CN1246145A - 发酵制备氧化物的方法 - Google Patents
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Abstract
制备氧化物的方法,所述方法包括培养葡糖杆菌属、醋杆菌属、假葡糖杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、或欧文氏杆菌属的微生物菌株以氧化培养基中的底物,培养基中同时加入非底物的可同化碳源。上述方法有利于增加培养基中底物的氧化速率,减少发酵时间,提高发酵产量,降低副产物的百分率。
Description
技术领域
本发明涉及制备氧化物的方法，所述方法包括培养选自葡糖杆菌属、醋杆菌属、假葡糖杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、或欧文氏杆菌属的微生物，从而氧化培养基中的底物。
更具体地说，本发明涉及制备氧化物的方法，所述方法包括培养葡糖杆菌属、醋杆菌属、假葡糖杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、或欧文氏杆菌属的微生物菌株以氧化培养基中的底物，其特征在于在所述培养基中加入可同化的碳源，例如多元醇(例如糖、糖醇、或甘油)，本发明还涉及通过实施上述方法得到的培养基，以及纯化所述培养基得到的氧化物。
背景技术
葡糖杆菌属、醋杆菌属、假葡糖杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、或欧文氏杆菌属微生物的很多菌株具有部分氧化各种底物的能力，所述底物如葡萄糖、果糖、核糖、山梨糖等单糖，麦芽糖、蔗糖等寡糖，山梨醇、甘露醇、核糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇等糖醇，或者如甘油和乙醇等醇类，并且它们已经被用于制备有用的氧化物，例如山梨糖、2-酮-L-古洛糖酸、乙酸等。关于这项由底物制备氧化物的微生物学技术，为改善转化量已进行了很多研究。为实现这一目的，已经进行了很多尝试，例如改良微生物(日本公开特许S62-275692，WO95/23220)和改良培养方法(日本公开特许H7-227292)。
在目前已知的开发葡糖杆菌属、醋杆菌属、假葡糖杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、或欧文氏杆菌属微生物以氧化底物的方法中，添加微生物生长必要的碳源的常规方法包括：在开始培养时单独添加底物，或者与底物一起添加不同于底物的碳源。单独添加底物的实施方式存在缺点，即微生物的生长速率低，并且该趋势在底物转化效能显著增强的微生物菌株中表现特别明显。为克服上述缺点，在开始培养时与碳源一起加入另一种不同的碳源有助于改善生长速率，但是导致底物化合物转化的特异性降低，更谈不上增加副产品形成的问题。本发明的目的在于提供一种提高培养基中促进微生物生长的底物化合物的氧化速度，从而降低发酵时间，增加发酵产量，以及降低副产物形成速率的方法。
发明内容
本发明的发明人在深入研究本领域上述现状之后发现，在培养基中培养葡糖杆菌属、醋杆菌属、假葡糖杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、或欧文氏杆菌属微生物以氧化加入所述培养基的底物，从而得到目的氧化物，除底物之外还在培养基中加入所述微生物的可同化碳源，例如多元醇(例如糖、糖醇、或者甘油)，可以提高底物氧化速率、降低发酵时间、以及提高发酵产量。本发明在上述发现的基础上得以发展。
因此，本发明涉及制备氧化物的方法，所述方法包括培养选自葡糖杆菌属、醋杆菌属、假葡糖杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、或欧文氏杆菌属的微生物以氧化培养基中的底物，其特征在于培养过程中在所述培养基中加入可同化的碳源。
本发明使用的葡糖杆菌属、醋杆菌属、假葡糖杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、或欧文氏杆菌属微生物，可以是能够氧化底物化合物得到目的氧化物的任何微生物菌株，但是优选在底物氧化为目的氧化物时具有高转化效能的微生物菌株。这类具有高转化效能的微生物涉及大量产生相关转化酶系统的菌株，能够合成高转化效能酶系统的菌株，目的氧化物分解活性有缺陷的菌株，将底物同化为单一碳源的能力减弱的菌株。例如，当山梨醇用作制备目的氧化物山梨糖或2-酮-L-古洛糖酸的底物时，或者当山梨糖用作制备目的氧化物2-酮-L-古洛糖酸的底物时，优选使用葡糖杆菌属或假葡糖杆菌属微生物将具有优势，特别优选的是葡糖杆菌属微生物。这类微生物菌株的例子包括属于氧化葡糖杆菌的氧化葡糖杆菌GA-1(FERM BP-4522)，氧化葡糖杆菌N952(FERM BP-4580)(二者均参见WO95/23220)，氧化葡糖杆菌GO-10(FERM BP-1169)，氧化葡糖杆菌GO-14(FERMBP-1170)(二者均参见日本公开特许S62-275692)，氧化葡糖杆菌UV-10(FERM P-8422)，氧化葡糖杆菌E-1(FERM P-8353)，以及属于假葡糖杆菌属的假葡糖杆菌K591s(FERM BP-1130)，假葡糖杆菌12-5(FERM BP-1129)，假葡糖杆菌TH14-86(FERM BP-1128)，假葡糖杆菌12-15(FERM BP-1132)，假葡糖杆菌12-4(FERM BP-1131)，和假葡糖杆菌22-3(FERM BP-1133)。
本发明实施过程中使用的培养方法可以按照微生物菌株、底物化合物、以及目的化合物，以及其它因素适当地选择，可以使用已知的培养方法，例如振荡培养或浸没通气培养。
本发明方法中可以使用的底物包括单糖例如葡萄糖、果糖、核糖、山梨糖等，寡糖例如麦芽糖、蔗糖等，糖醇例如山梨醇、甘露醇、核糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇等，以及醇类例如甘油和乙醇。底物的加入量随微生物菌株的种类、培养方法、底物的种类而改变，但是通常加入量为培养基的1-50％，优选3-20％。
可同化碳源的种类没有特别限制，只要微生物能够同化所述底物即可。如果，例如，微生物菌株是能够作用于山梨醇或山梨糖以制备山梨糖或2-酮-L-古洛糖酸的菌株，所述碳源可以选自糖(例如蔗糖、麦芽糖等寡糖和葡萄糖、果糖等单糖)，糖醇(例如山梨醇、甘露醇、木糖醇等)，和多元醇例如甘油。在这类多元醇中，特别优选甘油，因为它对于提高转化效能和转化速率，以及降低不完全代谢产物量能够发挥很大作用。
所述碳源的量随微生物菌株的种类、培养方法、碳源、底物化合物、和底物化合物的量而改变，但是范围可以为底物量的1到100％，优选10-50％。
添加所述碳源的方式随微生物菌株的种类、培养方法、碳源和底物而改变，但是它可以在培养过程中添加。更具体地说，添加所述碳源的时间可以在培养开始后的一段时间，连续地或间歇地添加预定量或按照发酵进程添加所述碳源。
本发明可以通过以下方式有效地进行，添加例如酵母提取物、干酵母、玉米浸提液等天然有机营养物作为除所述底物和碳源之外的辅助营养物，以便加速微生物的生长，并维持足够的转化活性。
通过实施本发明制备的目的氧化物，可以按照氧化物的种类采用本领域普通技术人员已知的方法收获和纯化。它也可以以盐(例如钠盐或钙盐)的形式分离。分离可以采用，例如加入或不加活性炭过滤或离心培养基以除去细胞，然后将液体部分浓缩结晶，吸附于树脂上，层析分离，脱盐等，所述方法可单次使用，适当组合使用或重复使用。
本发明提供了一种经济有效地工业化生产氧化物的方法，包括在培养基中培养葡糖杆菌属、醋杆菌属、假葡糖杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、或欧文氏杆菌属的微生物，以氧化培养基中的底物，该方法能够加快氧化速率，降低发酵时间，并且提高发酵产量。
实施例1
将0.5ml液氮保存的氧化葡糖杆菌N952(FERM BP-4580)，氧化葡糖杆菌的转化体(WO95/23220)接种到装有50ml培养基的500ml摇瓶中，所述培养基含有0.5％葡萄糖、5％山梨糖醇、1.5％玉米浸提液、和0.15％硫酸镁，于30℃培养24小时。将部分该培养物(17ml)转移到装有与上述组成相同的17L无菌培养基的30L发酵罐中，30℃培养20小时。将2L该种子培养物转移到含17L培养基(含有15％山梨糖醇、2％玉米浸提液、0.3％酵母提取物、0.5％硫酸镁、和0.5％碳酸钙)的30L发酵罐中，32℃培养70小时。培养过程中，前24小时培养基pH值控制在5.5，然后加入氢氧化钠水溶液，控制培养基pH值为6.5直到完成发酵，通过喷雾搅拌使溶解氧维持在10％或更高。由此获得的培养肉汤作为对照。同时，培养同样的微生物菌株，在开始培养后13.5小时起连续添加相当于终培养基6％的甘油直到完成发酵(培养开始后70小时)，其余培养条件相同。添加甘油的实验中，在开始培养后70小时山梨糖醇转化为2-酮-L-古洛糖酸的效能为41.3％，与未添加甘油的对照实验(24.8％)相比，证明有显著效果。实施例2
用氧化葡糖杆菌HS17[亚硝基胍诱导氧化葡糖杆菌NB6939-pSDH-tufB1(WO95/23220)突变，以增强山梨糖醇转化为2-酮-L-古洛糖酸的效能]代替氧化葡糖杆菌N952，其余重复实施例1的培养条件。从培养开始后13小时，开始添加相当于终培养基6％的甘油，直到培养开始后72小时。在对照实验中，培养开始前一次性加入相当于终培养基6％的甘油。测定山梨糖醇转化为2-酮-L-古洛糖酸的效能，并分别比较培养开始后24、48、56、72小时实验组与对照培养基的转化效能。结果如表1所示。
表1
*ND：未测量
| 24小时之后 | 48小时之后 | 56小时之后 | 72小时之后 | |
| 培养开始前一次性添加 | 22％ | 42％ | 45％ | ND* |
| 从13小时到24，48，56，或72小时添加 | 25％ | 74％ | 85％ | 90％ |
Claims (9)
1.制备氧化物的方法，所述方法包括培养选自葡糖杆菌属、醋杆菌属、假葡糖杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、或欧文氏杆菌属的微生物，以氧化培养基中的底物，其特征在于在所述培养基中加入可同化碳源。
2.按照权利要求1的制备氧化物的方法，其中可同化碳源为多元醇。
3.按照权利要求1的制备氧化物的方法，其中可同化碳源选自甘油、单糖和糖醇。
4.按照权利要求1的制备氧化物的方法，其中可同化碳源为甘油。
5.按照权利要求1到4的任一项制备氧化物的方法，其中培养基中的底物为山梨醇或山梨糖。
6.按照权利要求1至5的任一项制备氧化物的方法，其中氧化物为2-酮-L-古洛糖酸。
7.按照权利要求1至6的任一项制备氧化物的方法，其中微生物为氧化葡糖杆菌。
8.由权利要求1至7的任一项方法得到的培养基。
9.纯化权利要求8的培养基得到的氧化物。
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