KR20000070226A - 발효 공정을 사용한 산화물의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
글루코노박터(Gluconobacter) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속, 슈도글루코노박터(Pseudogluconobacter) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 또는 에르위니아(Erwinia) 속으로 부터 선택되는 미생물을 배양시켜 배양 배지 중에서 기질을 산화시키는 단계를 포함하는 산화물의 제조 방법에 있어서, 동화 가능한 탄소원을 배지와 혼합시킨다. 이 방법은 배지 중에서 기질의 증가된 산화 속도, 개선된 발효 수율 및 감소된 부산물의 비율에 기여한다.
Description
글루코노박터(Gluconobacter) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속, 슈도글루코노박터(Pseudogluconobacter) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 또는 에르위니아(Erwinia) 속의 다양한 미생물 균주들은 글루코오스, 프락토오스, 리보오스, 소르보오스 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 과당류, 소르비톨, 만니톨, 리비톨, 크실리톨, 아라비톨 등의 당 알코올, 글리세롤 및 에탄올 등의 알코올 등의 다양한 기질을 부분적으로 산화시킬 수 있는 능력을 가지고 있으며, 소르보오스, 2-케토-L-글루콘산, 아세트산 등의 유용한 산화물의 생산에 이용되어 오고 있다. 기질로부터 산화물을 생성하기 위한 이 미생물학적인 기술에 관련하여, 전환 효율을 개선시키기 위하여 많은 연구들이 수행되어 오고 있다. 이러한 목적을 위하여, 예를 들면 미생물의 개선(일본 특허 공보 소62-275692호, WO 95/23220) 및 배양법의 개선(일본 특허 공보 평7-227292호)가 시도되었다.
기질을 산화시키기 위해, 글루코노박터(Gluconobacter) 속, 아세토박터 (Acetobacter) 속, 슈도글루코노박터(Pseudogluconobacter) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 에르위니아(Erwinia) 속에 속하는 미생물을 이용하는 지금까지 공지된 방법에 있어서, 미생물의 성장에 필요한 탄소원의 첨가의 통상적인 방식은 단독의 기질의 첨가 또는 기질과 함께 배양 개시시에 기질과는 다른 탄소원의 총괄적인 첨가를 수반한다. 기질 단독의 첨가를 수반하는 실시 방식은 미생물의 성장 속도가 느리고 이 경향은 특히 기질전환의 효율이 느리게 증가되는 미생물의 균주에서 두드러진다는 단점이 있다. 상기 결점을 극복하기 위하여 배양의 개시시에 상이한 탄소원의 총괄적인 첨가는 성장 속도를 개선시키는데는 도움이 되나 증가된 부산물의 형성의 문제는 말할 것도 없고 기질 화합물의 전환의 특이성이 감소되는 결과를 초래한다. 본 발명의 목적은 미생물의 성장에 사용되는 배지 중에서 기질 화합물의 산화 속도를 증가시킴으로써 발효시간을 감소시키고, 발효 수율을 증가시키며, 부산물 형성율을 감소시키는 기술을 제공하는데 있다.
본 발명은 글루코노박터(Gluconobacter) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속, 슈도글루코노박터(Pseudogluconobacter) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 에르위니아(Erwinia) 속으로 부터 선택된 미생물을 배양함으로써 배양 배지 중에서 기질을 산화시키는 방법에 관한 것이다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 동화 가능한 탄소원, 예컨대 당, 당 알코올 또는 글리세롤 등의 다가 알코올을 배지 중에 혼합시키는 것을 특징으로 하는, 글루코노박터(Gluconobacter) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속, 슈도글루코노박터 (Pseudogluconobacter) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 또는 에르위니아(Erwinia) 속의 미생물의 균주를 성장시켜 배양 배지 중에서 기질을 산화시키는 것을 포함하는 산화물의 제조 방법, 본 발명을 실시하여 얻은 배양 배지 및 상기 배지의 정제에 의해 얻은 산화물에 관한 것이다.
업계의 기술 상태에 비추어 예의 연구를 수행한 후, 본 발명의 발명자들은 글루코노박터(Gluconobacter) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속, 슈도글루코노박터 (Pseudogluconobacter) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 또는 에르위니아(Erwinia) 속의 미생물을 배양 배지에서 배양하여 상기 배지에 첨가되는 기질을 산화시킴으로써 목적 산화물을 제공함에 있어서, 예컨대 당, 당 알코올 또는 글리세롤 등의 다가 알코올 등의 상기 미생물에 대한 동화가능한 탄소원을 기질 이외에 배양 배지에 첨가함으로써 기질의 산화 속도가 증가되고, 발효시간이 감소되고 발효 수율이 증가됨을 발견하였다. 본 발명은 이러한 발견을 토대로 하여 개발된 것이다.
따라서, 본 발명은 동화 가능한 탄소원을 배지에 혼합시키는 것을 특징으로 하는, 글루코노박터(Gluconobacter) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속, 슈도글루코노박터(Pseudogluconobacter) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 또는 에르위니아(Erwinia) 속으로 부터 선택되는 미생물을 배양시켜 배양 배지 중에서 기질을 산화시키는 것을 포함하는 산화물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 글루코노박터(Gluconobacter) 속, 아세토박터 (Acetobacter) 속, 슈도글루코노박터(Pseudogluconobacter) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 에르위니아(Erwinia) 속의 미생물은 기질 화합물을 산화시켜 목적하는 산화물을 제공할 수 있는 능력을 지닌 임의의 미생물일 수 있으나 바람직하게는 목적 산화물에 대한 기질의 산화에 관련하여 높은 전환 효율을 갖는 미생물의 균주가 좋다. 높은 전환효율을 갖는 그러한 미생물로서, 관련 전환 효소계의 고생산자로서 알려진 균주, 높은 전환효율을 가진 효소계를 동화하는 균주, 목적 산화물을 분해하는 작용이 결핍된 균주, 단독 탄소원으로서 기질을 동화시키는 능력이 감소된 균주를 열거할 수 있다. 설명할 목적으로, 소르비톨을 목적 산화물로서 소르보오스 또는 2-케토-L-글루콘산을 생산하기 위한 기질로서 사용하는 경우 또는 소르보오스를 목적 산화물로서 2-케토-L-글루콘산을 생산하기 위한 기질로 사용하는 경우, 글루코노박터의 속 또는 슈도글루코노박터 속의 미생물을 사용하는 것이 이로우며 바람직하다. 특히 바람직한 것은 글루코노박터 속의 미생물들이다. 그러한 미생물 균주의 예로서는 모두가 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) 종에 속하는, 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) GA-1 (FERM BP-4522), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) N952 (FERM BP-4580)(이들 둘에 대해서는, WO95/23220호 참조), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) GO-10 (FERM BP-1169), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) GO14 (FERM BP-1170), (이들 둘에 대해서는, 일본 특허 공보 제 소62-275692호 참조), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) UV-10 (FERM P-8422), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) E-1 (FERM P-8355), 및 모두가 슈도글루코노 박터 속에 속하는 슈도글루코노박터 K591s (FERM BP-1130), 슈도글루코노박터 12-5 (FERM BP-1129), 슈도글루코노박터 TH14-86 (FERM BP-1128), 슈도글루코노박터 12-15 (FERM BP-1132), 슈도글루코노박터 12-4 (FERM BP-1131), 및 슈도글루코노박터 22-3 (FERM BP-1133)을 예로서 들 수 있다.
본 발명의 실시에 사용하기 위한 배양법은 다른 요인들 중에서도 미생물의 균주, 기질 화합물 및 목적 화합물에 따라서 적절히 선택할 수 있으며, 진탕 배양 또는 심부 호기성 배양법을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 기질은 글루코오스, 프락토오스, 리보오스, 소르보오스 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 과당류, 소르비톨, 만니톨, 리비톨, 크실리톨, 아라비톨 등의 당 알코올류 및 글리세롤 및 에탄올 등의 알코올류를 포함한다. 기질의 첨가량은 미생물의 균주의 종류, 배양 절차 및 기질의 종에 따라 다양하지만 일반적으로 배양 배지의 1 내지 50%, 바람직하게는 3-20%이다.
미생물이 기질을 동화시킬 수 있는 한 상기 기질 이외에 동화 가능한 탄소원의 종류에는 제한이 없다. 예를 들면, 미생물의 균주가 소르비탈 또는 소르보오스상에 작용하여 소르보오스 또는 2-케토-L-글루콘산을 생산하는 능력을 가진 것이라면, 상기 탄소원은 당(예, 수크로오스, 말토오스 등의 과당류, 글루코오스, 프락토오스 등의 단당류), 당 알코올(예, 소르비톨, 만니톨, 크실리톨 등), 글리세롤 등의 다가 알코올 중에서 선택될 수 있다. 그러한 다가 알코올 중에서 글리세롤이 특히 바람직한데 이는 전환 효율 및 속도에서 및 불완전 대사의 생성물의 감소된 양에서 개선에 큰 기여를 하기 때문이다.
상기 탄소원의 양은 미생물 균주의 종류, 배양 절차, 탄소원, 기질 화합물 및 기질 화합물의 양에 따라 변할 수 있으나, 기질의 양의 1 내지 100%의 범위일 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 50%가 좋다.
상기 탄소원의 첨가 방식은 미생물의 균주의 종류, 배양 공정, 탄소원 및 기질에 다라서 다양할 수 있으나, 배양 도중에 첨가할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 탄소원의 첨가 기간은 배양 개시후 특정 시기에, 연속적이거나 또는 간헐적으로 및 예정된 분량으로 또는 발효의 진행에 따라 선택될 수 있다.
본 발명은 상기 기질 및 탄소원 이외에 미생물의 성장을 촉진하고 충분환 전환 활성을 유지시키기 위해 보조 영양원으로서 효모 엑스, 건조 엑스, 콘 스티프 리커(corn steep liquor) 등의 천연 유기 영양원을 첨가함으로써 수행할 수 있다.
본 발명의 실시예 의해 생산되는 목적 과산화물은 산화물의 종류에 따라 당업계의 업자들에게 공지된 수단에 의해 수확하고 정제할 수 있다. 이는 또한 나트륨염 또는 칼슘염 등의 염의 형태로 단리할 수도 있다. 예를 들면, 단리는 배양물을 세포를 제거하기 위하여 활성탄의 처리 또는 처리 없이 여과 또는 원심분리시키고 이어서 분액을 농축, 수지 상의 흡착, 크로마토그래피, 탈염 등을 단독으로 적용하거나, 적절히 조합하거나 또는 반복하여 결정화시킴으로써 수행된다.
본 발명은 글루코노박터(Gluconobacter) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속, 슈도글루코노박터(Pseudogluconobacter) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 에르위니아(Erwinia)에 속하는 미생물을 배지 중에서 기질을 산화시키기 위한 배양 배지에서 배양시키는 것을 포함함으로써 증가된 산화율, 감소된 발효 시간 및 개선된 발효 수율을 제공하는, 산화물의 산업적 생산을 위한 경제적이고 효율적인 기술을 제공한다.
실시예 1
500 ml 플라스트 중에 글루코오스 0.5%, 소르비톨 5%, 콘 스티프 리커 1.5% 및 황산마그네슘 0.15%를 포함하는 배양 배지 50 ml을 글루코노박터 옥시단스(WO95/23220)의 형질전환체인 글루코노박터 옥시단스 N952 (FERM BP-4580)의 액체 질소 보존 배양물 0.5 ml로 접종하고, 30℃에서 24 시간 동안 배양시켰다. 이 배양물의 일부(17 ml)을 상기한 바와 동일한 조성을 갖는 멸균 배지 (17 L)을 포함하는 30-L 쟈르 발효기로 옮기고, 30℃에서 20 시간 동안 배양시켰다. 이 종 배양물 2 L 부분을 소르비톨 15%, 콘 스티프 리커 2%, 효모 엑스 0.3%, 황산마그네슘 0.5%, 및 탄산칼슘 0.5%를 포홈하는 배양 배지를 함유한 30 L 쟈르 발효기로 옮기고, 32℃에서 70 시간 동안 배양시켰다. 이 배양 과정에서, 배지의 pH를 수산화나트륨 수용액을 첨가함으로써 24 시간 까지는 5.5로 조정하고, 그후 발효가 종료될 때까지는 6.5로 조정하였고, 스파징(sparging)에 의해 교반시켜 용존 산소를 10% 이상으로 유지시켰다. 이와 같이 얻은 배양 브로쓰를 콘트롤로서 사용하였다. 한편, 동일 미생물의 균주를 별도의 동일한 조건하에서 배양의 개시후 13.5 시간에서부터 발효의 종료시까지(배양의 개시로부터 70시간후) 최종 배양 배지의 6%에 해당하는 양으로 글리세롤의 첨가를 계속하면서 배양시켰다. 소르비톨로부터 2-케토-L-글루콘산의 전환 효율은 글리세롤의 첨가를 수반하는 실험에서 41.3%이었으며, 이는 배양의 개시로부터 70 시간에서 글리세롤을 첨가하지 않은 대조 실험(24.8%)에 비하여 현저한 효과를 입증한다.
실시예 2
글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) N952 대신에, 글루코노 옥시단스 HS17[소르비톨로부터 2-케토-L-글루콘산의 전환 효율을 증가시키기 위해 니트로소구아니딘-유발 돌연변이시킨 글루코노박터 옥시단스 NB6939-pSDH-tufB1 (WO95/23220)을 사용하여 실시예 1의 배양 절차를 별도로 반복하였다. 글리세롤의 첨가는 배양의 개시로부터 13시간에서 배양의 개시로부터 72 시간까지 최종 배양 배지의 6%에 해당하는 양으로 수행하였다. 대조 실험에 있어서는, 글리세롤을 배양의 개시전에 최종 배양 배지의 6%에 해당하는 양으로 총괄적으로 첨가하였다. 소르비톨로부터 2-케토-L-글루콘산으로부터의 전환 효율을 측정하였고 배양 및 대조군 배지의 개시후 각각 24, 48, 56, 및 72 시간 사이의 실험을 비교하였다. 결과들은 표 1에 나타냈다.
| 24시간 후 | 48시간 후 | 56 시간후 | 72 시간후 | |
| 배양전의 총체적 첨가 | 22% | 42% | 45% | ND* |
| 13시간에서 부터 시작하여 24, 48, 56 또는 76 시간에서 첨가 | 25% | 74% | 85% | 90% |
| *ND: 측정되지 않음 |
Claims (9)
- 동화 가능한 탄소원을 배지 중에서 혼합시키는 것을 특징으로 하는, 글루코노박터(Gluconobacter) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속, 슈도글루코노박터 (Pseudogluconobacter) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 또는 에르위니아(Erwinia) 속으로부터 선택된 미생물을 배양시켜 배양 배지 중에서 기질을 산화시키는 것을 포함하는 산화물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 동화 가능한 탄소원이 다가 알코올인 산화물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 동화 가능한 탄소원이 글리세롤, 단당류 및 당 알코올로부터 선택되는 원인 산화물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 동화 가능한 탄소원이 글리세롤인 산화물의 제조 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지 중의 기질이 소르비톨 또는 소르보오스인 산화물의 제조 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서, 산화물이 2-케토-L-글루콘산인 산화물의 제조 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 글루코박터 옥시단스인 산화물의 제조 방법.
- 제1항 내지 제7항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 배양 배지.
- 제8항의 배양 배지의 정제에 의해 얻은 산화물.
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