KR100924904B1

KR100924904B1 - 글리세롤을 포함한 탄소원을 이용할 수 있는코리네박테리아 및 이를 이용하여 발효산물을 생산하는방법

Info

Publication number: KR100924904B1
Application number: KR1020070118455A
Authority: KR
Inventors: 주재영; 배현애; 김효진; 장진숙
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2007-11-20
Filing date: 2007-11-20
Publication date: 2009-11-02
Also published as: KR20090051970A; WO2009066927A1; EP2260104A4; DE112008003111T5; DE112008003111B4; EP2260104A1

Abstract

본 발명은 글리세롤을 포함한 다양한 탄소원을 이용할 수 있는 코리네박테리아 및 이를 이용한 발효산물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 발효산물을 고수율 및 고생산성으로 생산할 수 있는, 글리세롤 이용 관련한 외래의 glpDFK 유전자가 도입된 코리네박테리아를 이용하여 발효를 수행함으로써, 상업적으로 유용한 아미노산을 배지상에 축적하여 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.

코리네박테리아, 글리세롤, glpDFK 유전자, 발효

Description

글리세롤을 포함한 탄소원을 이용할 수 있는 코리네박테리아 및 이를 이용하여 발효산물을 생산하는 방법{CORYNEBACTERIA USING CARBON SOURCES CONTAINING GLYCEROL AND PROCESS FOR PRODUCING FERMENTATION PRODUCT USING THEM}

본 발명은 글리세롤 (glycerol) 이용성이 없는 코리네박테리아에 글리세롤 이용 유전자인 glpDFK 오페론을 도입하여 글리세롤 이용성이 부여된 코리네박테리아에 관한 것이다. 또한, 상기 코리네박테리아를 이용하여 글리세롤을 포함한 다양한 탄소원으로부터 발효산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근 석유 등의 천연자원의 사용량 증가 등으로 인한 고유가 및 이의 사용으로 인한 공해 등의 문제를 해결하기 위하여, 자연계의 재생 가능한 물질을 이용한 대체 에너지 개발이 주목 받고있다. 이중 가장 주목 받는 것은 발효를 통해 얻어지는 바이오에탄올 (bioethanol)과 식물유래 오일에서 얻어지는 바이오디젤 (biodiesel)이다. 바이오디젤은 주로 식물 유래의 오일을 기질로 하여 메탄올 (methanol)과 촉매를 이용한 에스테르 형성반응 (esterification)을 통해 합성된 지방산 메틸에스테르 혹은 지방산 에틸에스테르를 일컫는다. 이 과정에서 필연적으로 전체 무게의 10% 정도의 비율로 글리세롤이 부산물로서 형성되게 된다.

글리세롤은 C₃H₈O₃로 C₆H₁₂O₆인 글루코오스에 비하여 1단계 환원된 물질로서 미생물의 대사 과정상에서 보다 향상된 정도로 환원력을 제공할 수 있다. 발효를 통하여 생산되는 많은 물질이 그 대사과정에서 환원력을 요구하는 경우가 많기 때문에 글리세롤을 기질로서 효과적으로 이용할 수 있다면, 수율 및 생산성에 있어 향상을 가져올 수 있다. 그러나, 이러한 특성에도 불구하고 현재까지 글리세롤을 이용하여 연구된 경우는 로이터린 (reuterin, 참조: Talarico et. al., Antimicrob. Agents Chemother., 32:1854-1858 (1988)), 2,3-부탄디올 (2,3-butanediol, 참조: Biebl, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 50:24-29 (1998)), 1,3-프로판디올 (1,3-propanediol, 참조: Menzel, et. al., Enzyme Microb. Technol., 20:82-86 (1997)), 숙신산 (대한민국 등록특허 제0313134호), 이타콘산 (Itaconic acid, 참조 미국 등록특허 제 5,457,040호), 3-히드록시프로판알데히드 (3-hydroxypropanaldehyde, 참조: Doleyres et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68(4):467-474 (2005)), 프로피온산(propionic acid, 참조: Himmi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 53:435-440 (2000))에 한정되어 있었다. 이러한 이유는 기존 발효 산업에서 효과적으로 이용되었던 탄소원에 비하여 글리세롤이 고가였기 때문이다. 오히려, 발효를 통해 글리세롤을 생산하는 연구가 진행되었다 (Wang et al., Biotechnol. Adv., 19(3):201-223 (2001)).

그러나, 현재는 바이오 디젤의 생산량이 늘어남으로써 글리세롤의 생산량이 늘고 따라서, 가격이 하락하고 있는 실정이다. 이러한 점에 근거하여 최근 글리세 롤을 포함하는 바이오디젤의 부산물을 이용하여 1,3-프로판디올 (Gonzalez-Pajuelo et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31:442-446, (2004)) 및 수소 및 에탄올을 생산하는 경우 (Ito et al., J. Biosci. Bioeng., 100(3):260-265 (2005))가 보고되었으나, 대표적인 발효제품인 아미노산 및 주요한 대사 산물을 생산하는 경우에는 아직 그 예를 찾을 수 없다.

지금까지 글리세롤은 비누 제조업, 지방산 제조업, 왁스 및 계면활성제 생산 제조업 등에서 생산되었으나, 상기한 바와 같이 바이오디젤의 생산량이 급증함에 따라 부산물인 글리세롤의 생산도 늘어나며 글리세롤을 포함하고 있는 부산물을 효과적으로 처리하는 문제가 발생할 것이다. 또한, 정제된 글리세롤의 경우도 가격이 급락할 것으로 예상된다. 따라서, 글리세롤을 이용하여 효과적으로 발효에 의해 유용한 화학 물질을 생산할 수 있다면 많은 부속 효과를 가져 올 수 있다.

미생물의 글리세롤 이용은 대장균 (Escherichia coli)과 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)에서 잘 알려져 있다. 대장균에 있어, 세포 외부의 글리세롤은 에너지의 소모 없이 수분 뿐만 아니라 글리세롤과 요소에 대한 투과성을 가지는 아쿠아글리세로포린 (aquaglyceroporin)의 하나인 GlpF를 이용하여 세포 안으로 들어오게 된다 (Heller et al., J. Bacteriol. 144:274-278, (1980)). 들어온 글리세롤은 글리세롤 키나아제 (glycerol kinase, GlpK)에 의하여 글리세롤-3-인산으로 전환된 후, 글리세롤-3-인산 디히드로게나제 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)에 의해 디히드록시아세톤인산 (dihydroxyacetonephosphate, DHAP)로 전환되고 트리오스 인산 이소머라제 (Triosephosphate isomerase, TpiA) 에 의하여 글리세르알데히드-3-인산 (glyceraldehyde-3-phosphate, G-3-P)으로 전환되어 해당과정을 거쳐 대사되게 된다 (Lin EC, Annu. Rev. Microbiol. 30:535-578, (1976)). 글리세롤 키나아제의 활성이 없는 경우에 있어서는 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase, Gdh)에 의하여 디히드록시아세톤 (dihydroxyacetone, DHA)으로 전환된 후, 글리세롤 키나아제나 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kianse, DHA kinase)에 의해 디히드록시아세톤 포스페이트 (dihydroxyacetone phosphate: DHAP)로 전환된 후, 글리세르알데히드-3-인산 (glyceraldehyde-3-phosphate: G-3-P)로 전환되어 대사된다 (Paulsen et al., Microbiology, 146:2343-2344, (2000)). 이러한 글리세롤의 대사과정은 다양한 형태로 조절을 받는다. 특히 글리세롤이 글루코스와 같이 존재하는 경우, 야생형의 대장균은 배타적으로 글루코스만을 이용한 후 글리세롤을 이용하는 이단계 적응 (diauxic growth)을 하는 것으로 알려져 있다 (Lin, Annu. Rev. Microbiol. 30:535-578, (1976)).

코리네박테리움속에 속하는 미생물은 산업적으로 널리 이용되는 미생물이 많은데 그 중 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)은 라이신, 글루탐산나트륨과 같은 아미노산의 생산에 이용되며, 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes)는 핵산 등의 발효 생산에 이용되는 균주이다. 코리네박테리아의 경우 발효 탄소원으로서 포도당, 원당등 다양한 탄소원을 이용할 수 있음이 알려져 있으며, xylAB와 같은 유전자 도입을 통해 자일로스 (xylose) 이용성을 부여한 경우도 알려져 있다 (Kawaguchi et al., Appl. Envion. Microbiol. 72(5):3418-3428 (2006)).

코리네박테리움속에 속하는 미생물중 4종의 미생물에 대하여 전체 게놈 서열이 알려져 있다. 이들에 있어 유일하게 코리네박테리움 디프테리애 (Corynebacterium diphtheriae)에 있어서만 완결된 글리세롤 이용 유전자를 찾을 수 있었고, 다른 3종의 코리네박테리움인 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 에피시언스 (Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 제이키움 (Corynebacterium jeikeium) 등은 글리세롤 이용하는데 관여하는 GlpF 등이 결핍되어 있음을 알 수 있었으며, 이러한 유전자의 결손이 코리네박테리아가 글리세롤을 효과적으로 이용하는데 있어 장애임을 알 수 있다.

코리네박테리움 디프테리애의 완결된 글리세롤 이용 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰에 도입하여 탄소원으로써 글리세롤을 이용한 예가 있으며 (대한민국 특허출원 2006-057633), 글루탐산과 라이신 생산에 이용된 경우도 있다 (대한민국 특허출원 10-2007-007513).

그러나 코리네박테리움 디프테리애는 바이오 안전 수준 (BSL, Biosafety Level) 2에 해당하는 병원성 세균이므로, 코리네박테리움 디프테리애 유전자를 발효 산업에 이용하는 데는 많은 제약이 따른다. 이러한 문제를 해결하고자 연구를 계속 수행하던 중 코리네박테리움 디프테리애 외에도 완결된 글리세롤 이용 유전자를 포함하는 다양한 균주를 발견할 수 있었다. 그 중에서도 브레비박테리움 린넨스 (Brevibacterium linens)를 포함한 브레비박테리움 속에서도 찾을 수 있었다. 특히 유전자의 교잡실험 결과 코리네박테리움과 브레비박테리움은 유전자 특이성이 유사 하므로, 최근에 이들을 하나의 균종으로 통합하려는 움직임이 알려져 있다 (Liebl, Eikman 등 1991).

상기 언급한 바와 같이 바이오디젤의 부산물로서 얻어지는 글리세롤을 탄소원으로 효과적으로 이용할 경우, 상당한 부가가치를 얻을 수 있다. 본 발명자들은 이러한 사실에 근거하여, 산업적으로 효용가치가 높은 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 암모니아게네스 등의 코리네박테리아의 글리세롤 이용 가능성에 대하여 집중적으로 연구를 수행하던 중, 코리네박테리아에 외래의 글리세롤 이용 유전자를 도입함으로써 코리네박테리아의 글리세롤 이용성을 획기적으로 개선할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 주요한 목적은 코리네박테리아에서 글리세롤 자화성을 획기적으로 개선할 수 있도록 하는 코리네박테리움의 근연종인 브레비박테리움 유래의 글리세롤 이용 관련 오페론을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 글리세롤을 단독으로 혹은 다른 탄소원과 함께 효과적으로 이용할 수 있는 코리네박테리아 유래의 변이체를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 코리네박테리아 변이체가 탄소원의 일부 또는 전부로 글리세롤을 포함하는 탄소원을 이용함으로써 발효를 통해 발효산물을 생산하는 방법을 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 코리네박테리아에서 글리세롤 자화성을 획기적으로 개선할 수 있도록 하는 글리세롤 이용 관련 오페론을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 글리세롤 이용 관련 오페론의 변이체를 제공한다.

본 발명에 있어 글리세롤 이용 관련 유전자는 브레비박테리움 린넨스로부터 유래된 글리세롤 유입 촉진자 단백질(Glycerol uptake facilitator protein)을 코딩하는 유전자 (이하 glpF로 약칭한다), ATP를 이용하여 인산화함으로써 글리세롤-3-인산을 생산하는 효소인 글리세롤 키나아제 (glycerol kinase)를 코딩하는 유전자 (이하 glpK로 약칭한다) 및 글리세롤-3-인산을 산화하여 디히드록시아세톤-3-인산을 생산하는 효소인 글리세롤-3-인산 디히드로게나아제 (glycerol-3-phosphodihydrogenase)를 코딩하는 유전자 (이하 glpD로 약칭한다)를 말한다.

상기 글리세롤 이용 관련 유전자는 미생물 외부의 글리세롤을 미생물 내부로 들어오도록 하고, 이를 인산화하여 글리세롤-3-인산으로 전환한 후, 이를 디히드록시아세톤-3-인산으로 전환하여 최종적으로 해당과정의 중간 물질인 글리세르알데히드-3-인산으로 전환하여 대사할 수 있도록 하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로서 코리네박테리아에서 작동하는 것이면 어느것이라도 포함된다.

상기의 글리세롤 이용 관련 유전자의 예는 동물, 식물, 미생물에서 유래한 유전자를 포함한다. 보다 바람직한 예로서는 미생물에서 유래한 유전자가 포함되며, 보다 더 바람직한 상기 유전자의 예로서 브레비박테리움 린넨스 BL2 로부터 얻어지는 유전자(Brevibacterium linens BL2, 진뱅크 허가번호 NZ_AAGP00000000; 서열번호 7)가 포함된다. 가장 바람직한 유전자의 예는 브레비박테리움 린넨스 BL2의 glpDFK의 염기서열에 변이가 있는 염기서열 3에 해당하는 유전자가 포함된다.

본 발명은 또한 글리세롤을 단독으로 또는 다른 탄소원과 함께 효과적으로 이용하는 코리네박테리아 유래의 변이체를 제공한다.

본 발명에 있어 사용되는 균주는 글리세롤을 효과적으로 이용하기 위하여 포도당과 글리세롤을 동시에 소모하여 성장할 수 있다. 상기한 바와 같이 포도당과 글리세롤을 탄소원으로서 동시에 이용할 수 있는 경우, 야생형의 대장균등은 배타적으로 포도당만을 이용하고, 포도당이 다 이용된 후 글리세롤을 이용하는 다이옥시(diauxy) 현상을 보이게 된다. 따라서, 글리세롤을 포함하는 복합탄소원이 공급될 때, 발효 효율이 감소하게 된다.

이를 극복하기 위하여 본 발명자들은 상기 균주에 대하여 글리세롤과 포도당의 동시 이용가능성을 탐색하였고, 브레비박테리움 유래의 글리세롤 이용 유전자를 상기 균주에 도입함으로써 글리세롤 및 다른 탄소원을 함께 효과적으로 사용 가능함을 알 수 있었다.

하나의 양태로서, 본 발명은 브레비박테리움 린넨스로부터 얻어진 글리세롤 이용 관련 단백질인 GlpD (진뱅크 허가번호 NP_00380226.1; 서열번호 4), GlpF (진뱅크 허가번호 NP_00380225.1; 서열번호 5) GlpK (진뱅크 허가 번호 NP_00380224.1; 서열번호 6) 를 코딩하는 유전자를 포함하는 미생물을 제공한다. 상기 유전자는 당업계에 통상적으로 알려진 방법을 통하여 코리네박테리아를 형질전환 할 수 있으며, 구체적으로는 glpDFK 오페론(서열번호 3)이 포함된 벡터로 형질전환되어 글리세롤이 단독으로 또는 다른 탄소원과 함께 포함된 탄소원을 효과적으로 이용하여 아미노산을 생산할 수 있는 코리네박테리움 변이체를 제공한다.

본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 대장균-코리네박테리움 셔틀벡터인 pECCG117 벡터 (Biotechnol. Lett. 13(10):721-726 (1991))를 사용할 수 있다.

본 명세서에 있어 "형질전환"이란 용어는 유전자를 숙주세포내에 도입하여 숙주세포내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 유전자는 숙주세포내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체내에 삽입 된 것이던 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 어느 것이든지 포함된다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주세포내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트 (expression cassette) 의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 발명에 있어 글리세롤을 이용하여 유용한 물질을 효과적으로 생산하기 위해 글리세롤 이용 관련 유전자로 형질전환된 미생물은 코리네박테리에과 (Corynebacteriaceae)에 포함되는 미생물을 들 수 있으며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 (Corynebacterium)속에 속하는 미생물이다. 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 (예. ATCC13032), 코리네박테리움 암모니아게네스 (예. ATCC 6872), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum) (예. ATCC13869), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum) (예. ATCC14067), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes) (예. FERM-BP1539), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens) (예. C. efficiens str. YS-314) 등으로 이루어지는 종의 군으로부터 선택되는 미생물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기의 종으로부터 아미노산이나 핵산과 같은 유용한 물질을 생산하는 미생물, 예를 들어 글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 SM5, 라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 CF 905 (KFCC-10881)나 코리네박테리아 글루타미쿰 CgGB3이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 브레비박테리움 린넨스의 glpDFK 유전자를 대장균-코리네박테리움 셔틀벡터인 pECCG117로 클로닝하여 코리네박테리아 글루타미쿰 CgGB3에 형질전환 하였으며, 제작된 균주를 코리네박테리아 글루타미쿰 C003-0011 (KCCM10886P)로 명명하였다.

본 발명은 또한 상기 코리네박테리아가 글리세롤을 단독으로 또는 다른 탄소원과 함께 포함하는 탄소원을 이용하여 발효를 통해 발효산물을 생산하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는, 글리세롤을 이용 가능하게 하는 유전자 조합인 서열번호 3의 염기서열을 갖는 glpDFK 오페론을 포함하는 벡터로 코리네박테리아를 형질전환하는 단계; 상기 형질전환된 코리네박테리아를 탄소원으로서 탄소원의 일부 또는 전부로 글리세롤이 포함된 배양배지에 접종하여 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 발효산물을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 글리세롤을 탄소원으로 코리네박테리아를 이용하여 발효산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 유용 물질을 생산하는 방법에서, 상기 미생물의 배양과정은 당 업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들면, "Biochemical Engineering(by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)"에 개시되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 본 발명에서 사용되는 배지는 글리세롤을 탄소원으로서 단독으로 혹은 다른 탄소원과 함께 포함한다. 그 외의 적정량의 탄소원은 다양하게 이용될 수 있다. 특히 바람직한 탄소원은 포도당이다. 사용될 수 있는 질소원의 예는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포생성을 억제 할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물내로 산소 또는 산소-함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소, 또는 이산화탄소 가스를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

앞서 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 바이오 디젤의 부산물인 글리세롤을 이용하여 효과적으로 유용한 물질을 높은 효율로 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 미생물은 글리세롤이 포함된 복합탄소원을 포함한 배지 및 글리세롤을 단독으로 포함한 배지에서 효과적으로 유용한 물질을 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 미생물을 기반한 다른 유용물질을 생산하는 미생물은 효과적으로 글리세롤을 탄소원으로 이용하여 발효할 수 있다.

실시예 1: 코리네박테리아에서 작동할 수 있는 글리세롤 이용관련 유전자의 탐색 및 클로닝

브레비박테리움 린넨스의 글리세롤 이용 관련 유전자의 염기서열은 이미 명백하게 밝혀져 있으며 공개되어 있다. 미국 국립보건원 진뱅크 (NIH GeneBank)로부터 브레비박테리움 린넨스의 글리세롤 이용 관련 유전자인, GlpF, GlpK, GlpD 를 코딩하는 유전자 및 주변 염기서열에 대한 정보를 획득하였다. 브레비박테리움 린넨스의 GlpF 진뱅크 허가 번호는 ZP_00380225.1, GlpK의 진뱅크 허가 번호는 ZP_00380224.1, GlpD의 진뱅크 허가번호는 ZP_00380226.1 이었다. 각각의 유전자들은 게놈상에서 연속적으로 존재하였으며, 이를 이용하여 각각 한차례의 PCR법을 통하여 각각 3종의 유전자 전부를 단일 폴리뉴클레오티드로 증폭하였다. 브레비박테리움 린넨스의 글리세롤 이용 관련 유전자의 PCR법을 통한 증폭에는 서열 번호 1과 2의 프라이머가 사용되었다. 서열번호 1의 프라이머는 제한 효소XbaI 부위를 가지고 있으며, 서열번호 2의 프라이머는 PstI 부위를 가지고 있다.

서열 번호 1: 5' ACTCTAGACGCTGCGTGAAGGCATCA 3'

서열 번호 2: 5' AACTGCAGCGTTGGAAGACGAGCTGC 3'

브레비박테리움 린넨스의 글리세롤 이용 관련 유전자 증폭을 위하여 브레비박테리움 린넨스의 염색체를 생물자원센터 (American Type Culture Collection)으 로부터 구매하였다 (ATCC 인증번호 9175D). 브레비박테리움 린넨스의 염색체를 주형으로 하여 PCR법을 통해 글리세롤 이용 관련 유전자를 증폭하였다. PCR법의 조건은 94 도에서 3분간 변성 후, 94도 30초 변성, 56도 30초 어닐링, 72도 4분 30초 중합을 25회 반복한 후, 72도에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 4574 bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 얻어진 폴리뉴클레오티드를 TOPO TA Cloning kit (Invitrogen 사)를 이용하여 pCR2.1에 클로닝하였다.

실시예 2. 획득된 glpDFK 유전자의 염기서열 결정

얻어진 플라스미드를 제한효소인 XbaI와 PstI으로 잘라 글리세롤 이용 관련 유전자가 포함되어 있는 DNA 절편을 획득한 후, 이를 대장균-코리네박테리움 셔틀 벡터인 pECCG117로 클로닝하여 대장균 TOP10에 형질전환하였다.

통상의 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 획득된 플라스미드를 pECCG117-bli glpDFK로 명명하였다. pECCG117-bli glpDFK를 DNA 염기서열을 결정하였을 때, 252번째부터 1972번째 염기서열은 glpD 유전자 (염기서열 4), 2049번째부터 2732번째 염기서열은 glpF 유전자 (염기서열 5), 2809번째부터 4341번째 염기서열은 glpK 유전자 (염기서열 6)를 각각 코딩하며 기존의 게놈시퀀싱 결과와 다른 21개의 염기서열 변화가 있음을 확인하였다 (염기서열 3). 염기서열 변이는 표 1과 같으며 프로모터 부위의 염기서열 변이가 9개이고, glpD 부위의 변이는 11개이며, glpK 부위의 변이는 1개이다. 특히glpK 부위인 3844번째의 염기서열의 변화만이 아미노산 변이를 유발하였다. 변형된 아미노산은 glpK 영역의 346번째로 시스테인이 글라이신으로 변화한 것이다.

염기번호	염기변이	염기번호	염기변이	염기번호	염기변이
123	a -> t	215	g ->c	460	a -> g
127	t -> g	230	c -> t	505	a -> g
168	t -> a	266	t -> c	508	c -> t
195	t -> a	370	a -> t	514	t -> c
196	t -> c	394	t -> c	538	c -> g
197	c -> t	397	a -> g	1840	g -> c
200	g -> t	409	g -> t	3844	t -> g

실시예 3. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 로의 글리세롤 이용 유전자 도입

글리세롤을 이용하여 코리네박테리아의 성장이 가능한지 확인하기 위하여 발현벡터인 pECCG117-bli glpDFK를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032(야생형)에 전기펄스법을 이용하여 도입한 후, 박토 펩톤 10 g/L, 이스트 추출액 10 g/L, 비프 추출액 5 g/L, NaCl 2.5 g/L, 카나마이신 25μg/mL이 포함된 플레이트에서 배양하였다. 획득된 콜로니에 대하여 PCR 클로닝 법을 통하여, 글리세롤 이용 관련 유전자가 포함된 플라스미드를 갖고 있는 콜로니를 획득하였으며, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pECCG117-bli glpDFK로 명명하였다.

실시예 4. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 의 글리세롤 이용성 확인

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pECCG117-bli glpDFK가 글리세롤을 이용하여 성장이 가능한지를 확인하기 위하여, 우선 고체상의 LB배지에서 상기 플라스미드를 포함한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032와 포함하지 않은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 배양하였다. 이를 하기의 종배지 25 mL을 함유하는 250 mL 코너-바플 플라스크에 접종하여 30℃에서 48 시간 동안 진탕배양 (200 rpm)하였다. 배지상에 존재하는 글리세롤과 글루코오스 잔존량은 HPLC 분석을 통하여 측정되었으며, 그 결과는 아래 표 2와 같다. pECCG117-bli glpDFK가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032는 글리세롤을 이용하여 성장함을 확인 할 수 있었으나, 상기 플라스미드가 도입되지 않은 균주의 경우는 성장이 미미함을 확인 할 수 있었다.

균주	글루코오스:글리세롤 (g/L)	48 h
균주	글루코오스:글리세롤 (g/L)	OD	소비된 글루코오스 (g/L)	소비된 글리세롤 (g/L)
ATCC13032	40 : 00	65.1	40.0	-
	30 : 10	60.0	30.0	0.0
	20 : 20	48.7	20.0	0.0
	00 : 40	6.6	-	0.0
ATCC13032 with pECCG117 -bli glpDFK	40 : 00	62.6	40.0	-
	30 : 10	65.9	30.0	10.0
	20 : 20	66.2	20.0	20.0
	00 : 40	57.5	-	40.0

상기 결과에서 알 수 있듯이, pECCG117-bli glpDFK가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032경우는 배지상에 잔존하는 글루코오스와 글리세롤이 없었으나, 상기 플라스미드가 도입되지 않은 야생형 균주의 경우는 글루코오스는 잔존하지 않지만 글리세롤은 그대로 남아있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 상기 플라스미드가 도입된 균주는 도입되지 않은 균주에 비해 생육이 더 우수하며 특히 탄소원이 글리세롤만 존재하는 조건에서도 OD₆₀₀가 57.5로 도입되지 않은 경우의 6.6과 확연하게 차이가 남을 확인하였다.

따라서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032는 글리세롤 이용성이 없으나, 브레비박테리움 린넨스의 glpDFK 유전자를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pECCG117-bli glpDFK는 글리세롤을 이용하여 생육이 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 라이신 생산균주로의 글리세롤 이용 유전자 도입

글리세롤을 이용하여 코리네박테리아의 성장 아니라, 실제 유용물질 생산도 가능한지 확인하기 위하여 발현벡터인 pECCG117-bli glpDFK를 실시예 3에서 언급된 방법을 통하여 라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CgGB3에 전기펄스법을 이용하여 도입한 후, 획득된 콜로니에 대하여 PCR 클로닝 법을 통해 글리세롤 이용 관련 유전자가 포함된 플라스미드를 갖고 있는 콜로니를 획득하였다. 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 C003-0011 로 명명하였으며, 그를 2007년 10월 19일자로 대한민국 서울 특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM10886P로 기탁하였다.

실시예 6. 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 C003 -0011 (KCCM10886P)의 글리세롤을 이용한 라이신 생산

하기의 종배지 25 mL을 함유하는 250 mL 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 CgGB3와 본 발명 균주인 pECCG117-bli glpDFK를 포함하는 C003-0011 (KCCM10886P)을 각각 접종하고 30℃에서 20시간 동안 진탕배양 (200 rpm)하였다. 하기의 생산배지 24 mL 을 함유하는 250 mL 코너-바플 플라스크 1 mL의 종 배양액을 각각 접종하고 30℃에서 4일 동안 진탕배양 (200 rpm)하였다. 배양 종료 후 아미노산 분석기에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 CgGB3와 C003-0011 (KCCM10886P) 에 대한 배양물 중의 L-라이신에 대한 결과는 아래 표 3 와 같다.

균주	글루코오스:글리세롤 (g/L)	48 h
균주	글루코오스:글리세롤 (g/L)	OD	소비된 글루코스 (g/L)	소비된 글리세롤 (g/L)	Lys (g/L)
CgGB3	90 : 00	130.0	90.0	-	10.6
	70 : 20	118.2	70.0	0.0	8.5
	45 : 45	93.8	45.0	0.0	5.8
C003-0011 with pECCG117 -bli glpDFK	90 : 00	130.8	90.0	-	10.7
	70 : 20	140.4	70.0	20.0	10.6
	45 : 45	145.3	45.0	45.0	8.9

상기 결과에서 보듯이 라이신 생산균주에 글리세롤 이용성 유전자인 pECCG117-bli glpDFK를 도입하였을 경우 글리세롤을 전혀 이용하지 못하는 모균주와 달리 글리세롤 이용성을 보여주었고 라이신 생산도 증가한 것을 확인하였다.

종배지 ( pH 7.0)

포도당 40g, 펩톤 10g, 효모추출물 5g, 요소 1.5g, K₂HPO₄ 8g, MgSO₄ _·7H₂O 0.5g, 바이오틴 100 키트, 티아민 HCl 1000 키트, 칼슘-판토텐산 2000 키트, 니코틴아마이드 2000 키트 (공정수 1리터 기준)

생산배지 ( pH 7.0)

포도당 100g, (NH₄)₂SO₄ 40g, 콩 단백질 (Soy protein) 2.5g, 콘 스티프 솔리드(Corn Steep Solids) 5g, 요소 3g, KH₂PO₄ 1g, MgSO₄ _·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 키트, 티아민 염산염 1000 키트, 칼슘-판토텐산 2000 키트, 니코틴아마이드 3000 키트, CaCO₃ 30 g (공정수 1 리터 기준)

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

도 1은 glpDFK 오페론을 포함하는 재조합 플라스미드 pECCG117-bli glpDFK의 작제도이다

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Corynebacteria using carbon sources containing glycerol and process for producing fermentation product using them <130> PA07-0340 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of glpDFK <400> 1 actctagacg ctgcgtgaag gcatca 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of glpDFK <400> 2 aactgcagcg ttggaagacg agctgc 26 <210> 3 <211> 4558 <212> DNA <213> Brevibacterium linens BL2 <220> <221> mutation <222> (123) <223> a -> t <220> <221> mutation <222> (127) <223> t -> g <220> <221> mutation <222> (168) <223> t -> a <220> <221> mutation <222> (195) <223> t -> a <220> <221> mutation <222> (196) <223> t -> c <220> <221> mutation <222> (197) <223> c -> t <220> <221> mutation <222> (200) <223> g -> t <220> <221> mutation <222> (215) <223> g -> c <220> <221> mutation <222> (230) <223> c -> t <220> <221> mutation <222> (266) <223> t -> c <220> <221> mutation <222> (370) <223> a -> t <220> <221> mutation <222> (394) <223> t -> c <220> <221> mutation <222> (397) <223> a -> g <220> <221> mutation <222> (409) <223> g -> t <220> <221> mutation <222> (460) <223> a -> g <220> <221> mutation <222> (505) <223> a -> g <220> <221> mutation <222> (508) <223> c -> t <220> <221> mutation <222> (514) <223> t -> c <220> <221> mutation <222> (538) <223> c -> g <220> <221> mutation <222> (1840) <223> g -> c <220> <221> mutation <222> (3844) <223> t -> g <400> 3 cgctgcgtga aggcatcatc atgcgcaaac tcgaccttct ggactcggca gagacctcct 60 cggcgatgcg ggtcgagctg gtctgaggcc tttcgcaatc ggtctgagcc ctttcgcaat 120 tgtgcggtgt gtttcgcttc tgcgcattgc ctgttagatt tttcctaact gccgcgcacg 180 gaccaccagt tgggactggt gcgcaataat ggtgcgaacg cacacgctct gagaaggaaa 240 agaactgtca atgcgaaatg gcgagctgtc cccatcgttc cgcgatgaag ccctgcacac 300 cctggagaac accagcccgg acgatccgct cgacgtcttc gtcgtcggcg gaggcgtcac 360 cggagcaggt tccgccttcg atgcggccac ccgcgggctg aaggtcggtg tcgtcgatgc 420 caaggactgg gcttccggca cctcgtcacg gtcctcgaag ctcatgcacg gcggactgcg 480 ctacctggag atgctcgact tcaagcttgt ggccgaggcg ctgaaggaac gcgacctgct 540 gctccagcac acagcgcccc acctcgtcga acctgttgcc ttcgtcttcc ccttcgaaca 600 ccggctcatc gacagggcat tcatcggttc cggcgttctg ctctatgaca cgatggccac 660 ccgtcccgga cgcaaacgtg ccgtgccgat gcaccgccac ctgggaaaga aggcactcac 720 cgcccatttc cccggcctgg ccgacgatgc agcggtcggt gcactcgaat actatgatgc 780 gaaggtcgac gacgcccgtt tcgtcatgac gctcatccgc tctgctgtgg gctacggcgc 840 cgccgcggcc aatcacgtct ccgtcatcga ctacctccac gacggggacc gggtctccgg 900 agtccgtgcc cgtgatgaga tgaccggccg agaattcgac atccacgccc gccgcaccat 960 ccttgccggg ggagtctgga ccgaggagca gcaggacctg gccaaggccg acgccggcct 1020 ccaggtgctc gcctccaaag gtgtgcacat cacggtcgag caggacaaga tcaaggcaga 1080 cccgaacacg ggcatcatct cgaagacgga gaagtccgtg ctcttcgtga tcccgtggga 1140 gggctactgg gtcatcggca ccacggacac cccgtgggac caggatgtcg acgcaccggt 1200 ggcgaactct gatgacatcg actacctgct caagcatgcg aacgcgatcc tgaccgagaa 1260 gctgagccgc aacgacgtca tcggcgtcta ctccggtctc cgacctctgc tccagcccgt 1320 ggtcaaggaa ggtcaggcct cgacgaaggt ctcccgtgaa cacacggtga tggagatcga 1380 gcccgctctg gcagcgattg ccggcggcaa gttcaccacg tatcgcgtca tggcagaaga 1440 cgccgtcgat ttcgtcctcg gcgatgacgc gaaggaccgc cgctccctga ccgaatcgat 1500 cccgctgctg ggtgctcagg gcgtcggcgc cgtgcgccgc ggccagtccg gcatcgccga 1560 gaagcacggg tgggacgaag accgggtcag gcgactcatc cgccgctacg gcaccctgct 1620 cgaagacatc ctcgacctta tcgacgagga tcccgaactc ggtcgcccgc tgcccggtgc 1680 cgaaagctat ctgcgcgccg aggcacacta tgcggcgacc tcggaaggtg ccgtccacct 1740 cggcgacatc ctcgaacgac ggatgcggct gaactatgag gtcagggacc gaggcaagta 1800 cgccgccgag gcggttgcgg cgatcgtcgc cccgatcctc gggtgggacg acgaacggga 1860 agcgaaggag atcgctgact tcaacgctca cgtcgacgca cagatcgccg ctgaatccac 1920 ccacgacgat gccgcggctg cggcactcgt cgaggaaaca ctcaaaccgt aaatccgcta 1980 agcaggacaa acataggagt ttgtgagata tgggtactat tttcctttat gagatcggcg 2040 gaacggcgat gctcatactg ctcggcgtcg gcgtcgtcgc caacgtggtg ctgggcaaga 2100 ccaagggcaa cgggggaggc tggctcctca tctcgttcgg ctggggcctc gcggtcttcg 2160 ccggtgtctt cgtcgccttc aagacaggtg cgcacctcaa cccggccgtg accatcggca 2220 tcttgtccag tggagccgag gaatacgctc ccggcatcgc cgtgaacttc ggcaacacca 2280 tcgcctacct cgcggccgag atgatcggtg ccatgatcgg tgccttcctc gcctgggccg 2340 tgtacaagaa gcactacgac gaggagaagg aagccggcaa catcctcggc accttctcca 2400 ccggtcctga gatccgcagc tacggctgga acttcgtcac cgaggtcatc gccaccttcg 2460 tcctcgtgtt cgtcatcctc ctcttcggcg gaaccccaca cgagctcgga cccctggcag 2520 tcggcctcct cgtcgtcgcc atcggtgcct cactgggcgg acccacaggc tatgcgatca 2580 acccggcccg tgacctcggg ccccgcatcg tccacgccct gctgccgatc ccgaacaagg 2640 gcagctcgga ctggtcgtac tcgtgggtcc cgatcgccgg acctctggtc ggcgccatca 2700 tcgccggact gctctcccgg gccttcatct gagcaggtgg ggcgagccca tcagaccctc 2760 gtctgagtca ccagcaatcc acagcaccac ctcgacatag gagtcagtat gagtcaggaa 2820 aagttcatcc tcgccgtcga ccagggcacc acctcgtcgc gggccatcgt cttcaatcac 2880 tcagggcaga tcgtgtcctc gggtcagctc gagcacgagc agatcttccc tcgggcaggc 2940 tgggtcgaac acgacccgat ggagatcatc aggaacacga acgaggcgat cggtcaggcc 3000 ctgacccgcg ccgacatcaa ccgccaccag ctcgagggcg tcggcatcac gaatcagcgt 3060 gagaccacgg tgatctggaa caagaacacc ggcaagccgg tctacaacgc gatcgtctgg 3120 caggacacca gaacacagaa gatctgcgac gaactcgccg gagacgaagg tcccgacaag 3180 tacaaggacc gggtcggtct gcccctggcc acctacttcg ccgggccgaa ggccaagtgg 3240 gtcttcgaca acgtcgaggg cgtcaaagag tccgctgaag ccggagacct gctcttcggc 3300 accatggaca cctgggtgct ctggaacctc accggcggcg tcaacggcgg agtccacgtc 3360 accgacgtca cgaatgcgtc caggacgatg ctgatgaacg ttaagaccct ggactggaac 3420 gaggagatcg ccggtgagat gggcatcccc gtctcgatgc tcccggagat caaatcctgc 3480 tccgaggtct atgggtacgg tgcgaagaac ggcctcatca tcgacacccc gatctgcggc 3540 atcctcggtg accagcaggc ggcgaccttc ggtcaggcat gcttcgagaa gggccaggcc 3600 aagaacacct acggcaccgg caacttcatg ctcatcaaca ccggcaacga gcctgtggcc 3660 agcaagaacg gtctgttgac gacggtggcc tacaagatcg gcgacgccga ggctgtctac 3720 gccctcgaag gttccatcgc cgtcacgggg tccctcgtgc agtggctgcg tgacaacctc 3780 ggaatcattg ccgatgctcc cgaggttgag acgctggcga aacaggtcga ggacaacggc 3840 ggcggctaca tcgtgccggc cttctccggc ctcttcgccc cacactggga gtccgatgcc 3900 cgcggcgtga tcgtgggtct gacccgctac gtcaacaaga accacatcgc ccgtgcggct 3960 ctcgaatcgg ttgcattcca atcccgcgag gtcctcgacg ccatggacct cgactcgggt 4020 gtcgcactca ccgagctcaa ggtcgacggc ggcatggtcg ccaacgaaac gctcatgcag 4080 ttccaggccg acctcctcgg cgtgcccgtc atccgccccg aggtcgtcga gaccacggcc 4140 ctgggcgcgg cctatgcggc gggcatcgcc gtgaagttct ggaacggcga ggacgacgtg 4200 aaggccaact ggcgcgaggg caagcgctgg gagccgtcca tggacaagga caaggtcgat 4260 cgcgtctacc gactgtggaa caaggccgtc gacaagtcga agacctgggt cgacgaggac 4320 gtcgaagaac tctacggctg accttcggtc gaggtcgata ctcgccgagg tggccctcag 4380 ccgagttcga ccgtgaacat gcgctctggc accgctggag acaccccgtc gaagacgtgg 4440 gtgatctccg tgcggtgcca gccgtgtttg gcatagaagc gcatcgcccg ctcattgcct 4500 tcggcgacca tgagataggc acgggtgaag ccctgcccac gcagctcgtc ttccaacg 4558 <210> 4 <211> 1722 <212> DNA <213> Brevibacterium linens BL2 <400> 4 atgcgaaatg gcgagctgtc cccatcgttc cgcgatgaag ccctgcacac cctggagaac 60 accagcccgg acgatccgct cgacgtcttc gtcgtcggcg gaggcgtcac cggagcaggt 120 tccgccttcg atgcggccac ccgcgggctg aaggtcggtg tcgtcgatgc caaggactgg 180 gcttccggca cctcgtcacg gtcctcgaag ctcatgcacg gcggactgcg ctacctggag 240 atgctcgact tcaagcttgt ggccgaggcg ctgaaggaac gcgacctgct gctccagcac 300 acagcgcccc acctcgtcga acctgttgcc ttcgtcttcc ccttcgaaca ccggctcatc 360 gacagggcat tcatcggttc cggcgttctg ctctatgaca cgatggccac ccgtcccgga 420 cgcaaacgtg ccgtgccgat gcaccgccac ctgggaaaga aggcactcac cgcccatttc 480 cccggcctgg ccgacgatgc agcggtcggt gcactcgaat actatgatgc gaaggtcgac 540 gacgcccgtt tcgtcatgac gctcatccgc tctgctgtgg gctacggcgc cgccgcggcc 600 aatcacgtct ccgtcatcga ctacctccac gacggggacc gggtctccgg agtccgtgcc 660 cgtgatgaga tgaccggccg agaattcgac atccacgccc gccgcaccat ccttgccggg 720 ggagtctgga ccgaggagca gcaggacctg gccaaggccg acgccggcct ccaggtgctc 780 gcctccaaag gtgtgcacat cacggtcgag caggacaaga tcaaggcaga cccgaacacg 840 ggcatcatct cgaagacgga gaagtccgtg ctcttcgtga tcccgtggga gggctactgg 900 gtcatcggca ccacggacac cccgtgggac caggatgtcg acgcaccggt ggcgaactct 960 gatgacatcg actacctgct caagcatgcg aacgcgatcc tgaccgagaa gctgagccgc 1020 aacgacgtca tcggcgtcta ctccggtctc cgacctctgc tccagcccgt ggtcaaggaa 1080 ggtcaggcct cgacgaaggt ctcccgtgaa cacacggtga tggagatcga gcccgctctg 1140 gcagcgattg ccggcggcaa gttcaccacg tatcgcgtca tggcagaaga cgccgtcgat 1200 ttcgtcctcg gcgatgacgc gaaggaccgc cgctccctga ccgaatcgat cccgctgctg 1260 ggtgctcagg gcgtcggcgc cgtgcgccgc ggccagtccg gcatcgccga gaagcacggg 1320 tgggacgaag accgggtcag gcgactcatc cgccgctacg gcaccctgct cgaagacatc 1380 ctcgacctta tcgacgagga tcccgaactc ggtcgcccgc tgcccggtgc cgaaagctat 1440 ctgcgcgccg aggcacacta tgcggcgacc tcggaaggtg ccgtccacct cggcgacatc 1500 ctcgaacgac ggatgcggct gaactatgag gtcagggacc gaggcaagta cgccgccgag 1560 gcggttgcgg cgatcgtcgc cccgatcctc gggtgggacg acgaacggga agcgaaggag 1620 atcgctgact tcaacgctca cgtcgacgca cagatcgccg ctgaatccac ccacgacgat 1680 gccgcggctg cggcactcgt cgaggaaaca ctcaaaccgt aa 1722 <210> 5 <211> 684 <212> DNA <213> Brevibacterium linens BL2 <400> 5 atgctcatac tgctcggcgt cggcgtcgtc gccaacgtgg tgctgggcaa gaccaagggc 60 aacgggggag gctggctcct catctcgttc ggctggggcc tcgcggtctt cgccggtgtc 120 ttcgtcgcct tcaagacagg tgcgcacctc aacccggccg tgaccatcgg catcttgtcc 180 agtggagccg aggaatacgc tcccggcatc gccgtgaact tcggcaacac catcgcctac 240 ctcgcggccg agatgatcgg tgccatgatc ggtgccttcc tcgcctgggc cgtgtacaag 300 aagcactacg acgaggagaa ggaagccggc aacatcctcg gcaccttctc caccggtcct 360 gagatccgca gctacggctg gaacttcgtc accgaggtca tcgccacctt cgtcctcgtg 420 ttcgtcatcc tcctcttcgg cggaacccca cacgagctcg gacccctggc agtcggcctc 480 ctcgtcgtcg ccatcggtgc ctcactgggc ggacccacag gctatgcgat caacccggcc 540 cgtgacctcg ggccccgcat cgtccacgcc ctgctgccga tcccgaacaa gggcagctcg 600 gactggtcgt actcgtgggt cccgatcgcc ggacctctgg tcggcgccat catcgccgga 660 ctgctctccc gggccttcat ctga 684 <210> 6 <211> 1533 <212> DNA <213> Brevibacterium linens BL2 <400> 6 atgagtcagg aaaagttcat cctcgccgtc gaccagggca ccacctcgtc 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gaggctgtct acgccctcga aggttccatc gccgtcacgg ggtccctcgt gcagtggctg 960 cgtgacaacc tcggaatcat tgccgatgct cccgaggttg agacgctggc gaaacaggtc 1020 gaggacaacg gcggcggcta catcgtgccg gccttctccg gcctcttcgc cccacactgg 1080 gagtccgatg cccgcggcgt gatcgtgggt ctgacccgct acgtcaacaa gaaccacatc 1140 gcccgtgcgg ctctcgaatc ggttgcattc caatcccgcg aggtcctcga cgccatggac 1200 ctcgactcgg gtgtcgcact caccgagctc aaggtcgacg gcggcatggt cgccaacgaa 1260 acgctcatgc agttccaggc cgacctcctc ggcgtgcccg tcatccgccc cgaggtcgtc 1320 gagaccacgg ccctgggcgc ggcctatgcg gcgggcatcg ccgtgaagtt ctggaacggc 1380 gaggacgacg tgaaggccaa ctggcgcgag ggcaagcgct gggagccgtc catggacaag 1440 gacaaggtcg atcgcgtcta ccgactgtgg aacaaggccg tcgacaagtc gaagacctgg 1500 gtcgacgagg acgtcgaaga actctacggc tga 1533 <210> 7 <211> 4558 <212> DNA <213> Brevibacterium linens BL2 <400> 7 cgctgcgtga aggcatcatc atgcgcaaac tcgaccttct ggactcggca gagacctcct 60 cggcgatgcg ggtcgagctg gtctgaggcc tttcgcaatc ggtctgagcc ctttcgcaat 120 tgagcgttgt gtttcgcttc tgcgcattgc ctgttagatt tttcctatct gccgcgcacg 180 gaccaccagt tgggttcggg gcgcaataat ggtgggaacg cacacgctcc gagaaggaaa 240 agaactgtca atgcgaaatg gcgagttgtc cccatcgttc cgcgatgaag ccctgcacac 300 cctggagaac accagcccgg acgatccgct cgacgtcttc gtcgtcggcg gaggcgtcac 360 cggagcagga tccgccttcg atgcggccac ccgtggactg aaggtcgggg tcgtcgatgc 420 caaggactgg gcttccggca cctcgtcacg gtcctcgaaa ctcatgcacg gcggactgcg 480 ctacctggag atgctcgact tcaaactcgt ggctgaggcg ctgaaggaac gcgacctcct 540 gctccagcac acagcgcccc acctcgtcga acctgttgcc ttcgtcttcc ccttcgaaca 600 ccggctcatc gacagggcat tcatcggttc cggcgttctg ctctatgaca cgatggccac 660 ccgtcccgga cgcaaacgtg ccgtgccgat gcaccgccac ctgggaaaga aggcactcac 720 cgcccatttc cccggcctgg ccgacgatgc agcggtcggt gcactcgaat actatgatgc 780 gaaggtcgac gacgcccgtt tcgtcatgac gctcatccgc tctgctgtgg gctacggcgc 840 cgccgcggcc aatcacgtct ccgtcatcga ctacctccac gacggggacc gggtctccgg 900 agtccgtgcc cgtgatgaga tgaccggccg agaattcgac atccacgccc gccgcaccat 960 ccttgccggg ggagtctgga ccgaggagca gcaggacctg gccaaggccg acgccggcct 1020 ccaggtgctc gcctccaaag gtgtgcacat cacggtcgag caggacaaga tcaaggcaga 1080 cccgaacacg ggcatcatct cgaagacgga gaagtccgtg ctcttcgtga tcccgtggga 1140 gggctactgg gtcatcggca ccacggacac cccgtgggac caggatgtcg acgcaccggt 1200 ggcgaactct gatgacatcg actacctgct caagcatgcg aacgcgatcc tgaccgagaa 1260 gctgagccgc aacgacgtca tcggcgtcta ctccggtctc cgacctctgc tccagcccgt 1320 ggtcaaggaa ggtcaggcct cgacgaaggt ctcccgtgaa cacacggtga tggagatcga 1380 gcccgctctg gcagcgattg ccggcggcaa gttcaccacg tatcgcgtca tggcagaaga 1440 cgccgtcgat ttcgtcctcg gcgatgacgc gaaggaccgc cgctccctga ccgaatcgat 1500 cccgctgctg ggtgctcagg gcgtcggcgc cgtgcgccgc ggccagtccg gcatcgccga 1560 gaagcacggg tgggacgaag accgggtcag gcgactcatc cgccgctacg gcaccctgct 1620 cgaagacatc ctcgacctta tcgacgagga tcccgaactc ggtcgcccgc tgcccggtgc 1680 cgaaagctat ctgcgcgccg aggcacacta tgcggcgacc tcggaaggtg ccgtccacct 1740 cggcgacatc ctcgaacgac ggatgcggct gaactatgag gtcagggacc gaggcaagta 1800 cgccgccgag gcggttgcgg cgatcgtcgc cccgatcctg 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ctcgccgagg tggctctcag 4380 ccgagttcga ccgtgaacat gcgctctggc accgctggag acaccccgtc gaagacgtgg 4440 gtgatctccg tgcggtgcca gccgtgtttg gcatagaagc gcatcgcccg ctcattgcct 4500 tcggcgacca tgagataggc acgggtgaag ccctgcccac gcagctcgtc ttccaacg 4558

Claims

글리세롤을 이용 가능하게 하는 브레비박테리움 린넨스 (Brevibacterium Linens) BL2 유래의 서열번호 3의 염기서열을 갖는 glpDFK 오페론.
상기 제1항의 glpDFK 오페론을 포함하는 벡터.
제2항에 있어서,

상기 벡터는 도1의 셔틀벡터 pECCG117-Bli glpDFK인 것을 특징으로 하는 벡터.
상기 제2항의 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 코리네박테리아.
제4항에 있어서,

상기 코리네박테리아가 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 글루타미쿰 CgGB3로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 코리네박테리아.
제4항에 있어서,

상기 코리네박테리아는 코리네박테리리움 글루타미쿰 C003-0011 (KCCM10886P) 인 것을 특징으로 하는 코리네박테리아.
브레비박테리움 린넨스 (Brevibacterium Linens) BL2로부터 유래된 서열번호 3의 염기서열을 갖는 glpDFK 오페론을 포함하는 벡터로 코리네박테리아를 형질전환시키는 단계;

상기 형질전환된 코리네박테리아를 탄소원의 일부 또는 전부로 글리세롤이 포함된 배양배지에 접종하여 배양하는 단계; 및

상기 배양 단계에서 얻어진 배양물로부터 발효산물을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 글리세롤을 포함한 탄소원에서 코리네박테리아를 이용하여 발효 산물을 생산하는 방법.
제 7항에 있어서,

상기 코리네박테리아가 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 CgGB3로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 글리세롤을 포함한 탄소원에서 코리네박테리아를 이용하여 발효 산물을 생산하는 방법.
제 7항에 있어서,

상기 코리네박테리아가 코리네박테리움 글루타미쿰 C003-0011 (KCCM10886P) 인 것을 특징으로 하는, 글리세롤을 포함한 탄소원에서 코리네박테리아를 이용하여 발 효 산물을 생산하는 방법.
제 7항에 있어서,

상기 발효 산물이 라이신인 것을 특징으로 하는, 글리세롤을 포함한 탄소원에서 코리네박테리아를 이용하여 발효 산물을 생산하는 방법.