DE112008003111B4

DE112008003111B4 - Corynebakterien, die Glyzerin enthaltende Kohlenstoffquellen verwerten, und Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsprodukts unter Verwendung derselben

Info

Publication number: DE112008003111B4
Application number: DE112008003111.8T
Authority: DE
Inventors: Jae-Yeong Ju; Hyun-ae Bae; Hyo-Jin Kim; Jin-sook Chang
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2007-11-20
Filing date: 2008-11-19
Publication date: 2023-05-25
Anticipated expiration: 2028-11-20
Also published as: KR20090051970A; WO2009066927A1; EP2260104A4; DE112008003111T5; EP2260104A1; KR100924904B1

Abstract

Verwendung eines glpDFK-Operons, das die durch SEQ. ID. NO: 3 dargestellte Nukleotidsequenz aufweist, in einem Mikroorganismus zur Erleichterung der Verwertung von Glyzerin.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Corynebakterien, in die ein Operon mit dem Fremdgen glpDFK, das an der Verwertung von Glyzerin beteiligt ist, eingeführt wurde. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Herstellen eines Fermentationsprodukts aus verschiedenen Kohlenstoffquellen, die Glyzerin enthalten, unter Verwendung der Corynebakterien.
Stand der Technik
Um das Problem des hohen Ölpreises aufgrund der zunehmenden Verwendung natürlicher Resourcen wie etwa Erdöl und das der Verschmutzung, die auf dessen Verwendung zurückzufuhren ist, zu lösen, ist versucht worden, alternative Energie unter Verwendung von recyclingfähigen Materialien in der Natur zu entwickeln. Unter vielen Kandidaten für eine alternative Energiequelle sind aus Pflanzenöl erhaltenes Biodiesel und durch Fermentation hergestelltes Bioethanol die attraktivsten Kandidaten. Biodiesel bezeichnet Fettsäuremethylester oder Fettsäureethylester, die durch Veresterung von Methanol unter Verwendung von Pflanzenöl als Substrat in Gegenwart eines Katalysators synthetisiert wurden. Während der Synthese wird das Nebenprodukt Glyzerin notwendigerweise in einer Menge von bis zu 10% des Gesamtgewichts erzeugt.
Glyzerin (C₃H₈O₃) wird durch Umsetzung von Glukose (C₆H₁₂O₆) mittels Reduktion in einem Schritt hergestellt, was ein verbessertes Reduktionsvermögen während der Verstoffwechselung durch einen Mikroorganismus verfügbar machen kann. Viele Produkte, die durch Fermentation hergestellt werden, erfordern ein Reduktionsvermögen in ihren Stoffwechselwegen. Deshalb würde, wenn Glyzerin effizient als Substrat genutzt werden könnte, die Ausbeute und Produktivität verbessert werden. Trotz der Erwartung sind Studien zu Glyzerin auf Reuterin (Talarico et al., Antimicrob. Agents Chemother., 32:1854-1858 (1988)), 2,3-Butandiol (Biebl et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 50:24-29 (1998)), 1,3-Propandiol (Menzel et al., Enzyme Microb. Technol., 20:82-86 (1997), Bernsteinsäure (koreanisches Patent Nr. 10-0313134 ), Itaconsäure (US-Patent Nr. 5,457,040 ), 3-Hydroxypropanaldehyd (Doleyres et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68(4):467-474 (2005)) und Propionsäure (Himmi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 53:435-440 (2000)) beschränkt geblieben. Dies beruht darauf, dass der Preis von Glyzerin höher ist als der von jeder anderen Kohlenstoffquelle, die zur Fermentation in diesem industriellen Bereich verwendet wird. Jetzt sind Untersuchungen zum Herstellen von Glyzerin durch Fermentation am Laufen (Wang et al., Biotechnol. Adv., 19(3):201-223 (2001)).
Allerdings steigt die Glyzerinproduktion mit dem Anstieg der Biodieselproduktion ebenfalls, was zu einem schnellen Preisverfall führt. Dementsprechend ist berichtet worden, dass 1,3-Propandiol (Gonzalez-Pajuelo et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31:442-446 (2004)), Wasserstoff und Ethanol (Ito et al., J. Biosci. Bioeng., 100(3): 260-265 (2005)) unter Verwendung des Nebenprodukts von Biodiesel, das Glyzerin umfasst, hergestellt worden sind. Allerdings gibt es keine Berichte darüber, dass das typischste Fermentationsprodukt, Aminosäuren, und andere Hauptmetaboliten unter Verwendung von Glyzerin hergestellt worden sind.
Glyzerin ist bisher in der Seifen-, Fettsäure-, Wachs- und Detergenzindustrie hergestellt worden. Wie oben erwähnt, ist es jedoch ein neues zu lösendes Problem gewesen, wie Glyzerin, das Nebenprodukt, das während der Produktion von Biodiesel hergestellt wird, zu behandeln ist, das drastisch zunimmt. Inzwischen wird erwartet, dass der Preis für das gereinigte Glyzerin fallen wird. Deshalb könnte die Herstellung von nützlichen Fermentationsprodukten unter Verwendung von Glyzerin größere Auswirkungen haben als erwartet.
Die Verwendung von Glyzerin bei Mikroorganismen ist im Fall von E. coli und Klebsiella pneumoniae berichtet worden. In E. coli dringt extrazelluläres Glyzerin in Zellen unter Verwendung von GlpF, einem der Aquaglyceroporine mit Permeabilität für Wasser, Glyzerin und Harnstoff ohne Energieverbrauch ein (Heller et al., J. Bacteriol. 144:274-278, (1980)). Das Glyzerin wird durch Glyzerinkinase zu Glyzerin-3-Phosphat umgesetzt, das wiederum zu Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) durch Glyzerin-3-Phosphatdehydrogenase umgesetzt wird, und das dann zu Glyzeroaldehyd-3-Phosphat (G-3-P) durch Triosephosphatisomerase (TpiA) umgesetzt wird, gefolgt durch Endverstoffwechselung (Lin EC, Annu. Rev. Microbiol. 30:535-578, (1976)). Falls die Glyzerinkinase keine Aktivität aufweist, wird Glyzerin durch Glyzerindehydrogenase (Gdh) zu Dihydroxyaceton (DHA) umgesetzt, das wiederum zu Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) durch Glyzerinkinase oder Dihydroxyacetonkinase (DHA-Kinase) umgesetzt wird, gefolgt von erneuter Umsetzung zu Glyzerinaldehyd-3-Phosphat (G-3-P) vor einer Endverstoffwechselung (Paulsen et al., Microbiology, 146:2343-2344, (2000)). Ein derartiger Glyzerinstoffwechselweg wird durch verschiedene Faktoren reguliert. Insbesondere wenn Glyzerin und Glukose gemeinsam vorliegen, zeigt Wildtyp E. coli Berichten zufolge ein diauxisches Wachstum, bei dem Wildtyp E. coli zunächst ausschließlich Glukose verwertet und dann Glyzerin verwertet (Lin, Annu. Rev. Microbiol. 30:535-578, (1976)).
Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium sind diejenigen, die in industriellen Bereichen umfangreich verwendet worden sind. Corynebacterium glutamicum beispielsweise ist für die Herstellung solcher Aminosäuren wie Lysin und Mononatriumglutamat verwendet worden, und C. ammoniagenes ist für die Herstellung von Nukleinsäure durch Fermentation industriell verwendet worden. Es ist berichtet worden, dass Corynebakterien verschiedene Kohlenstoffquellen wie Glukose oder Rohzucker zur Fermentation nutzen können. Es ist auch berichtet worden, dass Corynebakterien Xylose durch die Einführung eines Gens wie etwa xylAB nutzen können (Kawaguchi et al., Appl. Envion. Microbiol. 72(5):3418-3428 (2006)).
Unter den Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium wurden nur vier Mikroorganismen analysiert, um deren Gesamtgenomsequenzen zu identifizieren. Und ein vollständiges Gen, mittels dessen Glyzerin verwertet wird, wurde nur in Corynebacterium diphtheriae gefunden, und solche Gene, wie GlpF, die am Glyzerinverbrauch beteiligt sind, fehlten in den anderen drei Mikroorganismen Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens und Corynebacterium jeikeium. Das Fehlen des Gens ist für Corynebakterien das größte Hemmnis, um Glyzerin effizient zu verwerten.
Es ist ein Fall einer Verwendung von Glyzerin als Kohlenstoffquelle durch Einführen des kompletten Gens, mittels dessen Glyzerin verwertet wird, aus Corynebacterium diphtheriae in Corynebacterium glutamicum berichtet worden (koreanische Patentanmeldung No. 2006-057633 ) und ein Fall, bei dem daraus Glutaminsäure und Lysin hergestellt wurden (koreanische Patentanmeldung Nr. 10-2007-007513 ).
Allerdings gibt es viele Beschränkungen bzgl. der Verwendung des Gens von Corynebacterium diphtheriae in der Fermentationsindustrie, da es sich bei Corynebacterium diphtheriae um ein pathogenes Bakterium handelt, das der biologischen Sicherheitsstufe 2 zugeordnet wird. Folglich führten die Erfinder der vorliegenden Erfindung Untersuchungen fort, um das oben dargestellt Problem zu lösen, und sie fanden verschiedene andere Stämme als Corynebacterium diphtheriae, die ein komplettes Gen, mittels dessen Glyzerin verwertet wird, enthalten. Unter diesen Stämmen war die Gattung Brevibacterium einschließlich Brevibacterium linens diejenige, die ein komplettes Gen, mittels dessen Glyzerin verwertet wird, enthielt. Insbesondere waren nach dem Ergebnis der genomischen Hybridisierungsexperimente Corynebacterium und Brevibacterium dafür bekannt, dass sie ähnliche Genspezifitäten aufweisen. Deshalb ist kürzlich ein Trend dazu, Corynebacterium und Brevibacterium einer einzigen Spezies zuzuordnen, berichtet worden. (Liebl, Eikaman et al., 1991).
Offenbarung der Erfindung
Technische Aufgabe
Wie vorangehend erläutert, ist es vorteilhaft, Glyzerin, das ein Nebenprodukt der Biodieselproduktion ist, als Kohlenstoffquelle zu verwenden. Auf dieser Grundlage richteten die Erfinder der vorliegenden Erfindung folglich das Augenmerk ihrer Studien auf die Nutzbarkeit von Glyzerin durch Corynebakterien, die von großem industriellen Wert sind, wie etwa Corynebacterium glutamicum und Corynebacterium ammoniagenes. Als Ergebnis vervollständigten die Erfinder diese Erfindung, indem sie bestätigten, dass die Glyzerinnutzbarkeit durch Einführen eines Fremdgens, das an der Verwertung von Glyzerin beteiligt ist, in jene Corynebakterien, deutlich verbessert werden konnte.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Operon verfügbar zu machen, das an der Verwertung von Glyzerin beteiligt ist und das aus Brevibacterium stammt, einer mit Corynebacterium verwandten Spezies, um die Glyzerinassimilation von Corynebakterien deutlich zu verbessern.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Mutante verfügbar zu machen, die von Corynebakterien abstammt und die Glyzerin entweder allein als eine Kohlenstoffquelle oder zusammen mit anderen Kohlenstoffquellen verwertet.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Herstellen eines Fermentationsprodukts durch Fermentieren mittels der Mutante von Corynebakterien, die Glyzerin entweder allein als Kohlenstoffquelle oder zusammen mit anderen Kohlenstoffquellen verwertet, verfügbar zu machen.
Technische Lösung
Die oben genannten Aufgaben und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung können durch die folgenden Ausführungen der vorliegenden Erfindung gelöst werden.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend genau beschrieben.
Um die Aufgabe der Erfindung zu lösen, macht die vorliegende Erfindung ein Operon verfügbar, das an der Verwertung von Glyzerin beteiligt ist, um die Glyzerinassimilation von Corynebakterien deutlich zu verbessern. Vorzugsweise macht die vorliegende Erfindung eine Mutante des Operons verfügbar, das an der Verwertung von Glyzerin beteiligt ist.
Die Formulierung „das Gen, das an der Verwertung von Glyzerin beteiligt ist“ bezeichnet hier ein Gen, das ein Protein zur erleichterten Glyzerinaufnahme (glycerol uptake facilitator protein) kodiert, das aus Brevibacterium linens stammt (nachfolgend als glpF bezeichnet), ein Gen, das eine Glyzerinkinase kodiert, wobei es sich um das Enzym handelt, das Glyzerin-3-Phosphat durch Phosphorylierung unter Verwendung von ATP herstellt (nachfolgend als glpK bezeichnet), und ein Gen, das Glyzerin-3-Phosphodihydrogenase kodiert, wobei es sich um das Enzym handelt, das Dihydroxyaceton-3-Phosphat durch Oxidieren von Glycerin-3-Phosphat herstellt (nachfolgend als glpD bezeichnet).
Die Bezeichnung „das Gen“ schließt jedes Gen ein, das ein Polypeptid in Corynebakterien kodiert, das eine Rolle spielt bei der Aufnahme von extrazellulärem Glyzerin und beim Umsetzen des Glyzerins zu Glyzerin-3-Phosphat durch Phosphorylierung und beim Umsetzen von Glyzerin-3-Phosphat zu Dihydroxyaceton-3-Phosphat, und dann schließlich beim Umsetzen von Dihydroxyaceton-3-Phosphat zu Glyzerinaldehyd-3-Phosphat, dem Zwischenprodukt der Glykolyse, um zu verstoffwechseln.
Das Gen kann aus Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen stammen. Es ist bevorzugt, ein Gen, das aus einem Mikroorganismus, insbesondere aus Brevibacterium linens BL2 (Gene Bank-Zugangsnr. NZ_AAGP00000000; SEQ. ID. NO: 7) stammt, auszuwählen. Es ist besonders bevorzugt, ein Gen, das der SEQ. ID. NO: 3 entspricht, das eine Mutation in der Nukleotidsequenz von glpDFK von Brevibacterium linens BL2 aufweist, auszuwählen.
Die vorliegende Erfindung macht auch eine Mutante verfügbar, die von Corynebakterien abstammt, die Glyzerin entweder allein als Kohlenstoffquelle oder zusammen mit anderen Kohlenstoffquellen verwertet.
Der bei dieser Erfindung verwendete Stamm kann unter gleichzeitigem Verbrauch von Glyzerin und Glukose wachsen gelassen werden, um Glyzerin effizient zu verwerten. Wenn Glukose und Glyzerin gleichzeitig als Kohlenstoffquelle verabreicht werden, verwertet Wildtyp E. coli Glukose ausschließlich, und nach Verbrauch der gesamten Glukose verwertet Wildtyp E. coli Glyzerin, was als „diauxisches“ Wachstum bezeichnet wird. Wenn folglich eine komplexe Kohlenstoffquelle, die Glyzerin enthält, angeboten wird, wird die Fermentationseffizienz herabgesetzt.
Um das oben beschriebene Problem zu überwinden, untersuchten die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Möglichkeit einer gleichzeitigen Nutzung von Glukose und Glyzerin in dem Stamm. Und als Ergebnis bestätigten die Erfinder, dass Glyzerin und andere Kohlenstoffquellen durch die Einfügung eines Fremdgens, das an der Verwertung von Glyzerin beteiligt ist und das aus Brevibacterium stammt, effizient verwertet werden konnte.
In einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung machen die Erfinder einen Mikroorganismus verfügbar, der das Gen enthält, das GlpD (Gene Bank-Zugangsnr. NP_00380226.1; SEQ. ID. NO: 4), GlpF (Gene Bank-Zugangnr. NP_00380225.1; SEQ ID NO: 5) oder GlpK (Gene Bank-Zugangsnr. NP_00380224.1; SEQ. ID. NO: 6), das Protein, das an der Verwertung von Glyzerin beteiligt ist und das aus Brevibacterium linens stammt, kodiert. Die Transformation von Corynebacterium mit dem Gen kann durch das herkömmliche Verfahren, das den Fachleuten bekannt ist, durchgeführt werden, und es kann eine Mutante von Corynebacterium, die mit einem Vektor transformiert ist, der ein glpDFK-Operon (SEQ. ID. NO: 3) enthält, und die Aminosäuren unter Verwertung von Glyzerin entweder allein als Kohlenstoffquelle oder zusammen mit anderen Kohlenstoffquellen herstellt, verfügbar gemacht werden.
Der Vektor für die vorliegende Erfindung ist nicht auf einen bestimmten beschränkt und es kann jeder bekannte Expressionsvektor verwendet werden. Insbesondere wird der E. coli-Corynebacterium Shuttle-Vektor pECCG117 (Biotechnology Letters Vol 13, No. 10, S. 721-726 (1991) bevorzugt.
In dieser Beschreibung bezeichnet „Transformation“ das Verfahren des Einführens eines Gens in eine Wirtszelle und des Exprimierens des Gens darin. Das zur Transformation verwendete Gen wird entweder in ein Chromosom der Wirtszelle eingefügt oder außerhalb des Chromosoms präsentiert, solange es in der Zelle exprimiert werden kann. Das Gen ist ein Polynukleotid, das in der Lage ist, ein Polypeptid zu kodieren und DNA bzw. RNA zu enthalten. Das Gen ist nicht auf seine Form zur Einführung beschränkt, solange es in der Wirtszelle exprimiert werden kann. Beispielsweise kann das Gen in die Wirtszelle als Expressionskassette, das Polynukleotid-Konstrukt, das jedes zur Autoexpression notwendige Element enthält, eingeführt werden. Die Expressionskassette umfasst einen Promotor, der funktionsfähig mit dem Gen verknüpft ist, einen Transkriptionsterminator, eine Ribosomenbindungsstelle und einen Translationsterminator. Die Expressionskassette kann der Expressionsvektor, der zur Autoreplikation fähig ist, sein. Auch kann das Gen funktionsfähig mit der Sequenz verknüpft sein, die zur Expression in der Wirtszelle notwendig ist, indem es selbst oder in Form eines Polynukleotid-Konstrukts in eine Wirtszelle eingeführt wird.
Bei dieser Erfindung kann der Mikroorganismus, der mit dem Gen transformiert ist, das an der Verwertung von Glyzerin beteiligt ist, um Aminosäuren unter Verwendung von Glyzerin effizient herzustellen, ein Mikroorganismus der Corynebacteriaceae, stärker bevorzugt ein Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium und am meisten bevorzugt ein Mikroorganismus, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Corynebacterium glutamicum (ex. ATCC13032), Corynebacterium ammoniagenes (ex. ATCC 6872), Brevibacterium lactofermentum (ex. ATCC13869), Brevibacterium flavum (ex. ATCC14067), Corynebacterium thermoaminogenes (ex. FERM-BP1539) und Corynebacterium efficiens (ex. C. efficiens str. YS-314) sein, ist jedoch nicht immer darauf beschränkt. Und es kann auch der Mikroorganismus, der nützliche Materialien wie etwa Aminosäuren oder Nukleinsäuren produziert, beispielsweise Corynebacterium glutamicum SM5, der Glutaminsäure produziert, und Corynebacterium glutamicum CF 905 (KFCC-10881) und Corynebacterium glutamicum CgGB3, der Lysin produziert, eingeschlossen sein, ist jedoch nicht immer darauf beschränkt.
In einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung wurde das glpDFK-Gen von Brevibacterium linens in pECCG117, einem E. coli-Corynebacterium Shuttle-Vektor, kloniert, gefolgt von einer Transfektion von Corynebacterium glutamicum CgGB3. Corynebacterium glutamicum CgGB3 wurde mit dem Vektor transformiert. Der transformierte Stamm wurde als „Corynebacterium glutamicum C003-0011 (KCCM10886P)“ bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung macht weiterhin ein Verfahren zum Herstellen eines Fermentationsprodukts durch Fermentieren von Corynebakterien unter Verwendung von Glyzerin entweder allein als Kohlenstoffquelle oder zusammen mit anderen Kohlenstoffquellen verfügbar. Insbesondere macht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Fermentationsprodukts unter Verwendung von Glyzerin als Kohlenstoffquelle verfügbar, das die folgenden Schritte umfasst: Transformieren von Corynebakterien mit dem Vektor, der das glpGFK-Operon enthält, dargestellt durch SEQ. ID. NO: 3, wobei es sich um eine Genkombination handelt, welche die Verwertung von Glyzerin erleichtert; Kultivieren der transformierten Corynebakterien durch Beimpfen des Kulturmediums, das Glyzerin entweder allein als Kohlenstoffquelle oder zusammen mit anderen Kohlenstoffquellen enthält; und Trennen des Fermentationsprodukts von dem Kulturmedium.
Bei dem Verfahren zum Herstellen des Fermentationsprodukts der vorliegenden Erfindung kann die Kultivierung der Mikroorganismen in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Kultivierungsbedingungen, die den Fachleuten bekannt sind, durchgeführt werden. Diese Bedingungen können in Abhängigkeit von dem ausgewählten Stamm reguliert werden. Die Kultivierungsverfahren werden beispielhaft an Batch-, kontinuierlichen und Fed-Batch-Kulturen gezeigt, sind jedoch nicht immer darauf beschränkt. Verschiedene Kultivierungsverfahren werden in „Biochemical Engineering“ von James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, S. 138-176 beschrieben.
Das Medium muss die Anforderungen an die Kultivierung eines bestimmten Stamms erfüllen. Das bei dieser Erfindung verwendete Medium enthält Glyzerin allein als Kohlenstoffquelle oder Glyzerin zusammen mit anderen Kohlestoffquellen. Zusätzlich zu Glyzerin können andere Kohlenstoffquellen sachgemäß zugesetzt werden, und derzeit wird Glukose als Kohlenstoffquelle bevorzugt. Als Stickstoffquelle kann eine solche organische Stickstoffquelle wie Pepton, Hefeextrakt, Soße (gravy), Malzextrakt, Flüssigkeit von gewässertem Getreide und Sojabohnenmehl, und eine solche anorganische Stickstoffquelle wie Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat in das Medium aufgenommen werden. Als Phosphatquelle können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat und ihre entsprechenden Natrium enthaltenden Salze in das Medium aufgenommen werden. Außerdem kann auch ein Metallsalz, wie etwa Magnesiumsulfat oder Eisensulfat aufgenommen werden. Aminosäuren, Vitamine und geeignete Vorläufer können ebenfalls aufgenommen werden. Diese Medien oder Vorläufer können der Kultur nach Art des Batch-Verfahrens oder kontinuierlich zugesetzt werden.
Der pH-Wert der Kultur kann während der Kultivierung durch Zugeben einer Verbindung, wie etwa Ammonhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak, Phosphorsäure und Schwefelsäure eingestellt werden. Das Erzeugen von Luftblasen kann während der Kultivierung durch Verwenden eines die Schaumbildung hemmenden Mittels, wie etwa Fettsäurepolyglykolester gehemmt werden. Um aerobe Bedingungen in der Kultur zu erhalten, kann Sauerstoff oder Sauerstoff enthaltendes Gas in die Kultur eingeführt werden. Die Temperatur der Kultur beträgt vorzugsweise 20 bis 45°C, stärker bevorzugt 25 bis 40°C. Die Kultivierung kann fortgesetzt werden, bis die Herstellung von nützlichen Materialien das gewünschte Ausmaß erreicht, und die bevorzugte Kulturdauer beträgt 10 bis 160 Stunden.
Figurenliste
Die Anwendung der bevorzugten Ausführungen der vorliegenden Erfindung wird am besten unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen verstanden, wobei:

1 eine Konstruktion eines rekombinanten Plasmids pECCG117-bli glpDFK, welches ein glpGFK-Operon enthält, veranschaulicht.

Ausführung der Erfindung (Best Mode)
Praktische und derzeit bevorzugte Ausführungen der vorliegenden Erfindung werden in den folgenden Beispielen veranschaulicht.
Allerdings wird verstanden werden, dass Fachleute unter Berücksichtigung dieser Offenbarung Modifikationen und Verbesserungen vornehmen können, die dem Geist der vorliegenden Erfindung entsprechen und von deren Umfang umfasst sind.
Beispiele
Beispiel 1: Screening und Klonierung eines Gens, das an der Verwertung von Glyzerin beteiligt ist. das in Corynebakterien funktionsfähig ist
Die Nukleotidsequenz des Gens, das an der Verwertung von Glyzerin durch Brevibacterium linens beteiligt ist, ist bereits identifiziert und offiziell mitgeteilt worden. Informationen über Gene, die GlpF, GlpK und GlpD kodieren, die Gene von Brevibacterium linens sind, die an der Verwertung von Glyzerin beteiligt sind, und benachbarte Nukleotidsequenzen wurden von GeneBank, NIH, USA erhalten. Die Gene Bank-Zugangsnr. von GlpF von Brevibacterium linens war ZP_00380225.1, die Gene Bank-Zugangnr. von GlpK war ZP_00380224.1 und die Gene Bank-Zugangsnr. von GlpD war ZP_00380226.1. Es wurde bestätigt, dass die Gene in einer Reihe im Genom angeordnet sind. Auf diese Weise konnte eine Einmal-PCR alle drei Gene als einziges Polynukleotid amplifizieren. Die Primer, die durch SEQ. ID. NO: 1 und NO: 2 dargestellt werden, wurden für die PCR verwendet, um die Gene, die an der Verwertung von Glyzerin durch Brevibacterium linens beteiligt sind, zu amplifizieren. Der Primer, der durch SEQ. ID. NO: 1 dargestellt wird, schließt eine XbaI-Restrik-tionsenzymstelle ein, und der Primer, der durch SEQ. ID. NO: 2 dargestellt wird, schließt eine PstI-Stelle ein.

SEQ. ID. NO: 1: 5'ACTCTAGACGCTGCGTGAAGGCATCA 3'
SEQ. ID. NO: 2: 5'AACTGCAGCGTTGGAAGACGAGCTGC 3'

Das Chromosom von Brevibacterium linens wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) (ATCC ID. No: 9175D) bezogen, um das Gen, das an der Verwertung von Glyzerin durch Brevibacterium linens beteiligt ist, zu amplifizieren. Die PCR wurde unter Verwendung des Chromosoms von Brevibacterium linens als Matrize durchgeführt, um das Gen, das an der Verwertung von Glyzerin beteiligt ist, zu amplifizieren. Die PCR wurde wie folgt durchgeführt: Prädenaturierung bei 94°C für drei Minuten, Denaturierung bei 94°C für 30 Sekunden, Annealing bei 56°C für 30 Sekunden, Polymerisation bei 72°C für vier Minuten, 30 Sekunden, 25 Zyklen von der Denaturierung zur Polymerisation und am Ende Extension bei 72°C für fünf Minuten. Das PCR-Produkt wurde zur Elektrophorese auf Agarosegel übertragen. Als Ergebnis wurde ein Polynukleotid der Größe 4574 bp erhalten. Das Polynukleotid wurde in pCR2.1 unter Verwendung des TOPO TA Kloning Kit (Invitrogen) kloniert.
Beispiel 2: Bestimmung der Nukleotidsequenz des GlpDFK-Gens
Das oben erhaltene Plasmid wurde mit XbaI und PstI verdaut, um ein DNA-Fragment zu erhalten, welches das an der Verwertung von Glyzerin beteiligte Gen enthielt. Das DNA-Fragment wurde in pECCG117, einem E. coli-Corynebacterium Shuttle-Vektor, kloniert, gefolgt von einer Transformation von E. coli TOP10.

Das durch die herkömmliche Plasmid-Miniprep erhaltene Plasmid wurde pECCG117-bli glpDFK genannt. Es wurde die DNA-Nukleotidsequenz des pECCG117-bli glpDFK bestimmt und dementsprechend wurde bestätigt, dass die Nukleotidsequenz ab Nr. 252 bis 1972 das glpD-Gen kodierte (SEQ. ID. NO: 4), die Nukleotidsequenz ab Nr. 2049 bis 2732 das glpF-Gen kodierte (SEQ. ID. NO: 5) und die Nukleotidsequenz ab Nummer 2809 bis 4341 das glpK-Gen kodierte (SEQ. ID. NO: 6), und es gab 21 Änderungen in der Nukleotidsequenz (SEQ. ID. NO: 3) im Vergleich zu der Sequenz, die durch herkömmliches Sequenzieren des Genoms erhaltenen wurde. Die Änderungen in der Nukleotidsequenz werden in Tabelle 1 gezeigt. Es wurden neun Änderungen in der Nukleotidsequenz am Ort des Promotors, elf Änderungen am Ort von glpD und eine Änderung am Ort von glpK gefunden. Insbesondere induzierte nur die Änderung des Restes Nr. 3844, dem Ort von glpK, eine Mutation der Aminosäure. Die Mutation der Aminosäure bestand darin, dass das Cystein Nr. 346 von glpK zu Glycin geändert war. Tabelle 1

Nukleotid-Nr.	Änderung	Nukleotid-Nr.	Änderung	Nukleotid-Nr.	Änderung
123	a → t	215	g→c	460	a --+ g
127	t → g	230	c → t	505	a --+ g
168	t → a	266	t → c	508	c → t
195	t → a	370	a → t	514	t → c
196	t → c	394	t → c	538	c → g
197	c → t	397	a → g	1840	g → c
200	g → t	409	g → t	3844	t → g

Beispiel 3: Einführung eines Gens, das an der Verwertung von Glyzerin beteiligt ist, in Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Der präparierte Expressionsvektor pECCG117-bli glpDFK wurde in Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (Wildtyp) durch ein elektrisches Puls-Verfahren eingeführt. Die Zelle wurde auf dem Plattenmedium kultiviert, das Bacto-Pepton 10 g/l, Hefeextrakt 10 g/l, Rindfleischextrakt 5 g/l, NaCl 2,5 g/l und Kanamycin 25 µg/ml enthielt. Mit den erhaltenen Kolonien wurde eine PCR-Klonierung durchgeführt, um die Kolonien, die das Plasmid enthielten, welches das Gen, das an der Nutzung von Glyzerin beteiligt ist, umfasste, auszuwählen. Der ausgewählte Stamm wurde ATCC13032/pECCG117-bli glpDFK genannt.
Beispiel 4: Nutzbarkeit von Glyzerin durch Corynebacterium glutamicum ATCC13032

Um die Nutzbarkeit von Glyzerin durch Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-bli glpDFK, das Glyzerin verwertet, zu bestätigen, wurde Corynebacterium glutamicum ATCC13032, welches das oben bezeichnete Plasmid enthält, bzw. Corynebacterium glutamicum ATCC13032, welches das Plasmid nicht enthält, in LB-Festmedium kultiviert. Mit den Bakterien wurden jeweils 250 ml-Schikanenkolben (cornerbaffled flask), die 25 ml des Aussaatmediums enthielten, beimpft, gefolgt von einer Schüttelkultivierung (200 UpM) bei 30°C für 48 Stunden. Die Reste von Glyzerin und Glukose in dem Medium wurden durch HPLC-Analyse gemessen und die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Es wurde das Wachstum von Corynebacterium glutamicum, in das pECCG117-bli glpDFK eingeführt war, bestätigt. Das Wachstum des Stamms, in dem das Plasmid nicht eingeführt war, war jedoch unbedeutend. Tabelle 2

Stamm	Glukose:Glyzerin (g/l)	48 h
Stamm	Glukose:Glyzerin (g/l)	OD	verbrauchte Glukose (g/l)	verbrauchtes Glyzerin (g/l)
ATCC13032	40 : 00	65,1	40,0	-
	30 : 10	60,0	30,0	0,0
	20 : 20	48,7	20,0	0,0
	00 : 40	6,6	-	0,0
ATCC13032 mit pECCG117-bli glpDFK	40 : 00	62,6	40,0	-
	30 : 10	65,9	30,0	10,0
	20 : 20	66,2	20,0	20,0
	00 : 40	57,5	-	40,0

Durch die oben dargestellten Ergebnisse wurde bestätigt, dass während im Fall von Corynebacterium glutamicum ATCC13032, in das pECCG117-bli glpDFK eingeführt war, keine Glukose und kein Glyzerin im Medium verblieben waren, im Fall des Wildtyp-Stamms, in den das oben genannte Plasmid nicht eingeführt war, zwar keine Glukose, aber Glyzerin zurückblieb. Es wurde auch bestätigt, dass der Stamm, in den das oben bezeichnete Plasmid eingeführt war, ein überlegenes Wachstum im Vergleich zu dem Stamm, in den das oben bezeichnete Plasmid nicht eingeführt war, zeigte, und insbesondere eine OD₆₀₀ von 57,5 zeigte, was sich deutlich von 6,6, wie im Fall des Stamms, in den das oben genannte Plasmid nicht eingeführt war, unterschied, selbst unter einer Bedingung, unter der nur Glyzerin als Kohlenstoffquelle vorhanden war.
Insoferm wurde bestätigt, das Corynebacterium glutamicum ATCC13032 durch Verwertung von Glyzerin nicht wachsen gelassen werden konnte, dass aber Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-bli glpDFK, welches das glpDFK-Gen von Brevibacterium linens enthielt, durch Verwertung von Glyzerin als Kohlenstoffquelle wachsen gelassen werden konnte.
Beispiel 5: Einführung eines Gens, das an der Verwertung von Glyzerin beteiligt ist, in einen Lysin produzierenden Stamm
Um zu untersuchen, ob es möglich war, nicht nur geeignete Materialien herzustellen, sondern auch das Wachstum von Corynebakterien, die Glyzerin verwerten, zu stimulieren, wurde der Expressionsvektor pECCG117-bli glpDFK in Corynebacterium glutamicum CgGB3, einem Lysin produzierenden Stamm, durch ein elektrisches Puls-Verfahren auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 beschrieben eingeführt. Mit den erhaltenen Kolonien wurde eine PCR-Klonierung durchgeführt, um die Kolonie auszuwählen, die das Plasmid enthielt, welches das Gen, das an der Verwertung von Glyzerin beteiligt ist, umfasste. Der ausgewählte Stamm wurde Corynebacterium glutamicum C003-0011 genannt und wurde bei KCCM (Korean Culture Center of Microorganisms) der KFCC (Korean Federation of Culture Collection), der internationalen Hinterlegungsstelle unter der Adresse 361-221, Hongje-1-Dong, Seodaemungu-Gu, Seoul, Korea, am 19. Oktober 2007 hinterlegt (Zugangsnr.: KCCM10886P).
Beispiel 6: Lysin-Produktion eines Lysin produzierenden Stamms Corynebacterium glutamicum C003-0011 (KCCM10886P), der Glyzerin verwertet

Mit dem Mutterstamm Corynebacterium glutamicum CgGB3 und dem Stamm C003-0011 (KCCM10886P), der pECCG117-bli glpDFK enthielt, d.h. dem Stamm der vorliegenden Erfindung, wurden jeweils 250 ml-Schikanenkolben, die 25 ml des Aussaatmediums enthielten, beimpft, gefolgt von einer Schüttelkultivierung (200 UpM) bei 30°C für 20 Minuten. Es wurden 24 ml des Produktionsmediums, das in 250 ml Schikanenkolben enthalten war, mit 1 ml der Aussaatkulturlösung beimpft, gefolgt von einer Schüttelkultivierung (200 UpM) bei 30°C für vier Tage. Nach Abschluss der Kultivierung wurde die L-Lysin-Produktion mit einem Aminosäure-Analysegerät gemessen. Es wurden die L-Lysin-Gehalte der Kulturen von Corynebacterium glutamicum CgBG3 und C003-0011 (KCCM10886P) untersucht, und die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3

Stamm	Glukose:Glyzerin (g/l)	48 h
Stamm	Glukose:Glyzerin (g/l)	OD	verbrauchte Glukose (g/l)	verbrauchtes Glyzerin (g/l)	Lys (g/l)
CgGB3	90 : 00	130,0	90,0	-	10,6
	70 : 20	188,2	70,0	0,0	8,5
	45 : 45	93,8	45,0	0,0	5,8
C003-0011 mit pECCG117-bli glpDFK	90 : 00	130,8	90,0	-	10,7
	70 : 20	140,4	70,0	20,0	10,6
	45 : 45	145,3	45,0	45,0	8,9

Aus den oben dargestellten Ergebnissen ergibt sich, dass wenn pECCG1 17-bli glpDFK, das Gen, das an der Verwertung von Glyzerin beteiligt ist, in den Lysin produzierenden Stamm eingeführt wurde, der Stamm eine Fähigkeit zur Nutzung von Glyzerin zeigte, anders als der Mutterstamm, der Glyzerin überhaupt nicht nutzen kann, und die Lysin-Produktion war gesteigert.
Aussaatmedium (pH 7.0):
Glukose 40 g, Pepton 10 g, Hefeextrakt 5 g, Harnstoff 1,5 g, K₂HPO₄ 8 g , MgSO₄ × 7H₂O 0,5 g, Biotin 100 Kits, Thiamin-HCl 1000 Kits, Calcium-Pantothensäure 2000 Kits, Nicotinamid 2000 Kits (in 1 1 Verfahrenswasser).
Produktionsmedium (pH 7,0):
Glukose 100 g, (NH4)₂SO₄ 40 g, Sojabohnenprotein 2,5 g, eingeweichtes Getreide, Festbestandteile 5 g, Harnstoff 3 g, KH₂PO₄ 1g, MgSO₄ × 7H₂O 0,5 g, Biotin 100 Kit, Thiamin-HCl 1000 Kit, Calcium-Pantothensäure 2000 Kits, Nicotinamid 3000 Kits, CaCO₃ 30 g (in 1 1 Verfahrenswasser).
Industrielle Anwendbarkeit
Wie zuvor erläutert, macht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen nützlicher Materialien mit hoher Ausbeute unter effizienter Verwendung von Glyzerin verfügbar, das ein Nebenprodukt von Biodiesel ist. Der Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung kann nützliche Materialien effizient in einem Medium, das eine komplexe Kohlenstoffquelle, die Glyzerin umfasst, und in einem Medium, das nur Glyzerin als eine Kohlenstoffquelle umfasst, herstellen. Deshalb können die Mikroorganismen, die in der Lage sind, nützliche Materialien herzustellen, wie mit den Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung gezeigt, Glyzerin als Kohlenstoffquelle effizient nutzen.
Fachleute werden verstehen, dass die Konzepte und speziellen Ausführungen, die in der vorangehenden Beschreibung offenbart wurden, leicht als Grundlage zum Modifizieren oder Entwerfen anderer Ausführungen zum Ausführen derselben Zwecke wie denen der vorliegenden Erfindung genutzt werden können. Fachleute werden auch verstehen, dass derartige äquivalente Ausführungen sich nicht vom Geist und Umfang der Erfindung, wie in den beigefügten Ansprüchen dargelegt, entfernen.
Es folgt ein Sequenzprotokoll als elektronisches Dokument. Dieses kann sowohl in DEPATISnet als auch im DPMAregister aufgerufen werden.

Claims

Verwendung eines glpDFK-Operons, das die durch SEQ. ID. NO: 3 dargestellte Nukleotidsequenz aufweist, in einem Mikroorganismus zur Erleichterung der Verwertung von Glyzerin.
Corynebacterium, das transformiert ist, um einen glpDFK-Operon mit der in SEQ. ID. NO: 3 dargestellten Nukleotidsequenz einzuführen, um Glyzerinverfügbarkeit aufzuweisen.
Corynebacterium nach Anspruch 2, wobei das Corynebacterium ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Corynebacterium glutamicum und Corynebacterium glutamicum CgGB3.
Corynebacterium nach Anspruch 2, wobei das Corynebacterium Corynebacterium glutamicum C003-0011 (KCCM10886P) ist.
Verfahren zum Herstellen eines Fermentationsprodukts aus einer Kohlenstoffquelle, die Glyzerin enthält, unter Verwendung von Corynebacterium, umfassend die folgenden Schritte: Transformieren von Corynebacterium mit dem Vektor, der ein glpDFK-Operon enthält, das die durch SEQ. ID. NO: 3 dargestellte Nukleotidsequenz aufweist, die von Brevibacterium linens BL2 stammt; Kultivieren des transformierten Corynebacteriums durch Beimpfen des Kulturmediums, das Glyzerin allein oder Glyzerin zusammen mit einer anderen Kohlenstoffquelle als Kohlenstoffquelle enthält; und Trennen des Fermentationsprodukts von der Kultur.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei Corynebacterium ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Corynebacterium glutamicum und Corynebacterium glutamicum CgGB3.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Corynebacterium Corynebacterium glutamicum C003-0011 (KCCM10886P) ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Fermentationsprodukt Lysin ist.