JP2000514285A

JP2000514285A - ２―ケト―ｌ―グロン酸産生のための発酵プロセスにおける新規な細菌株およびその使用

Info

Publication number: JP2000514285A
Application number: JP10500980A
Authority: JP
Inventors: エフ．ストッダード，スティーブン; ジェイ．リャウ，ハンミン; エム．エディントン，ジョン; ヤン，ユーキン
Original assignee: アーチャー―ダニエルズ―ミッドランドカンパニー
Priority date: 1996-10-24
Filing date: 1997-10-23
Publication date: 2000-10-31
Also published as: CA2269771C; US6541239B1; HUP0000488A2; YU20099A; ZA979553B; CA2269771A1; US6319699B1; TR199900881T2; PL332939A1; BR9712640A; ATE244765T1; AU4912297A; AU717515B2; NZ508247A; WO1998017819A1; KR100346490B1; KR20000052739A; NO991863L; ID22130A; IL129334A0

Abstract

(57)【要約】本発明は、L-ソルボースおよび／またはD-ソルビトールの発酵転化による、2-ケト-L-グロン酸の産生のためのプロセスに関する。本発明はさらに、このプロセスに有用な新規な細菌株に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 2-ケト-L-グロン酸産生のための発酵プロセスにおける新規な細菌株およびその使用発明の分野本発明は、L-ソルボースおよび／またはD-ソルビトールの発酵転化による、2- ケト-L-グロン酸の産生のためのプロセスに関する。本発明はさらに、このプロセスに有用な新規な細菌株に関する。発明の背景 2-ケト-L-グロン酸（2-Keto-L-gulonic acid）（「2-KLG」）は、L-アスコルビン酸（ビタミンＣ）（必須栄養素）の調製における、重要な中間体である。2- KLGは、Reichstein法を用いて、工業的な規模で過去に合成されている（Helveti ca Chimica Acta 17:311(1934)）。しかし、この方法は、大量の溶媒の使用および多数の複合反応工程の関与を含む、商業的適用についての多数の不利な点を有する。従って、Reichstein法に対する代替として、１つ以上の微生物を使用する多数のプロセスが、発酵による2-KLGを産生するために開発されている。米国特許第2 ,421,611号は、例えば、D-グルコースから5-ケト-D-グルコン酸への微生物酸化に続くL-イドン酸（L-idonic acid）への化学的または微生物還元、そして続く2 -KLGへの微生物酸化を含む方法を開示する。特許公報第39-14493号、同第53-250 33号、同第56-15877号、および同第59-35290号は、例えば、D-グルコースの2,5- ジケト-D-グルコン酸への微生物酸化、続く2-KLGへの微生物または化学的還元を含む類似のプロセスを開示する。しかし、これらの方法はまた、2-KLGの商業的産生におけるそれらの有用性を減少する多数の不利な点を被っている。例えば、これらの方法における化学的還元工程（すなわち、5-ケト-D-グルコン酸からL-イドン酸および2,5-ジケト-D-グルコン酸から2-KLGへの還元）は、順に2-KLGの収量を減少する還元の立体化学を制御する（従って、副産物として、それぞれ、D-グルコン酸および2-ケト-D-グルコン酸を産生する）問題に付随して起こる。あるいは、この還元が１つ以上の微生物によって行われる場合、過剰の糖が、還元のためのエネルギー源を提供するのに必要であり、これもまた、2-KLGの収量を減少する。これらの問題を考慮して、代替の経路が2-KLGの発酵産生について使用されており、これはソルボゾン(sorbosone)中間体を介する、L-ソルボースの2-KLGへの酸化のみを含む。多数のプロセスが、Gluconobacter oxydans（米国特許第4,935 ,359号；同第4,960,695号；同第5,312,741号；および同第5,541,108号）のようなGluconobacter属、Pseudogluconobacter saccharoketogenes（米国特許第4,87 7,735号；欧州特許第221707号）のようなPseudogluconobacter属からの広範な微生物、Pseudomonas sorbosoxidans（米国特許第4,933,289号および同第4,892,82 3号）のようなPseudomonas属、そしてこれらならびにAcetobacter、Bacillus、S erratia、Mycobacterium、およびStreptomyces（米国特許第3,912,592号；同第3 ,907,639号；および同第3,234,105号）のような他の属からの微生物の混合を使用するこの経路を用いて開発されている。しかし、これらのプロセスは、2-KLGの商業的産生についてのそれらの有用性を限定する特定の不利な点を被っている。例えば、G.oxydansを使用する上記に参照したプロセスはまた、商業的使用のために十分に高レベルの2-KLGを産生するために、さらなる「ヘルパー(helper)」微生物株（例えば、Bacillus megater ium）、または商業的に魅力的ではない量の酵母もしくは酵母に由来する増殖成分の存在を必要とする。同様に、Pseudogluconobacterを使用するプロセスは、商業的に適切な2-KLG濃度およびソルボース基質の効率的な使用を達成するために、高価で珍しい土塩類（earth salt）を補充した培地、またはヘルパー株（例えば、B.megaterium）の存在、および／または酵母の存在を必要とし得る。Pseu domonas sorbosoxidansを使用する他のプロセスもまた、培地中に商業的に魅力的ではない量の酵母または酵母抽出物を含む。従って、当該分野において、2-KLGを効率的に産生するが、当該分野の状態に関連する多くの問題を伴わない微生物株の必要性が存在する。発明の要旨それゆえ、本発明の目的は、2-KLGを効率的に産生する微生物株を提供することである。本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の好ましい実施態様の詳細な説明において示され、そして部分的に説明から明らかになるか、または本発明の実施によって理解され得る。本発明のこれらの目的および利点は、記載の説明および本明細書中の請求の範囲に特に示される方法によって、理解されそして達成される。これらおよび他の目的は、本発明の方法によって達成され、これは、第１の実施態様において、L-ソルボースから2-KLGを産生するプロセスに関し、培地において、NRRL B-21627（ADM X6L）株またはその変異体もしくは改変体の微生物を、単独または１つ以上のヘルパー株との混合培養によって培養する工程、次いで、蓄積した2-KLGを回収する工程を含む。本発明の別の実施態様は、NRRL B-2162 7株またはその変異体（例えば、NRRL B-21630（ADM86-96）の微生物の培養に指向される。前述の一般的な記載および以下の詳細な説明の両方は、例示および説明のためのみであり、そして本願発明のさらなる説明を提供することが意図されることが理解される。図面の簡単な説明養寄託DSM 4027、米国特許第4,935,359号）の小コロニー成分株の再単離物（rei nobacter saccharoketogenes株IFO14484から得られた。発明の好ましい実施態様の詳細な説明第１の実施態様において、本発明は、2-ケト-L-グロン酸のL-ソルボースからの産生のための発酵プロセスに関し、これは、微生物をL-ソルボースに十分な時間接触させる工程、次いで蓄積した2-KLGを単離する工程を含む。好ましくは、本発明の発酵プロセスは、微生物を、L-ソルボースを含む合成または天然の培養培地において十分な時間培養する工程、次いで蓄積した2-KLGを、培養培地および／または微生物の細胞から単離する工程を含む。本発明のプロセスに使用される微生物株は、好ましくは、細菌株NRRL B-21627 （ADM X6L）またはその変異体もしくは改変体であり、これは、純粋培養における（すなわち、１つ以上のさらなる微生物株（単数または複数）の非存在下における）発酵によって、L-ソルボースから少なくとも約40g/Lの2-KLGを産生し得る。 NRRL B-21627（ADM X6L）株は、Agricultural Research Service Culture Col lection（NRRL）（1815 North University Street，Peoria，IllinoiS 61604，U SA）に、1996年10月１日に、ブタペスト条約の下に寄託され、そして受託番号NR RL B-21627を割り当てられた。NRRL B-21627（ADM X6L）株の特徴は以下を含む：（１）細胞形態−グラム陰性；より古い培養においてグラム可変であり得る；多態性（pleiomorphic）；短桿菌(short rod)または球菌；細胞は１つずつまたは対を示す；短鎖またはフィラメントを形成し得る；芽胞を形成しない；（２）コロニー形態−点状、凸状、完全、平滑、液状、および半透明；同じ培地上のより古いコロニーにおいて、ベージュまたは薄茶色の呈色；（３）運動性：液体培養または２％寒天プレート培養物から調製した湿潤マウントにおいて運動性は観察されない；0.3％〜0.4％寒天を用いて部分的に凝固されているBUGM^TM培地（Biolog,Inc.，Cat.#70001から入手可能）のプレートの新鮮な培養物を穿刺することによって、運動性は観察される；細胞は運動性を観察するために使用した条件下で鞭毛を生成する；（４）温度範囲：４℃、37℃、または41℃では、増殖は観察されないが、25℃および30℃で良好な増殖が観察された；（５）pH範囲：pH4.5では増殖は観察されなかった；pH6.2で増殖が観察された； pH7.2で良好な増殖が観察された；（６）生理学的特徴：（a）カタラーゼ：ポジティブ；（b）オキシダーゼ；ポジティブ（c）ゼラチナーゼ；ネガティブ；（d）好気性、嫌気性条件下では増殖せず；（e）フルクトースから形成される茶色素；（f）酸はエタノールから産生される；（g）ジヒドロキシアセトンはグリセロールから産生されない；（h）4.0〜5.0の範囲のpHでは、静置グルコースまたはマンニトールブロス培養において24時間以内で薄膜または環を形成しない；および（i）ストレプトマイシンに感受性；ならびに（７）構造特徴：（a）３％NaClにおける増殖：ポジティブ；（b）ペプトン-酵母抽出物-マンニトール寒天：増殖；（c）Marine寒天：低増殖；（d）BUGM^TMおよびBUGM-G^TM；増殖；および（e）Brain Heart Infusion寒天：増殖。のハイブリダイゼーション、続くゲル電気泳動を用いる標識化二本鎖ハイブリッドの検出を含む。この方法によって得られるパターンは、異なる種の生物間のみでなく、同じ種の異なる株間の分化に有用である。NRRL B-21627 から2-KLGを産生し得ることが公知の多数の比較株は、図１に示される。天然に存在するNRRL B-21627（ADM X6L）株に加えて、その変異体および改変体もまた本発明のプロセスに使用され得、ただしこれは、これらの変異体および改変体もまた、単培養において、L-ソルボースから少なくとも40g/Lの2-KLGを産生し得る。本発明の微生物の変異体および改変体を調製するための適切な方法の例示的な例は、以下を含むがこれらに限定されない：紫外線またはＸ線での照射、またはニトロソグアニジン（N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン）、メチルメタンスルホン酸、ナイトロジェンマスタードなどのような化学変異源での処理による変異誘発；遺伝子組込み技術、例えば、挿入エレメントまたはトランスポゾン、あるいは形質転換線状または環状DNA分子の同種組換えによって媒介されるもの；およびP1のようなバクテリオファージによって媒介される形質導入。これらの方法は当該分野で周知であり、そして例えば、J.H.Miller，Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Ha rbor New York(1972)；J.H.Miller，A Short Course in Bacterial Genetics，C old Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1992)； M.SingerおよびP.Berg，Genes & Genomes，University Science Books，Mill Va lley，California(1991)；J.Sambrook，E.F.FritschおよびT.Maniatis，Molecul ar Cloning：A Laboratory Manual，第２版、Cold Spring Harbor Laboratory P ress，Cold Spring Harbor New York（1989）；P.B.Kaufmanら、Handbook of Mo lecular and Cellular Methods in Biology and Medicine，CRC Press，Boca Ra ton，Florida(1995)；Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology ，B.R.GlickおよびJ.E.Thompson編、CRC Press，Boca Raton，Florida（1993）；ならびにP.F.Smith-Keary，Molecular Genetics of Escherichi a coli，The Guilford Press，New York，NY（1989）に記載される。次いで、公知の方法を用いて本発明の生物NRRL B-21627（ADM X6L）から誘導した変異株は、好ましくは、改良された2-KLG産生能について、またはL-ソルボースから2-KLGを産生することにおけるそれらの有用性に関連する他の所望の特性について、選択されるかまたはスクリーニングされる。株の改良に対する変異誘発およびスクリーニングアプローチの特に好ましい実施態様において、変異誘発した細胞は、増殖阻害濃度の部分的に誘導体化または分解した2-KLG（例えば、オートクレーブまたは熱に対する他の暴露によって作製された2-KLG誘導体）に対するそれらの耐性に基づいて選択される。代替の実施態様において、選択因子は、2-KLGの化学改変の他の手段（以下を含むがこれらに限定されない：2-アミノ-L-グロン酸または2-アミノ-L-イドン酸を作製するアミノ置換；5-ケト-グルカル酸を作製するC₆位での酸化；2-KLGの種々のチオールもしくはデオキシ誘導体または種々の不飽和誘導体を導く改変）；あるいは当業者に明らかである任意の他の手段によって作製され得る。 NRRL B-21627（ADM X6L）株の特に好ましい変異体（ADM89-96）は、Agricultu ral Research Service Culture Collection（NRRL）(1815 North University St reet，Peoria，Illinois 61604，USA）に、1996年10月15日に、ブタペスト条約の下に寄託され、そして受託番号NRRL B-21630を割り当てられた。本発明に従って、本発明の微生物またはその変異体もしくは改変体は、十分な時間L-ソルボースと接触され、次いで、蓄積した2-KLGは単離される。好ましくは、微生物株は、L-ソルボースを含む天然または合成培地において、2-KLGが産生される十分な時間培養され、そして蓄積した2-KLGは続いて単離される。あるいは、微生物株の細胞に由来する調製物は、十分な時間L-ソルボースと接触され得、次いで、蓄積した2-KLGは単離され得る。本明細書中で用いられるように、「細胞に由来する調製物」は、本発明の株またはその変異体もしくは改変体、アセトン乾燥細胞、支持体（例えば、ポリアクリルアミドゲル、κカラゲナンなど）上の固定化細胞、および類似の調製物の培養ブロスからの細胞の任意および全ての抽出物を意味することが意図される。このような手順の例示的な例は、適切な水性緩衝液（例えば、2-(N-メチルモルホリノ)エタンスルホン酸（pH6.5；0.5M））中のL-ソルビトールおよびCaCO₃ を、振盪フラスコ中の微生物株の水性抽出物に添加することを含む。この反応は、好ましくは、5.0〜8.0の範囲のpHで、20℃〜40℃の範囲の温度にて、約1〜100 時間進行する。L-ソルボースの濃度は、約0.1〜10％w/v、より好ましくは約0.3 〜６％（w/v）であるべきであり、そしてNRRL B-21627（ADM X6L）株またはその変異体もしくは改変体（例えば、NRRL B-21630（ADM86-96））の細胞に由来する調製物の量は、約１〜30mg/mlであるべきである。2-KLG収率を最大化することが経験的に決定された温度およびpH条件下で、十分な時間振盪した後、蓄積した2- KLGは、従来の方法によって単離され得る。本明細書中で用いられる培地は、固体または液体、合成（すなわち、人工）または天然であり得、そして本発明の微生物株の培養に十分な栄養素を含む。好ましくは、使用される培地は、液体培地、より好ましくは合成液体培地である。本発明のプロセスの種々の実施態様において、開始物質（L-ソルボース）は、本発明の微生物株の導入前に培地中に存在し得るか、あるいは株の導入後に、開始と同時に、または培養の経過にわたって連続してもしくは分割してのいずれかで全てを培地に添加され得るか、あるいはD-ソルビトールの発酵転化によってインサイチュで作製され得る。使用されるL-ソルボースの量は、当業者によって経験的に決定され得るが、微生物株が少なくとも約40g/Lの2-KLGを産生するに少なくとも十分である。好ましくは、L-ソルボースは、培養培地の３〜30％（w/v）、より好ましくは５〜20％を含む。本発明の好ましい実施態様において、L-ソルボース開始物質は、適切な微生物または微生物の混合を用いるD-ソルビトールの発酵転化によって、インサイチュで作製される。NRRL B-21627（ADM X6L）またはその変異体もしくは改変体の存在下でD-ソルビトールからL-ソルボースに転化し得るが、L-ソルボースを2-KLG に転化するその能力に悪影響を及ぼさない、任意の微生物または微生物の混合物が使用され得る。好ましくは、使用される微生物は、Gluconobacter oxydansの株、より好ましくはG.oxydans株ATCC 621またはG.oxydans株IFO 3293である。本発明の好ましい実施態様によって、D-ソルビトール開始物質は、１つ以上の微生物の導入の前に培地中に存在し得るか、あるいは１つ以上の微生物の導入後に、開始と同時に、または培養の経過にわたって連続してもしくは分割してのいずれかで全てを培地に添加され得る。 L-ソルボースおよび／またはD-ソルビトールに加えて、天然または合成培養培地はまた、窒索源、適切な無機塩、および適切には、種々の微量栄養素、微生物株の培養に適した増殖因子などを含み、そしてまた、少なくとも１つの補充炭素源を含み得る。使用されるこれらのさらなる成分の各々の量は、好ましくは、2- KLG産生を最大にするために選択される。このような量は、当該分野で公知の種々の方法および技術に従って、当業者によって経験的に決定され得る。本発明の特に好ましい実施態様において、培養培地は、約10％（w/v）のL-ソルボース、約３％（wt、乾燥固体／v）のコーンスティープリカー（corn steep liquor）、および約0.2％（w/v）のMgSO₄・7H₂Oを含み、NH₄OH、Ca(OH)₂またはCaCO₃を用いて制御したpHを有する。種菌を調製する際に用いるための培地は、適切には、さらなる成分（例えば、ペプトンまたはN-Zアミン）、補充炭素源、および／または種々のビタミンを含み得る。適切な補充炭素源の例示的な例としては、以下を含むがこれらに限定されない：他の炭化水素（例えば、グルコース、フルクトース、マンニトール、デンプンまたはデンプン加水分解産物、セルロース加水分解産物、および糖蜜）；有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、乳酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマル酸）；ならびにアルコール（例えば、グリセロール）。適切な窒素源の例示的な例としては、以下を含むがこれらに限定されない：アンモニア（アンモニアガスおよび水性アンモニアを含む）；無機酸または有機酸のアンモニウム塩（例えば、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、および酢酸アンモニウム）；尿素；硝酸塩または亜硝酸塩、ならびに他の窒素含有物質（純粋または粗調製物のようなアミノ酸、肉抽出物、ペプトン、魚肉、魚加水分解産物、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解産物、大豆固形物(cake)加水分解産物、酵母抽出物、乾燥酵母、エタノール-酵母蒸留液、大豆粉末、綿実粕など）。適切な無機塩の例示的な例としては、以下を含むがこれらに限定されない：カリウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、コバルト、亜鉛、銅および他の微量エレメントの塩、ならびにリン酸塩。適切な微量栄養素、増殖因子などの例示な例としては、以下を含むがこれらに限定されない：補酵素Ａ、パントテン酸、ビオチン、チアミン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、他のビタミン、システインのようなアミノ酸、チオ硫酸ナトリウム、p-アミノ安息香酸、ニコチンアミドなど。これらは純粋または部分的に精製した化学化合物または天然物質に存在するかのいずれかである。本発明の微生物株の培養は、当業者に公知の任意の液内発酵技術（例えば、エアーリフト(airlift)、伝統的な散布-撹拌設計、または振盪培養において）を用いて達成され得る。使用される培養条件（温度、pH、通気速度、撹拌速度、培養期間などを含む）は、当業者によって、2-KLG産生を最大にするように経験的に決定され得る。特定の培養条件の選択は、使用される特定の本発明の微生物株、培地組成物および型、培養技術、ならびに同様の考慮に依存する。NRRL B-21627（ADM X6L）株またはその変異体もしくは改変体（例えば、NRRL B-21630（ADM 86-96））を使用する場合、本発明の特に好ましい実施態様において、培養は、22℃〜35℃の範囲の温度、好ましくは約30℃、そして5.0〜8.0の範囲、好ましくは5.5〜7.5の範囲、より好ましくは約6.0〜6.8の範囲のpHで行われる。当然のことながら、使用される培養条件は、培養中の異なる時点で、適切に、2-KLG産生を最大にするように、公知の方法によって変更され得る。十分な時間（例えば、10〜150時間）の培養後、細胞および／または培養ブロス中に蓄積した2-KLGは、任意の公知の方法に従って単離される。培養に使用される条件に適切な任意の方法が使用され得る；2-KLGを回収するための適切な方法の例示的な例は、米国特許第5,474,924号；同第5,312,741号；同第4,960,695 号；同第4,935,359号；同第4,877,735号；同第4,933,289号；同第4,892,823号；同第3,043,749号；同第3,912,592号；同第3,907,639号、および同第3,234,105号に記載される。１つのこのような方法によって、微生物は、公知の方法（例えば、遠心分離または濾過）によって培養ブロスから最初に除去され、そして得られた溶液は、減圧下で濃縮される。次いで、結晶性の2-KLGは、濾過によって回収され、そして所望される場合、再結晶化によって生成される。同様に、2-KLGは、イオン交換樹脂、溶媒抽出、沈殿、塩析などの使用のような公知の方法を用いて回収され得る。 2-KLGが遊離酸として回収される場合、従来の方法を用いて、所望のような、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、または同様のカチオンとの塩に転換され得る。あるいは、2-KLGが塩として回収される場合、従来の方法を用いて、その遊離形態または異なる塩に転換され得る。本発明の代替の実施態様において、本発明の微生物は、１つ以上のヘルパー株との混合培養において培養される。本明細書中で用いられるように、「ヘルパー株」は、本発明のプロセスにおいて産生される2-KLGの量を増加させる微生物の株を意味することが意図される。適切なヘルパー株は、当業者によって経験的に決定され得る。適切なヘルパー株の例示的な例としては、以下を含むがこれらに限定されない：Aureobacterium（好ましくは、A.liquefaciensまたはA.saperdae ）、Corynebacterium（好ましくは、C.ammoniagenesまたはC.glutamicum）、Bac illus、Brevibacterium（好ましくは、B.linensまたはB.flavum）、Pseudomonas 、Proteus、Enterobacter、Citrobacter、Erwinia、Xanthomonas、およびFlavob acterium。好ましくは、ヘルパー株は、Corynebacterium glutamicum ATCC 2154 4である。ヘルパー株は、好ましくは、適切な培地中で、適切な条件下で、十分な時間、十分な集団の培養物が得られるまで、インキュベートされる。次いで、このヘルパー株種菌は、別々または本発明の微生物株と組み合わせて（すなわち、混合した種菌）のいずれかで、2-KLGを産生するための培養培地に導入され得る。好ましくは、NRRL B-21627（ADM X6L）の量に関連するヘルパー株の量の比は、10:1 〜1:10,000の範囲である。本発明の別の実施態様は、上記の新規な微生物株に関し、これは2-KLGの産生のための発酵プロセスにおいて有用である。以下の実施例は例示するのみであり、そして添付の請求の範囲によって規定されるような本発明の範囲を限定することを意図されない。当業者には、種々の改変および変更が、本発明の方法において、本発明の精神および範囲を逸脱せずになされ得ることは明らかである。従って、本発明の改変および変更が、添付の請求の範囲の範囲およびそれらの等価物内にあるならば、本発明がそれらを含むことが意図される。本明細書中に参照される全ての特許および刊行物は、参考として明白に援用される。実施例実施例１：NRRL B-21627（ADM X6L）株の単離Ａ．土壌サンプルの起源、濃縮、およびスクリーニング環境検体を振盪フラスコ中で微生物的濃縮に供した。得られた混合物培地をスクリーニングして、L-ソルボースから2-KLGを産生し得る少なくとも１つ以上の微生物を含むものを同定した。湿潤土壌、砂、堆積物、果物、液果、腐植、および他の環境検体を、アメリカ合衆国の種々の地域から採集した。各検体を、冷却換気湿潤容器中に即座に保存した。濃縮は、１グラムの土壌または検体を、250m Lバッフル振盪フラスコ中の30mLの培地Ａ（表１）に添加し、続いて30℃にて230 rpm、49時間振盪インキュベーションすることによって開始した。発酵による濃縮をスクリーニングするために、各濃縮物の0.5〜0.75mLを、30m Lの新鮮な培地Ｂ（表１）を含む250mLバッフルフラスコに移した。混合した培地発酵の一部を2-KLG含量について分析した後、これらのフラスコを、30℃にて230 rpm、68時間振盪し、低温保存した。保存のために、各培養物の2.0mLを、10mLの 40％滅菌グリセロール水と混合し、次いで-70℃で保存した。フラスコを、Whatman LK5 Silica Gel 150プレート（250mm厚）（カタログ番号4855-820）の薄層クロマトグラフィーを用いて、2-KLG産生についてスクリーニングした。プレートを、５μＬの遠心分離した培養液でスポットし、そして溶媒中（157mLのn-プロパノール；39mLの脱イオン水；４mLの１％リン酸；0.4mLの氷酢酸）で５〜６時間発色させた。プレートを風乾し、次いで25mLのメタノールおよび25mLの６N水酸化ナトリウム中に溶解した0.125gの塩化テトラゾリウムブルーをスプレーした。その後、それを60℃にて５分間焼いた。ソルボースおよび 2-KLGを、完成したプレート上の紫色のスポットとして可視化し、そして2-KLGおよびL-ソルボースの各々10g/Lを含む標準との比較によって同定した。 2-KLGの産生を、HPLCによって定量した。試料を、移動相中の1:10希釈、続いて0.45μｍ多孔性膜を通して濾過することによって調製した。移動相は、Mili-Q 水を用いて4.0Lに希釈した、1.1mLのACSグレードのスルホン酸を含む。100μＬのサンプルの各々を、600mmの全カラム長を提供するために一続きに配列した２つの２mm×300mm×7.8mm Aminex HPX-87Hカラム（BioRad）（同じ樹脂のガードカラムの前に）にロードした。カラムを、0.6mL/minの流速を用いて55℃にて実行した。L-ソルボースおよび2-KLGを、Waters Model No.410示差屈折計を用いて検出し、そして2-KLGおよびL-ソルボースを含む標準に対して比較することによって同定した。 33の混合した培養発酵は、1.8〜9.3g/Lの範囲の量の2-KLGを産生した。土壌サンプル#2l6B（ここから、NRRL B-2167を後に単離した（実施例１Ｂ）からの混合培養発酵は、6.3g/Lの2-KLGを産生した。Ｂ．単培養の単離および試験 L-ソルボースから2-KLGを産生し得る微生物の純粋培養物（単培養または他の微生物との混合培養のいずれかにおいて）を、上記の濃縮物から単離した。実施例１Ａからの11の混合培養濃縮物を、それらの優位な2-KLG産生に基づいて選択した。これらを解凍し、そして培地Ａを用いて10倍連続増分中に希釈し、その後、各希釈の0.1mLを、培地Ａ寒天プレートの表面に広げた。プレートを、30℃にて24時間インキュベートし、次いで8〜40倍の拡大率で試験した。最小の最遅増殖コロニーは、希釈プレートから2-KLG産生株を回収するために必要であった。各コロニーの型およびサイズのいくつかの例を選択し、そして新鮮な培地Ａで継代培養し、その後、希釈プレートを24時間30℃に戻した。さらなる遅増殖コロニーを、希釈プレートから選択し、そして二次インキュベーション期間の後継代培養した。各株を、各培地ＡプレートまたはPYMプレート（10g/Lペプトン；10g/L 酵母抽出物；0.5g/Lグリセロール；30g/Lマンニトール；20g/L寒天）のいずれかで１〜３周期間画線精製した。純粋な株を、20％グリセロールを含むPYM液体培地中で、-70℃にて低温保存した。全118の純粋な株を、11の濃縮混合物から回収した。 118の新しい株を、振盪フラスコにおいてL-ソルボースを2-KLGに転化するそれらの能力について、試験した。2-KLG産生が、２つ以上の微生物の合わせた活性を要求し得る可能性について説明するために、各新しい単離物を、同じ濃縮物に起源する全ての他の株との対の組合せにおいて、ならびに純粋培養において試験した。種菌を調製するために、各株を、PYM寒天で24時間培養し、その後、細胞の巨大なループを、50mMリン酸ナトリウム、0.4％塩化ナトリウム、および0.05 ％マンニトールを含む滅菌緩衝液（pH7.2）に再懸濁した。各純粋株または対の株の試験のために、30mLの培地Ｃ（表１）を含む250mLバッフルフラスコを、関連株の各々の細胞懸濁物の0.2mLで接種した。これらのフラスコを、30℃にて230 rpm、24時間振盪し、その後、1.0mLを30mLの発酵培地Ｄ（表１）に移した。発酵フラスコを、30℃にて230rpm、３日間振盪し、次いで培養液を2-KLGおよびソルボース含有量について、TLCおよびHPLCを用いて分析した。105のフラスコが、土壌サンプル#216Bからの株を試験するのに必要であった。これらのうち18が、1.9 〜19.3g/Lの範囲の量の2-KLGを産生し、そのうち14が、単離体ADM X6Lで接種されている（表２）。ADM X6L（NRRL B-21627）株が、純粋培養において14.9g/Lの 2-KLGを産生したという事実は、2-KLG産生株としてのその同一性を証明した。表１：実施例１において使用した培地 ^*グルコース、コーンスティープリカー、硫酸鉄、および炭酸カルシウムをpH7.9 に調整し、次いで20分間オートクレーブした。残りの成分をpH6.3に調整し、次いで濾過によって滅菌した。最終培地は、7.1〜7.4の範囲のpHを有した。酵母窒素ベースは、Difco産物#0335-15-9であった。表２：純粋培養および土壌サンプル#216-Bからの他の株との混合培養におけるAD M X6L株による2-KLG産生 ^*％転化収率は、2-KLGとして見いだされた消費したL-ソルボースの重量％をいう。実施例２：振盪フラスコにおけるNRRL B-21627株によるL-ソルボースからの2-KL Gの産生。 NRRL B-21627株を、BUGM^TM固体寒天培地で30℃にて培養し、次いでコロニーを、20mLの培地Ｅ（表３）を含む250mLバッフルフラスコに、滅菌した爪楊枝で移した。種培養を、30℃にて240rpm、24時間インキュベートした。次いで、250mL バッフルフラスコ中20mLの産生培地（培地Ｆ、培地Ｇ、または培地Ｈ；表３）を、この種の２mLで接種した。培養を、30℃にて240rpm、72時間インキュベートした。培養液を続いて回収し、そしてHPLCによって分析した。2-KLG産生結果を、表４に示す。表３：実施例２において使用した培地 ^a20分間のオートクレーブ前にpHを7.0に調整した^b L-ソルボースを20分間オートクレーブし、次いで残りの成分（これは最初にpH7 .2に調整されそして20分間オートクレーブされている）に添加した。^c ビタミンをpH7.0に調整し、そして濾過によって滅菌し、次いでL-ソルボースおよびD-マンニトール（これらは20分間オートクレーブされている）に添加した。次いで、この混合物を、残りの成分（これは最初にpH7.2に調整されそして20分間オートクレーブされている）に添加した。表４：フラスコにおけるNRRL B-21627による2-KLG産生実施例３：NRRL B-2167株による純粋培養におけるL-ソルボースからの2-KLG産生の他の株に関する比較本発明の微生物株NRRL B-21627（ADM X6L）およびGluconobacter oxdans株402 5C（混合培養寄託DSM4027（米国特許第4,935,359号）の小コロニー構成株の再単離体）を、Ｌ−ソルボースからの2-KLGの産生について、いくつかの異なる培地（表５）およびプロトコルを用いて試験した。結果（表６）は、種々の培養培地において、NRRL B-21627株による有意に高度な2-KLG産生を示した。さらに、２つの株を、培地I/Jから培地k/Lへの切替によって別々に影響を及ぼした。表５：実施例３に使用した培地表６：純粋培養振盪フラスコにおけるNRRL B-21627および4025Cによる2-KLG産生の比較 ^a培地C/D（表１）について、株を、PYM寒天ではなくBUGM^TM寒天で最初に培養した以外は、実施例１Ｂの実験プロトコルを使用した。培地I/JおよびK/L（表５）について、実施例２の実験プロトコルを使用した。^b C/D培地におけるADMについての2-KLG値は、９回の試行の平均である；4025Cについての値は６回の試行の平均である。実施例４：NRRL B-21627および第２の微生物を含む混合培養による振盪フラスコにおけるL-ソルボースからの2-KLGの産生 20mLの培地Iを含むバッフル250mL振盪フラスコを、100μＬのNRRL B-21627の凍結培養物および同様量の第２の株で接種した。フラスコを240rpm、30℃にて24 時間振盪した。次いで、この培養物の２mLを、25mLの培地Ｍ（表９）を含む250m Lのバッフルフラスコに移した。240rpm、30℃にて65時間振盪した後、フラスコを、L-ソルボースからの2-KLGの形成についてHPLCによって分析した。結果を表７に示す。表７：フラスコにおけるNRRL B-21627株（ADM X6L）を含む混合培養によるL-ソルボースからの2-KLGの産生 ^*ATCC 19354、ATCC 19391、ATCC 21544、ATCC 21529、NRRL B-14840、およびNRR L B-43647株は、それぞれ、Corynebacterium ammoniagenes、Brevibacterium li nens、Corynebacterium glutamicum、Brevibacterium flavum、Aureobacterium saperdae、およびAureobacterium liquifaciensである。^** 収率％は、2-KLGとして見いだされた消費したL-ソルボースの重量％をいう。実施例５：NRRL B-21627株の改良された改変体についての変異誘発、スクリーニング、および選択。本発明の細菌株NRRL B-21627（ADM X6L）およびその変異体を変異誘発に供し、そして改良された2-KLG産生を示す改変体を回収した。細菌培養を、BUGM^TMまたはPYM培養液培地において、中間対数増殖期まで増殖させ、次いで遠心分離によってペレット化し、そしてガラス管中２mLの濾過滅菌したTM緩衝液（Tris・HCl6 .0g/L、マレイン酸5.8g/L、(NH₄)₂SO₄1.0g/L、Ca(NO₃)₂5.0mg/L、MgSO₄・7H₂O 0 .1g/L、FeSO₄・7H₂O0.25mg/L、KOHを用いてpH6.0に調整）に再懸濁した。2mLの細胞懸濁物を、5.0mg/mLのN'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NTG）溶液の2.5μ Ｌと混合し、次いで30℃にて25分間インキュベートした。未処理の細胞懸濁物を、殺傷速度を評価するためのコントロールとして、同様にインキュベートした。インキュベーションの後、10mLのTM緩衝液を各管に添加し、次いで細胞を遠心分離によってペレット化し、TM緩衝液中で２回洗浄し、次いでKOHを用いてpH7.2に調整した4.0mLの0.1M NaH₂PO₄（リン酸緩衝液）に再懸濁した。洗浄した細胞懸濁物を、リン酸緩衝液中にさらに希釈し、そしてアリコートを、BUGM^TMまたはCM 2寒天培地のプレートに広げ、次いで30℃にてインキュベートした（BUGM^TMはBio log，Inc．から入手可能である,Cat#70001；CM2培地は、D-ソルビトール5.0g/L 、(NH₄)₂SO₄2.0g/L、KH₂PO₄0.1g/L、KH₂PO₄0.9g/L、FeCl₃・6H₂O５mg/L、MnSO₄ ・4H₂O５mg/L、カザミノ酸2.0g/L、酵母抽出物2.0g/L、寒天15.0g/Lを含み、オートクレーブの前にpHを7.0に調整した；以下のCM2成分を濾過によって滅菌した：MgSO₄・7H₂O 0.25g/L、チアミン・HCl30mg/L、パントテン酸およびナイアシンアミド10mg/L、ならびにρ-アミノ安息香酸5mg/L)。変異誘発していないコントロール細胞と比較して、NTG処置からの殺傷速度は60％〜80％であった。生存コロニーをランダムに拾い上げ、そして振盪フラスコにおけるL-ソルボースからの改良された2-KLG産生についてスクリーニングした。あるいは、変異誘発した細胞懸濁物を希釈し、そして増殖阻害性CM2-S選択寒天培地のプレートに広げた（C M2-Sは、オートクレーブ前に培地の熱安定性成分に添加された７〜８％の2-KLG を含むCM2である）。CM2-S寒天上で増殖したコロニーを拾い上げ、そして振盪フラスコにおけるL-ソルボースからの2-KLGを産生する改良された能力について試験した。Ａ．純粋培養振盪フラスコ発酵におけるNRRL B-21627および変異誘導体による L-ソルボースからの2-KLGの産生。各試験した株について、0.1mLの凍結培養物を、20mLの種培地Ｋ（表５）を含む250mLバッフルフラスコに接種し、次いで30℃にて24時間240rpmにてインキュベートした。2mLの種内容物を使用して、250mLバッフル振盪フラスコ中25mLの発酵培地Ｍ（表９）を接種し、そしてフラスコを、72時間30℃にて240rpmで振盪した。2-KLG産物を、HPLCによってアッセイした（表８）。表８：振盪フラスコにおける純粋培養によるL-ソルボースからの2-KLG産生 ^*株はCM2-S寒天培地上で選択した。Ｂ：純粋培養発酵槽におけるNRRL B-21627および変異誘導体によるL-ソルボースからの2-KLGの産生。各株について、35mLの種培地Ｎ（表９）を含む250mLバッフルフラスコを、0.2 mLの凍結培養物で接種し、次いで30℃にて240rpm、24時間インキュベートした。 35mLの種内容物を使用して、1.5L Applikon発酵槽中の700mLの発酵培地Ｏ（表９）を接種した。発酵を、以下の制御条件下で72時間行った：32℃、1000rpm、21 ％NH₄OHを用いて調整したpH6.3、1500mL/分の通気。2-KLG産物を、HPLCによってアッセイした（表10）。表９：実施例４および５において使用した培地表10：発酵槽における純粋培養によるL-ソルボースからの2-KLG産生＊モル収率％は、2-KLGとして見いだされた消費されたL-ソルボースのモル％をいう。実施例６：ADM 86-96（NRRL B-21630）および第２の微生物からなる混合培養による発酵槽におけるD-ソルビトールからの2-KLG産生 ADM 86-96（NRRL B-21630）株（NRRL B-21627の変異改変体）を、D-ソルビトールからL-ソルボースに転化する能力を有する第２の生物の存在下で培養した。 50mLの種培地Ｐ（表12）を含む500mLバッフルフラスコを、0.2mLのADM 86-96株の凍結培養物、および第２の微生物として同容量のADM 29-121（IFO 3293株の改変体）またはATCC 621のいずれかで接種した。フラスコを、240rpm、30℃にて24 時間振盪した。種内容物を使用して、1.5L Applikon発酵槽中の700mLの発酵培地Ｑ（表12）を接種した。発酵を、以下の制御条件下で43〜70時間行った：30℃、 800rpmの撹拌速度、1.8VVMの通気、17％NH₄OHを用いて6.0でpHを維持した。結果を表11に示す。表11：発酵槽における混合株培養によるD-ソルビトールからの2-KLG産生 ^*g 2-KLG産生／（g D-ソルビトール-g残留L-ソルボース）表12：実施例６に使用した培地

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者エディントン，ジョンエム. アメリカ合衆国イリノイ 62521―4137, デカトゥール，ノーウッドドライブ 36 (72)発明者ヤン，ユーキンアメリカ合衆国イリノイ 62521，デカトゥール，ウィロウブルックレーン 4661

Claims

【特許請求の範囲】１．2-ケト-L-グロン酸（gulonic acid）の産生のための方法であって、L-ソルボースを含む培地において、該L-ソルボースが2-ケト-L−グロン酸に転化されるのに十分な時間、微生物株NRRL B-21627またはその変異体もしくは改変体を培養する工程；および該2-ケト-L-グロン酸を回収する工程を包含する、方法。２．前記NRRL B-21627株の変異体または改変体が、純粋培養において、L-ソルボースから少なくとも約40g/Lの2-ケト-L-グロン酸を産生し得る、請求項１に記載の方法。３．前記2-ケト-L-グロン酸をアスコルビン酸またはその塩に転化する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。４．前記培養工程が約5.0〜8.0のpHで行われる、請求項１に記載の方法。５．前記培養工程が約22℃〜約35℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。６．前記微生物が純粋培養において培養される、請求項１に記載の方法。７．前記微生物が、少なくとも１つのさらなる微生物株との混合培養において培養される、請求項１に記載の方法。８．前記さらなる微生物株が、Aureobacterium、Corynebacterium、Bacillus、B revibacterium、Pseudomonas、Proteus、Enterobacter、Citrobacter、Erwinia 、Xanthomonas、およびFlavobacteriumからなる群より選択される属のメンバーである、請求項７に記載の方法。９．前記さらなる微生物株がCorynebacterium glutamicumである、請求項８に記載の方法。１０．前記Corynebacterium glutamicumがATCC 21544株である、請求項９に記載の方法。１１．前記L-ソルボースが、D-ソルビトールの発酵転化によって作製される、請求項１に記載の方法。１２．前記L-ソルボースが、Guluconobacter oxydansを用いるD-ソルビトールの発酵転化によって作製される、請求項１１に記載の方法。１３．前記Guluconobacter oxydansが、ATCC 621株もしくはIFO 3293株またはその変異体である、請求項１２に記載の方法。１４．前記微生物が、2-ケト-L-グロン酸またはその化学誘導体もしくは分解産物による増殖阻害に抵抗する、請求項１に記載の方法。１５．前記微生物株がNRRL B-21630である、請求項１に記載の方法。１６．2-ケト-L-グロン酸の産生のための方法であって、D-ソルビトールを含む培地において、D-ソルビトールをL-ソルボースに転化し得る微生物株との混合培養において、該D-ソルビトールが2-ケト-L−グロン酸に転化されるのに十分な時間、微生物株NRRL B-21627またはその変異体もしくは改変体を培養する工程；および該2-ケト-L-グロン酸を回収する工程を包含する、方法。１７．前記さらなる微生物株が、Guluconobacter属またはAcetobacter属のメンバーである、請求項１６に記載の方法。１８．前記さらなる微生物株が、Guluconobacter oxydans ATCC 621もしくはGul uconobacter oxydans IFO 3293またはその変異体もしくは改変体である、請求項１７に記載の方法。１９．微生物株NRRL B-21627またはその変異体もしくは改変体の生物学的に純粋な培養物。２０．前記変異体がNRRL B-21630株である、請求項１９に記載の生物学的に純粋な培養物。２１．L-ソルボースからの2-KLGの改良された産生を有する微生物株を産生するための方法であって、増殖阻害量の2-KLGの誘導体またはアナログの存在下で、L -ソルボースから2-KLGを産生し得る株の細胞を培養する工程；および該2-KLGの誘導体またはアナログの存在下で増殖し得る細胞を回収する工程を包含する、方法。