウエックス（Dowex）−
１−OHイオン交換カラム上でエタノール抽出物の残留物
をクロマトグラフィーすることによっても得ることがで
きる（F.ストラック、I.ローレンツ、Z.Physiol.Chemie
318,1960,129）。
方法により取り出される。例えば、発酵液と細胞の分別
は通常の方法、すなわち濾過または遠心分離により行わ
れ、その後発酵液は減圧蒸留により乾固される。所望の
Ｌ−カルニチンを含有する残留固型物は無水エタノール
により抽出され、エタノール抽出物は減圧蒸発乾固さ
れ、その残留物を6NHClで処理することによりＬ−カル
ニチンはその塩化水素塩に転換される。この水溶液を蒸
発乾固した後、Ｌ−カルニチン塩化物が無水エタノール
−アセトン混液中で結晶分離される。これに代る方法と
して、Ｌ−カルニチン内塩はダウエックス（Dowex）−
１−OHイオン交換カラム上でエタノール抽出物の残留物
をクロマトグラフィーすることによっても得ることがで
きる（F.ストラック、I.ローレンツ、Z.Physiol.Chemie
318,1960,129）。
もし所望ならば、この方法を連続的な処理法として実施
できるように微生物細胞を固定化する（S.福井、A.田
中、Ann.Rev.of Microbiol.1982,Vol.36、p.145）こと
も考えられよう。また立体選択性を高めるため、生育培
地を修正するか、もしくはさらに突然変異株を突然変異
誘導処理しうることも明白であろう。
できるように微生物細胞を固定化する（S.福井、A.田
中、Ann.Rev.of Microbiol.1982,Vol.36、p.145）こと
も考えられよう。また立体選択性を高めるため、生育培
地を修正するか、もしくはさらに突然変異株を突然変異
誘導処理しうることも明白であろう。
〔実施例〕 下記の実施例は本発明の内容を明らかにするためのみの
ものであり、本発明を限定するものと解すべきではな
い。特に指定しない限り、パーセントは重量パーセン
ト、溶剤の混合比は容積比である。分離されたＬ−カル
ニチンは陽子磁気共鳴スペクトル、融点、薄層クロマト
グラフおよび旋光性により特定した。
ものであり、本発明を限定するものと解すべきではな
い。特に指定しない限り、パーセントは重量パーセン
ト、溶剤の混合比は容積比である。分離されたＬ−カル
ニチンは陽子磁気共鳴スペクトル、融点、薄層クロマト
グラフおよび旋光性により特定した。
参考例１ アシネトバクターカルコアセチカス野生株（df−２）AT
CC39648の単離 A.カルコアセチカスATCC39648は、下記の操作により、
スキムタンクより採取した下水試料から選択培地を用い
単離された。
CC39648の単離 A.カルコアセチカスATCC39648は、下記の操作により、
スキムタンクより採取した下水試料から選択培地を用い
単離された。
下水スキムタンク（ナインスプリングス下水処理プラン
ト、マジソン、ウィスコンシン州）から油状（qreasy）
表面水10mlを捕集し、その1mlを修正ジョンソン培地
（培地Ａ）50mlを含有する250ml容エルレンマイヤーフ
ラスコに加えた。
ト、マジソン、ウィスコンシン州）から油状（qreasy）
表面水10mlを捕集し、その1mlを修正ジョンソン培地
（培地Ａ）50mlを含有する250ml容エルレンマイヤーフ
ラスコに加えた。
DL−カルニチンHCl（シグマ）（10g/）を加え、121
℃、20分間の滅菌処理前に4N NaOHを用いてpHを6.8に
調整した。接種フラスコは回転振とう機を用いて培養し
た（250rpm、２インチストローク、27℃）。16時間後、
濁ったスープ状液（turbid broth）1mlを同じ培地含有
の別のフラスコに移し、再び回転振とう機を用いて16時
間培養を続けた。この操作を３回繰返した後、濁ったス
ープ状液をpH7.4のM/15リン酸塩緩衝液を用いて順次希
釈した。各希釈液のアリコート量（0.1ml）を修正ジョ
ンソン培地Ａ中に１％のDL−カルニチン塩化物と２％の
寒天を含有したペトリプレートの寒天表面上に均一に拡
げた。30〜300コロニーを有するプレートから種々のタ
イプのコロニーを選び出し、１％DL−カルニチン塩化物
修正ジョンソン培地寒天上に筋つけ接種し、その純度を
チェックした。純化単離された菌は0.5％のＤ−カルニ
チンまたはＬ−カルニチンのどちらかを含有する修正ジ
ョンソン培地上で単独炭素源としてＤ−カルニチンを利
用するかＬ−カルニチンを利用するかの能力試験に供さ
れた。単離体「df−２」はＬ−カルニチンよりもＤ−カ
ルニチン上でかなり急速に成長することが観察された。
かくして、この野生菌株が下記の突然変異誘導法研究用
に選ばれた。
℃、20分間の滅菌処理前に4N NaOHを用いてpHを6.8に
調整した。接種フラスコは回転振とう機を用いて培養し
た（250rpm、２インチストローク、27℃）。16時間後、
濁ったスープ状液（turbid broth）1mlを同じ培地含有
の別のフラスコに移し、再び回転振とう機を用いて16時
間培養を続けた。この操作を３回繰返した後、濁ったス
ープ状液をpH7.4のM/15リン酸塩緩衝液を用いて順次希
釈した。各希釈液のアリコート量（0.1ml）を修正ジョ
ンソン培地Ａ中に１％のDL−カルニチン塩化物と２％の
寒天を含有したペトリプレートの寒天表面上に均一に拡
げた。30〜300コロニーを有するプレートから種々のタ
イプのコロニーを選び出し、１％DL−カルニチン塩化物
修正ジョンソン培地寒天上に筋つけ接種し、その純度を
チェックした。純化単離された菌は0.5％のＤ−カルニ
チンまたはＬ−カルニチンのどちらかを含有する修正ジ
ョンソン培地上で単独炭素源としてＤ−カルニチンを利
用するかＬ−カルニチンを利用するかの能力試験に供さ
れた。単離体「df−２」はＬ−カルニチンよりもＤ−カ
ルニチン上でかなり急速に成長することが観察された。
かくして、この野生菌株が下記の突然変異誘導法研究用
に選ばれた。
参考例２ A.カルコアセチカス野生株「df−２」ATCC39648からの
A.カルコアセチカス突然変異株ATCC39647の調製 ａ）ニトロソグアニジン突然変異誘導法 アシネトバクターカルコアセチカスと識別（大学病院ク
リニカル微生物研究所−University Hospital Clinical
Microbiology Laboratory、マジソン、ウイスコンシン
州）された野生菌株「df−２」は１％DL−カルニチン塩
化物修正ジョンソン寒天培地スラント上で保持し、４℃
で貯蔵した。このスラントから１％DLカルニチン塩化物
修正ジョンソン培地50mlを入れた250ml容エルレンマイ
ヤーフラスコへの接種を行い、回転振とう機上で16時間
の培養を行った（250rpm、２インチストローク、27
℃）。この１夜培養成長物へＮ−エチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（アルドリッチ）（NTG）を
最終濃度として300μg/培地1mlになるよう添加した。フ
ラスコを回転振とう機上にもどし、正確に30分間培養を
行った。NTG300μg/培地1ml添加30分処理により生存細
胞の約99.9％が死滅することは事前に確認されていた。
NTG30分間処理後細胞は遠心分離（10,000rpm、15分間）
された。ペレット状になった細胞を１％DL−カルニチン
塩化物修正ジョンソン培地5ml中に再度懸濁させ、その
懸濁液2mlを１％DL−カルニチン塩化物修正ジョンソン
培地50mlを入れた250ml容エルレンマイヤーフラスコに
接種するのに用いた。このフラスコを回転振とう機上
（200rpm、27℃）で16時間培養した後、液の濁度をギル
フォード（Gilford）紫外可視分光々度計（モデル240）
の600nm吸光度モニターにより測定した。このデータに
より接種および突然変異種選定に使用する希釈率計算が
可能となった。
A.カルコアセチカス突然変異株ATCC39647の調製 ａ）ニトロソグアニジン突然変異誘導法 アシネトバクターカルコアセチカスと識別（大学病院ク
リニカル微生物研究所−University Hospital Clinical
Microbiology Laboratory、マジソン、ウイスコンシン
州）された野生菌株「df−２」は１％DL−カルニチン塩
化物修正ジョンソン寒天培地スラント上で保持し、４℃
で貯蔵した。このスラントから１％DLカルニチン塩化物
修正ジョンソン培地50mlを入れた250ml容エルレンマイ
ヤーフラスコへの接種を行い、回転振とう機上で16時間
の培養を行った（250rpm、２インチストローク、27
℃）。この１夜培養成長物へＮ−エチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（アルドリッチ）（NTG）を
最終濃度として300μg/培地1mlになるよう添加した。フ
ラスコを回転振とう機上にもどし、正確に30分間培養を
行った。NTG300μg/培地1ml添加30分処理により生存細
胞の約99.9％が死滅することは事前に確認されていた。
NTG30分間処理後細胞は遠心分離（10,000rpm、15分間）
された。ペレット状になった細胞を１％DL−カルニチン
塩化物修正ジョンソン培地5ml中に再度懸濁させ、その
懸濁液2mlを１％DL−カルニチン塩化物修正ジョンソン
培地50mlを入れた250ml容エルレンマイヤーフラスコに
接種するのに用いた。このフラスコを回転振とう機上
（200rpm、27℃）で16時間培養した後、液の濁度をギル
フォード（Gilford）紫外可視分光々度計（モデル240）
の600nm吸光度モニターにより測定した。このデータに
より接種および突然変異種選定に使用する希釈率計算が
可能となった。
ｂ） A.カルコアセチカス突然変異株ATCC39467の選
択、単離 上述した突然変異処理細胞はpH7.4のM/15リン酸塩緩衝
液を用いて順次希釈し、それを１％DL−カルニチン塩化
物修正ジョンソン培地寒天上に拡げた。28℃で約４日間
培養後、得られたコロニーを0.5％のＬ−カルニチンま
たは0.5％のＤ−カルニチンを含有した修正ジョンソン
培地寒天上で複製した。
択、単離 上述した突然変異処理細胞はpH7.4のM/15リン酸塩緩衝
液を用いて順次希釈し、それを１％DL−カルニチン塩化
物修正ジョンソン培地寒天上に拡げた。28℃で約４日間
培養後、得られたコロニーを0.5％のＬ−カルニチンま
たは0.5％のＤ−カルニチンを含有した修正ジョンソン
培地寒天上で複製した。
Ｄ−カルニチンプレート上ではよく成長するが、Ｌ−カ
ルニチンプレート上で殆ど成長しなかったコロニーは0.
5％Ｄ−カルニチン修正ジョンソン培地（Ａ培地）寒天
プレートに筋つけ接種することにより純化した。28℃で
の成長を行わせた後、寒天上の個々のコロニーをスラン
ト上に採取し、振とうフラスコ中で評価した。
ルニチンプレート上で殆ど成長しなかったコロニーは0.
5％Ｄ−カルニチン修正ジョンソン培地（Ａ培地）寒天
プレートに筋つけ接種することにより純化した。28℃で
の成長を行わせた後、寒天上の個々のコロニーをスラン
ト上に採取し、振とうフラスコ中で評価した。
Ｃ）振とうフラスコ評価 １％DL−カルニチン塩化物修正ジョンソン培地A50mlを
入れた250ml容フラスコに寒天スラントから採取した数
環の細胞群を接種した。回転振とう機上で24時間処理
後、その濁ったスープ状液50mlを同じ培地液500ml含有
の別の２容エルレンマイヤーフラスコへの接種液とし
て使用した。回転振とう機（250rom、２インチストロー
ク）上で27℃、44時間培養後、フラスコ内容物100mlを
減圧蒸発により乾固し、残留物を無水エタノールで抽出
した。このエタノール抽出液を再び減圧蒸発により乾固
し、その残留物を6NHCl10mlに溶解してカルニチンをカ
ルニチン塩化物に変換した。その水溶液試料は減圧下で
乾固し、残留するＬ−カルニチン塩化物を無水エタノー
ル−アセトン溶媒中で結晶化した。その製品の高度な負
の旋光（▲［α］25 D▼−23.07℃（Ｃ、3.5H2O））によ
りA.カルコアセチカス野生株ATCC39648から製作された
新規な突然変異株によりＤ−カルニチンが選択的に分解
されたことが確認された。
入れた250ml容フラスコに寒天スラントから採取した数
環の細胞群を接種した。回転振とう機上で24時間処理
後、その濁ったスープ状液50mlを同じ培地液500ml含有
の別の２容エルレンマイヤーフラスコへの接種液とし
て使用した。回転振とう機（250rom、２インチストロー
ク）上で27℃、44時間培養後、フラスコ内容物100mlを
減圧蒸発により乾固し、残留物を無水エタノールで抽出
した。このエタノール抽出液を再び減圧蒸発により乾固
し、その残留物を6NHCl10mlに溶解してカルニチンをカ
ルニチン塩化物に変換した。その水溶液試料は減圧下で
乾固し、残留するＬ−カルニチン塩化物を無水エタノー
ル−アセトン溶媒中で結晶化した。その製品の高度な負
の旋光（▲［α］25 D▼−23.07℃（Ｃ、3.5H2O））によ
りA.カルコアセチカス野生株ATCC39648から製作された
新規な突然変異株によりＤ−カルニチンが選択的に分解
されたことが確認された。
ATCC39647、ATCC39648として識別されたアシネトバクタ
ーカルコアセチカスおよびその菌株は以下に述べる特性
を有している。
ーカルコアセチカスおよびその菌株は以下に述べる特性
を有している。
形態学的性質 培地−ディフコ栄養化寒天（ディフコ研究所、デトロイ
ト、ミシガン州） 細胞の形状および大きさ−直径１〜1.6μｍ、長さ1.5〜
2.2μｍの桿状。
ト、ミシガン州） 細胞の形状および大きさ−直径１〜1.6μｍ、長さ1.5〜
2.2μｍの桿状。
成長静止期に達すると球状（球状桿）になる。
しばしば対になったり、種々の長さの鎖状となる。
鞭毛なし。
胞子なし。
グラム陰性。
抗酸性なし。
培養成長条件 培地−ディフコ栄養化寒天（ディフコ研究所、デトロイ
ト、ミシガン州） コロニーは比較的大きく（24時間で２〜3mm）、不透明
で、着色していない。
ト、ミシガン州） コロニーは比較的大きく（24時間で２〜3mm）、不透明
で、着色していない。
例えばエタノール、酢酸塩、乳酸塩、ピルピン酸塩、リ
ンゴ酸塩またはアルファケトグルタル酸塩などの単独炭
素エネルギー源を含有する簡単なミネラル塩培地中で成
長可能である。
ンゴ酸塩またはアルファケトグルタル酸塩などの単独炭
素エネルギー源を含有する簡単なミネラル塩培地中で成
長可能である。
アンモニウム塩を窒素源として使用する。
ゼラチン培地中でゼラチンを液化せず、成長は培地の表
面から3mmの深さまでに限定される。
面から3mmの深さまでに限定される。
リトマスミルク中でアルカリ反応を示し、凝集、液化を
生じないが、成長は非常に緩慢。
生じないが、成長は非常に緩慢。
生理学的性質 硝酸塩還元−陰性。
脱窒反応−陰性。
MRテスト−陰性。
インドール生産−陰性。
VPテスト−陰性。
硫化水素生産−極々弱い。
でんぷん加水分解−陰性。
クエン酸塩消費−陽性。
アンモニウム塩使用可能。
色素生産−自己分解で２〜３日後に培地中へ溶出する黄
色の細胞内水溶姓色素を有する。
色の細胞内水溶姓色素を有する。
ウエアーゼ−陽性。
オキシダーゼ−陽性。
カタラーゼ陽性 成長条件−pH5〜8.5。
温度５゜〜35℃ どんな培地中でも嫌気的では成長しないであろう。
その他の性質 エチルアルコールを酸化する。
塩化ナトリウム許容限は高い（２〜３％NaCl）。
33℃で成長可能。
フェニルアラニンを脱アミノ化しない。
リシンを脱カルボキシル化しない。
オルニチンを脱カルボキシル化しない。
寄託番号ATCC39647およびATCC39648として識別される菌
株はアメリカンタイプチュアコレクション（the Americ
an Type Culture Collection）（12301 パークローン
ドライブ、ロックビル、メリーランド州 20852−177
6）に1984年４月２日に寄託された。
株はアメリカンタイプチュアコレクション（the Americ
an Type Culture Collection）（12301 パークローン
ドライブ、ロックビル、メリーランド州 20852−177
6）に1984年４月２日に寄託された。
実施例１ A.カルコアセチカスATCC39648によるＤ−カルニチンの
優先的利用 一週間培養したA.カルコアセチカスATCC39648スラント
から表面成長部を採取し、塩水（0.85％）5ml中に懸濁
させた。この懸濁液2mlを１％DL−カルニチン塩化物修
正ジョンソン培地A50mlを入れた250ml容のエルレンマイ
ヤーフラスコの接種に使用した（ｆ−１段階）。このフ
ラスコは回転振とう機（250rpm/min 2インチ径）上25℃
で24時間培養した後その容積10％相当分を同じ培地500m
lを入れた２容エルレンマイヤーフラスコに移した
（Ｆ−２段階）。これを回転振とう機上で12時間培養し
た後その100mlをとり出し、遠心分離し、分離液を減圧
蒸発により乾固した。残留物を熱エタノールで抽出し、
抽出液を減圧下で乾固した。その残留物を6NHCl10ml中
に溶解しこの液を濃縮乾固した。この残留物の無水エタ
ノール・アセトン溶液からの結晶化により光学対掌体過
剰値（enantiomeric excess）（ee）0.51を示すカルニ
チン塩化物（216mg、収率43％）（▲〔α〕25 D▼−12.0
゜）（Ｃ、7.2H2Oの試料を与えた。
優先的利用 一週間培養したA.カルコアセチカスATCC39648スラント
から表面成長部を採取し、塩水（0.85％）5ml中に懸濁
させた。この懸濁液2mlを１％DL−カルニチン塩化物修
正ジョンソン培地A50mlを入れた250ml容のエルレンマイ
ヤーフラスコの接種に使用した（ｆ−１段階）。このフ
ラスコは回転振とう機（250rpm/min 2インチ径）上25℃
で24時間培養した後その容積10％相当分を同じ培地500m
lを入れた２容エルレンマイヤーフラスコに移した
（Ｆ−２段階）。これを回転振とう機上で12時間培養し
た後その100mlをとり出し、遠心分離し、分離液を減圧
蒸発により乾固した。残留物を熱エタノールで抽出し、
抽出液を減圧下で乾固した。その残留物を6NHCl10ml中
に溶解しこの液を濃縮乾固した。この残留物の無水エタ
ノール・アセトン溶液からの結晶化により光学対掌体過
剰値（enantiomeric excess）（ee）0.51を示すカルニ
チン塩化物（216mg、収率43％）（▲〔α〕25 D▼−12.0
゜）（Ｃ、7.2H2Oの試料を与えた。
実施例２ 一週間培養したA.カルコアセチカスATCC39647スラント
の表面成長部を5mlの培地Ａに懸濁した。この液の4mlを
１％DL−カルニチン修正ジョンソン培地A50mlを入れた2
50mlエルレンマイヤーフラスコの接種に使用した（Ｆ−
１段階）。フラスコを回転振とう機（250rpm/min.2イン
チ径）上25℃で24時間培養した後、その容積10％相当分
を下記の培地（培地Ｂ）500mlを入れた２容エルレン
マイヤーフラスコに移した（Ｆ−２段階）。
の表面成長部を5mlの培地Ａに懸濁した。この液の4mlを
１％DL−カルニチン修正ジョンソン培地A50mlを入れた2
50mlエルレンマイヤーフラスコの接種に使用した（Ｆ−
１段階）。フラスコを回転振とう機（250rpm/min.2イン
チ径）上25℃で24時間培養した後、その容積10％相当分
を下記の培地（培地Ｂ）500mlを入れた２容エルレン
マイヤーフラスコに移した（Ｆ−２段階）。
DL−カルニチン（シグマ）（20g/）を加え、pHを4N
NaOHにより6.8に調整し、121℃で20分間の滅菌を行なっ
た。
NaOHにより6.8に調整し、121℃で20分間の滅菌を行なっ
た。
回転振とう機上で25℃、44時間培養した後、内容物50ml
を遠心分離により細胞除去し、上澄液を蒸発乾固した。
実施例１に記載した方法によりＬ−カルニチン塩化物
（196mg,収率38％）を単離した。▲〔α〕25 D▼−22.9
゜（Ｃ、2.65H2O）の値から光学的純度は96.5％ee以上
と評価された。
を遠心分離により細胞除去し、上澄液を蒸発乾固した。
実施例１に記載した方法によりＬ−カルニチン塩化物
（196mg,収率38％）を単離した。▲〔α〕25 D▼−22.9
゜（Ｃ、2.65H2O）の値から光学的純度は96.5％ee以上
と評価された。
実施例３ 実施例２とＦ−２段階でのDL−カルニチン塩化物濃度が
同じ培地50mlを入れた250mlエルレンマイヤーフラスコ
中で50g/であることの他は同じ操作を行った。Ｆ−２
段階を68時間経過して、発酵液17mlから同じ操作（実施
例１）によりＬ−カルニチン塩化物を単離した（180mg,
収率42％）。この試料の光学的純度は▲〔α〕25 D▼−2
0.43゜（C.2.36H2O）という値から明らかなように86％e
e以上であった。
同じ培地50mlを入れた250mlエルレンマイヤーフラスコ
中で50g/であることの他は同じ操作を行った。Ｆ−２
段階を68時間経過して、発酵液17mlから同じ操作（実施
例１）によりＬ−カルニチン塩化物を単離した（180mg,
収率42％）。この試料の光学的純度は▲〔α〕25 D▼−2
0.43゜（C.2.36H2O）という値から明らかなように86％e
e以上であった。
実施例４ 参考例2Cと培地Ａ中に0.3％Ｌ−カルニチン塩化物と0.7
％Ｄ−カルニチン塩化物の混合物よりなる１％DL−カル
ニチン塩化物を用いることのほかは同じ操作を行った。
発酵はA.カルコアセチカスATCC39647を用い培地A250ml
を入れた２容エルレンマイヤーフラスコで行った。Ｆ
−２段階を44時間経過してから100mlの発酵液を採り、
Ｌ−カルニチン塩化物〔36mg,収率12％、▲〔α〕25 D▼
−21.2゜、Ｃ、3.6、H2O〕を単離した。
％Ｄ−カルニチン塩化物の混合物よりなる１％DL−カル
ニチン塩化物を用いることのほかは同じ操作を行った。
発酵はA.カルコアセチカスATCC39647を用い培地A250ml
を入れた２容エルレンマイヤーフラスコで行った。Ｆ
−２段階を44時間経過してから100mlの発酵液を採り、
Ｌ−カルニチン塩化物〔36mg,収率12％、▲〔α〕25 D▼
−21.2゜、Ｃ、3.6、H2O〕を単離した。
実施例５ 参考例2CとA.カルコアセチカスATCC39647を用い培地Ａ
中に1.6％Ｌ−カルニチン塩化物と0.4％Ｄ−カルニチン
塩化物の混合物よりなる２％DL−カルニチン塩化物を用
いることのほかは同じ操作を行った。Ｆ−２段階を44時
間経過してから100mlの発酵液を採り、Ｌ−カルニチン
塩化物〔551mg,収率34％、▲〔α〕25 D▼−23.05゜、
Ｃ、2.6、H2O〕を単離した。
中に1.6％Ｌ−カルニチン塩化物と0.4％Ｄ−カルニチン
塩化物の混合物よりなる２％DL−カルニチン塩化物を用
いることのほかは同じ操作を行った。Ｆ−２段階を44時
間経過してから100mlの発酵液を採り、Ｌ−カルニチン
塩化物〔551mg,収率34％、▲〔α〕25 D▼−23.05゜、
Ｃ、2.6、H2O〕を単離した。
実施例６ 参考例2CとDL−カルニチン塩化物濃度が２容エルレン
マイヤーフラスコ中に保持された培地B250ml中でＬ−カ
ルニチン塩化物３部とＤ−カルニチン塩化物７部よりな
る混合物が50g/であることのほかは同じ操作を行っ
た。A.カルコアセチカスATCC39647を用いる69時間の培
養（Ｆ−２段階）後、50mlの発酵液を遠心分離（9000×
６、20分間）して細胞を除去した。この上澄液を減圧乾
固し、その残留物を無水エタノールで抽出した。エタノ
ール抽出液を乾固し、その残留物を蒸留水中に溶解し、
ドウエックス（Dowex）１−Ｘ−4OHカラム（５×22cm）
上のクロマトグラフィーでＬ−カルニチンを得た〔140m
g、収率23％、▲〔α〕25 D▼−29.2゜、Ｃ、1.5、H
2O〕。
マイヤーフラスコ中に保持された培地B250ml中でＬ−カ
ルニチン塩化物３部とＤ−カルニチン塩化物７部よりな
る混合物が50g/であることのほかは同じ操作を行っ
た。A.カルコアセチカスATCC39647を用いる69時間の培
養（Ｆ−２段階）後、50mlの発酵液を遠心分離（9000×
６、20分間）して細胞を除去した。この上澄液を減圧乾
固し、その残留物を無水エタノールで抽出した。エタノ
ール抽出液を乾固し、その残留物を蒸留水中に溶解し、
ドウエックス（Dowex）１−Ｘ−4OHカラム（５×22cm）
上のクロマトグラフィーでＬ−カルニチンを得た〔140m
g、収率23％、▲〔α〕25 D▼−29.2゜、Ｃ、1.5、H
2O〕。
実施例７ 実施例６とＦ−２段階のDL−カルニチン塩化物濃度がＬ
−カルニチン塩化物８部とＤ−カルニチン塩化物２部よ
りなる50g/であることのほかは同じ操作を行った。発
酵液（Ｆ−２段階、69時間）50mlから前述の方法でＬ−
カルニチン内塩を単離した。〔1.216g、収率75％、▲
〔α〕25 D▼−30.4゜、Ｃ＝2.8、H2O〕。
−カルニチン塩化物８部とＤ−カルニチン塩化物２部よ
りなる50g/であることのほかは同じ操作を行った。発
酵液（Ｆ−２段階、69時間）50mlから前述の方法でＬ−
カルニチン内塩を単離した。〔1.216g、収率75％、▲
〔α〕25 D▼−30.4゜、Ｃ＝2.8、H2O〕。
実施例８ 実施例６とＦ−２段階のDL−カルニチン塩化物濃度が50
g/であることのほかは同じ操作を行った。Ｆ−２段階
を90時間経過した後、発酵液40mlを採り、遠心分離し
た。前述の方法でＬ−カルニチン内塩を単離した。（1.
062g、収率75％、▲〔α〕25 D▼−27.0゜、Ｃ＝4.4、H2
O）。
g/であることのほかは同じ操作を行った。Ｆ−２段階
を90時間経過した後、発酵液40mlを採り、遠心分離し
た。前述の方法でＬ−カルニチン内塩を単離した。（1.
062g、収率75％、▲〔α〕25 D▼−27.0゜、Ｃ＝4.4、H2
O）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (17)
- 【請求項１】DL−カルニチンラセミ混合物をそれに含ま
れる非天然型のＤ−カルニチンを優先的に分解し、所望
の天然型のＬ−カルニチンを反応培地中に蓄積する独特
の能力により特徴づけられたアシネトバクター（Acinet
obacter）属から選ばれた微生物により作出された酵素
の発酵作用に付し、かつその反応培地からＬ−カルニチ
ンを取り出すことよりなるＬ−カルニチンおよび同塩を
調製する方法。 - 【請求項２】微生物がアシネトバクターの突然変異株で
ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】微生物がアシネトバクターカルコアセチカ
ス（Acinetobacter calcoaceticus）ATCC39648の特性を
有するものである特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】微生物がアシネトバクターカルコアセチカ
スATCC39648の突然変異株である特許請求の範囲第１項
記載の方法。 - 【請求項５】微生物がアシネトバクターカルコアセチカ
スATCC39647の特性を有するものである特許請求の範囲
第１項記載の方法。 - 【請求項６】水性栄養化培地中、好気条件下での微生物
成長培養液中で行われる特許請求の範囲第１項記載の方
法。 - 【請求項７】微生物の固定細胞によって行う特許請求の
範囲第１項記載の方法。 - 【請求項８】連続的である特許請求の範囲第７項記載の
方法。 - 【請求項９】微生物により作り出された酵素を含有し、
微生物を含有しない培地中で行われる特許請求の範囲第
１項記載の方法。 - 【請求項１０】約25゜から約37℃までの範囲の温度で行
われる特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１１】ミネラル塩、ミネラルイオンおよび単独
炭素源としてのDL−カルニチンよりなる培地中で行われ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１２】ミネラル塩培地がジョンソン培地Ａ（Jo
hnson's Medium A）である特許請求の範囲第11項記載の
方法。 - 【請求項１３】ミネラル塩培地がジョンソン培地Ｂ（Jo
hnson's Medium B）である特許請求の範囲第11項記載の
方法。 - 【請求項１４】DL−カルニチン濃度が増大するに従って
反応培地中のアンモニウムイオン濃度を増大させること
によってカルニチンのＤ−異性体の代謝速度を最適化す
る特許請求の範囲第11項記載の方法。 - 【請求項１５】微生物アシネトバクターカルコアセチカ
ス（ATCC39648）を水性栄養化培地中で単独炭素源とし
てのDL−カルニチンラセミ混合物の存在下、好気条件下
でそのラセミ混合物中のＤ−カルニチンを優先的に分解
するように培養し、次いでその培地から蓄積されたＬ−
カルニチンを取り出すことよりなるDL−カルニチンのラ
セミ混合物を分割する特許請求の範囲第１項記載の方
法。 - 【請求項１６】微生物がアシネトバクターカルコアセチ
カス（ATCC39647）である特許請求の範囲第15項記載の
方法。 - 【請求項１７】DL−カルニチン自体を非天然型のＤ−カ
ルチニンを優先的に分解する独特な能力によって特徴づ
けられるアシネトバクター（Acinetobacter）属から選
ばれた微生物によって作出された酵素の発酵作用に付
し、その反応培地からＬ−カルニチンを取り出すことよ
りなる誘導体を予め調製するという必要条件なしでDL−
カルニチンを分割する特許請求の範囲第１項記載の方
法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US60228984A | 1984-04-20 | 1984-04-20 | |
| PCT/US1985/000674 WO1985004900A1 (en) | 1984-04-20 | 1985-04-17 | Process for preparing l-carnitine |
| US602289 | 2000-06-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61501886A JPS61501886A (ja) | 1986-09-04 |
| JPH0714355B2 true JPH0714355B2 (ja) | 1995-02-22 |
Family
ID=24410766
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60501876A Expired - Lifetime JPH0714355B2 (ja) | 1984-04-20 | 1985-04-17 | Ｌ−カルニチンの調製方法 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0179864B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0714355B2 (ja) |
| KR (1) | KR860700045A (ja) |
| AU (1) | AU4233285A (ja) |
| CA (1) | CA1269941C (ja) |
| DE (1) | DE3579284D1 (ja) |
| ES (1) | ES8606497A1 (ja) |
| FI (1) | FI855074A0 (ja) |
| GR (1) | GR850950B (ja) |
| MX (1) | MX7657E (ja) |
| NO (1) | NO855051L (ja) |
| PH (1) | PH24045A (ja) |
| PT (1) | PT80323B (ja) |
| WO (1) | WO1985004900A1 (ja) |
| YU (1) | YU69785A (ja) |
| ZA (1) | ZA852808B (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1338723C (en) * | 1985-11-25 | 1996-11-19 | Hideyuki Takahashi | Process for preparing 3-chloro-1,2-propanediol |
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