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Die
Erfindung betrifft die biotechnologische Nutzung von anorganischen
Elektronendonatoren, vor allem von gasförmigem Wasserstoff
zur Fixierung von Kohlenstoffdioxid als Kohlenstoffquelle zur Synthese
von organischen Verbindungen als Energieträger und Wertprodukte
durch Fermentation in Mikroorganismen.
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Die
Umsetzung von Wasserstoff und Kohlenstoffdioxid in einem biologischen
Organismus ist bekannt. Es wurden Wildtypen verschiedener Mikroorganismen
entdeckt, die zu dieser Stoffwechselleistung fähig sind. Dazu
zählen Ralstonia metallidurans, Ralstonia metallidurans
(Ralstonia eutropha; Alcaligenes eutrophus), fakultativ autotrophe
Pseudomonaden wie P. aeruginosa, P. saccharophila, P. facilis, P.
hydrogenovora, P. hydrogenothermophila, P. carboxydohydrogena, P.
compransoris, P. carboxydovarans, P. gasotropha und P. stanieri; Rhodopseudomonas
palustris, R. capsulata; zur Wasserstoff-Aufnahme und Homoacetatgärung
fähige Clostridien wie C. aceticum, C. magnum, C. thermoaceticum,
C. scatologenes, C. formicoaceticum und C. thermoautotrophicum;
Acetobacterium woodii; Acetogenium kivui; Arten der Rhodospirillales
(C-Quelle Kohlenmonooxid) und Rhodocyclus gelatinosus.
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Eine
Vielzahl dieser Organismen eignen sich nicht oder nicht ohne weiteres
zur Verwendung in der biotechnologischen Anwendung. Darüber
hinaus sind vor allem geringe Umsatzraten realisiert.
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Aufgabenstellung
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Der
Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein verbessertes
Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von organischen Verbindungen,
besonders in Form von C2 bis C6-Körpern vor allem aus Kohlenstoffdioxid
als Kohlenstoffquelle unter Umsetzung mit Wasserstoff als „Energiequelle"
sowie Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens bereitzustellen.
Das technische Problem besteht auch darin, ein solches Verfahren
besonders auch bei bekannten, in biotechnologischen/fermentativen
Prozessen etablierten Mikroorganismen beziehungsweise Zelllinien,
die mittels üblicher Rekombinationstechnologien unter geringem
Aufwand transfiziert werden können, einsetzbar zu machen.
Gleichzeitig soll das technische Problem gelöst werden, eine
stabile Synthese von organischen Verbindungen wie Carbonsäuren,
kurzkettige Fettsäuren und Alkohol vor allem aus CO2 als
Kohlenstoffquelle und mit Wasserstoff als „Energiequelle"
mit hoher Ausbeute zu ermöglichen, die sowohl in anaeroben
als gegebenenfalls auch in aeroben Prozessen ablaufen kann.
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Das
technische Problem wird gelöst durch Bereitstellung einer
transgenen biologischen Zelle, besonders eines rekombinanten Mikroorganismus
oder Teilen davon, welche eine Enzymausstattung enthält
welche ausgewählt ist aus:
- (1) Hydrogenase-Aktivität,
bevorzugt
(a) cytoplasmatische, bevorzugt NAD-reduzierende
Hydrogenase-Aktivität, und/oder
(b) membranständige
Hydrogenase-Aktivität, bevorzugt zur Erzeugung eines Protonengradienten;
und
- (2) Enzymaktivität, geeignet zur Realisierung eines
CO2-fixierenden Stoffwechselweges, ausgewählt aus:
(a)
Calvin-Benson-Bassham-Zyklus (CBB), und zwar:
mindestens eine
Enzymaktivität, ausgewählt aus:
Phosphoribulose-Kinase-Aktivität
und
Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität,
wobei
die Enzymaktivität, ausgewählt aus:
Fructose-Bisphosphatase-Aktivität
und
Fructosebisphosphat-Aldolase-Aktivität
in
der Zelle nicht exprimiert oder gehemmt wird,
(b) Serin-Zyklus
(SC), und zwar:
Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität;
und
(c) reduktiver Tricarbonsäurezyklus (RTCC) und
zwar:
Citrat-Lyase-Aktivität,
Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität
und
Fumarat-Reduktase-Aktivität.
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Zur
Realisierung dieser Zelle sieht die Erfindung bevorzugt vor, dass
eine transgene Zelle bereitgestellt wird, welche mindestens ein
rekombinantes Nucleinsäuremolekül enthält
mit einer Nucleotidsequenz, welche für mindestens eine
Enzymaktivität codiert, welche ausgewählt ist
aus:
- (1) Hydrogenase-Aktivität, bevorzugt
cytoplasmatische und/oder membranständige Hydrogenase-Aktivität;
(2)(a)
Phosphoribulose-Kinase-Aktivität,
Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität;
(2)(b)
Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität;
(2)(c) Citrat-Lyase-Aktivität,
Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität;
und
Fumarat-Reduktase-Aktivität.
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Zur
Herstellbarkeit des Endprodukts Lactat/Milchsäure sieht
die Erfindung bevorzugt weiter vor, dass die Zelle, zusätzlich
enthält:
- (3) Enzymaktivität,
ausgewählt aus:
(a) Lactat-Dehydrogenase,
(b)
Lactat-Oxidoreduktase,
(c) mindestens einer Enzymaktivität
des Methylglyoxalwegs, und
(d) Aldehyd-Dehydrogenase
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Zur
Realisierung der Enzymausstattung enthält die Zelle, besonders
im Genom, besonders in einer Expressionskassette und operativ verknüpft
mit einem Promotor, mindestens ein Nucleinsäuremolekül
mit einer Nucleotidsequenz, welche für mindestens eine
der vorgenannten Enzymaktivitäten codiert.
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Gegenstand
der Erfindung sind auch eine Expressionskassette und ein diese Expressionskassette enthaltender
Vektor, welche geeignet sind, die Expression der erfindungsgemäß vorgesehenen
Enzymaktivitäten in der Wirtszelle zu vermitteln. Bevorzugt
enthält die Expressionskassette zur Transformation einer
Wirtszelle:
- (1) mindestens ein Nucleinsäuremolekül,
codierend für Hydrogenase-Aktivität; und
- (2) mindestens ein heterologes Nucleinsäuremolekül,
codierend für Enzymaktivität ausgewählt
aus:
(2)(a) Phosphoribulose-Kinase-Aktivität und Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität,
wobei in der Expressionskassette, in einem die Expressionskassette
enthaltenden Transformations-Vektor und in der zu transformierenden
Wirtszelle Nucleotidsequenzen, codierend für Enzymaktivität,
ausgewählt aus Fructose-Bisphosphatase-Aktivität
und Fructosebisphosphat-Aldolase-Aktivität, nicht vorhanden
oder nicht exprimiert oder diese Enzymaktivität gehemmt
ist;
(2)(b) Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität;
(2)(c)
Citrat-Lyase-Aktivität,
Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität
und
Fumarat-Reduktase-Aktivität.
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Gegenstand
der Erfindung ist auch ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung
von C2-C6-Körpern als Produkt aus Kohlenstoffdioxid als
Substrat und unter Assimilierung von Wasserstoff, Verwendung transgenen
biologischen Zelle zur biotechnologischen Herstellung von Lactat
oder Milchsäure sowie Alkohol aus Kohlenstoffdioxid.
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Die
Erfindung macht sich die überraschende Erkenntnis zunutze,
dass in einer geeigneten transgenen beziehungsweise rekombinanten
biologischen Zelle, besonders durch rekombinante Expression der
vorgenannten Enzyme beziehungsweise Enzymaktivitäten die
Fixierung von Kohlenstoffdioxid zur Herstellung von organischen
Kohlenstoffverbindungen unter Verwendung eines Elektronendonors,
vor allem Wasserstoff, mit hoher Ausbeute ermöglicht wird.
Die Erfindung stellt somit Mittel zur Durchführung biotechnologischer
Verfahren zu einer neuartigen hocheffektiven Umwandlung von insbesondere
Wasserstoff und CO2 in einfach zu transportierende und nutzbare
Treibstoffe, beispielsweise Alkohole, sowie chemische Grund- und
Wertstoffe, beispielsweise Carbonsäuren und kurzkettige
Fettsäuren dar. Die effektive Nutzung von CO2 als Kohlenstoffquelle
ermöglicht so nicht nur die Realisierung CO2-neutraler
Prozesse, sondern erlaubt durch die ubiquitäre Verfügbarkeit
von CO2 auch eine unabhängige Standortwahl. Die vorliegende
Erfindung macht sich vor allem die Verwendung von Wasserstoff als
Elektronendonor als Energiequelle mikrobieller Prozesse zunutze.
Der Wasserstoff steht dazu üblicherweise aus elektrochemischen
Verfahren aus Wasser oder aus der Fermentation organischer Abfälle
bereit.
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Es
versteht sich, dass die Zelle mindestens eine der vorstehend definierten
Enzymaktivitäten exprimiert. Bevorzugt exprimiert die Zelle
zwei, mehrere und besonders bevorzugt alle der vorstehend definierten Enzymaktivitäten.
Dazu ist das mindestens eine Nucleinsäure molekül
operativ verbunden mit einem Expressionssystem, das heißt
mit einem Promotor oder Promotor-System. Es versteht sich, dass
bevorzugt ein konstitutiver Promotor einsetzt wird. Zur Herstellung
der erfindungsgemäßen Zelle wird der Wildtyp bevorzugt
mit einem geeigneten Expressionsvektor, der die Expressionskassette
enthält, transformiert.
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Die
Transformation der erfindungsgemäßen Zellen und
der Einbau der isolierten Nucleinsäuremoleküle
erfolgt in an sich bekannter Weise, bevorzugt durch entsprechend
geeignete Expressionsvektoren beziehungsweise in Verbindung mit
entsprechenden Expressionskassetten, bevorzugt inklusive entsprechender
Expressionsvektoren. Alternativ erfolgt die de novo-Synthese von
Nucleinsäuremolekülen mit den gewünschten Nucleotidsequenzen,
gegebenenfalls der kompletten Expressionskassette in einem geeigneten
Synthesesystem.
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Bevorzugte Ausführungen der Erfindung
sind:
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Transgene
biologische Zelle, enthaltend, vorzugsweise im Genom und insbesondere
funktionell verknüpft mit einem Promotor:
- (1) mindestens ein Nucleinsäuremolekül, codierend
für Hydrogenase-Aktivität; und
- (2) mindestens ein heterologes Nucleinsäuremolekül,
codierend für Enzymaktivität ausgewählt
aus:
(a) Phosphoribulose-Kinase-Aktivität und
Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität;
wobei
Enzymaktivität, ausgewählt aus:
Fructose-Bisphosphatase-Aktivität
und
Fructosebisphosphat-Aldolase-Aktivität
nicht
exprimiert oder gehemmt wird;
(b) Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität;
(c)
Citrat-Lyase-Aktivität,
Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität
und
Fumarat-Reduktase-Aktivität.
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In
einer ersten Ausführung ist der Calvin-Benson-Bassham-Zyklus
(CBB) realisiert. Dazu enthält die Zelle:
- (1) mindestens ein Nucleinsäuremolekül, codierend
für Hydrogenase-Aktivität; und
- (2)(a) mindestens ein heterologes Nucleinsäuremolekül,
codierend für Phosphoribulose-Kinase-Aktivität und
Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität, wobei mindestens
eine Enzymaktivität, ausgewählt aus: Fructose-Bisphosphatase-Aktivität
und Fructosebisphosphat-Aldolase-Aktivität nicht exprimiert
oder gehemmt wird;
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In
einer bevorzugten Variante enthält diese Zelle, vor allem
zur Steigerung des Synthesepotentials, zusätzlich mindestens
ein heterologes Nucleinsäuremolekül, codierend
für Enzymaktivität, ausgewählt aus:
Fructose-6-Phosphat-Aldolase-Aktivität,
Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität,
Glycerolkinase-Aktivität,
Glycerol-Dehydrogenase-Aktivität
und
Transaldolase-Aktivität.
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In
einer bevorzugten Alternative ist in der Zelle, bevorzugt an Stelle
des CBB, der Serin-Zyklus realisiert. Dazu enthält die
Zelle:
- (1) mindestens ein Nucleinsäuremolekül,
codierend für Hydrogenase-Aktivität; und
- (2)(b) mindestens ein heterologes Nucleinsäuremolekül,
codierend für Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität.
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In
einer bevorzugten Variante weist die Zelle weiter die Enzymaktivität
eines Glycin-Cleavage-Systems auf. Dazu enthält diese Zelle
zusätzlich bevorzugt mindestens ein heterologes oder homologes
Nucleinsäuremolekül codierend für diese
Enzymaktivität.
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In
einer bevorzugten Variante, weist die Zelle die Enzymaktivität
ausgewählt aus:
Serin-Glyoxylat-Aminotransferase-Aktivität,
Hydroxypyruvat-Reduktase-Aktivität,
Malat-Thiokinase-Aktivität,
Maloyl-CoA-Lyase-Aktivität
und
Isocitrat-Lyase-Aktivität, und
bevorzugt
alle diese Aktivitäten auf.
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In
einer bevorzugten Variante enthält diese Zelle zusätzlich
Formiat-Dehydrogenase-Aktivität zur Realisierung unter
Verwendung des Serin-Zyklus. Dazu enthält diese Zelle zusätzlich
bevorzugt mindestens ein heterologes oder homologes Nucleinsäuremolekül
codierend für diese Enzymaktivität.
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In
einer weiteren bevorzugten Alternative ist, bevorzugt an Stelle
des CBB, der reduktive Tricarbonsäure-Zyklus realisiert.
Dazu enthält die Zelle:
- (1) mindestens
ein Nucleinsäuremolekül, codierend für
Hydrogenase-Aktivität; und
- (2)(c) mindestens ein heterologes Nucleinsäuremolekül,
codierend für Citrat-Lyase-Aktivität, Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität
und Fumarat-Reduktase-Aktivität;
bevorzugt sind
Nucleinsäuremoleküle, codierend für alle
diese Aktivitäten vorhanden, wobei zumindest ein Nucleinsäuremolekül
eine heterologe Enzymaktivität codiert.
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In
bevorzugten Varianten dieser Ausführungen enthält
die Zelle: mindestens ein Nucleinsäuremolekül, codierend
für Hydrogenase-Aktivität, ausgewählt
aus:
- (1)(a) membranständiger Hydrogenase-Aktivität,
bevorzugt aus dem Mikroorganismus E. coli, ausgewählt aus
Hydrogenase hyaABC und Hydrogenase hybOCAB; und
- (1)(b) cytoplasmatischer NAD-reduzierender Hydrogenase-Aktivität,
bevorzugt aus dem Mikroorganismus Ralstonia eutropha mit zumindest
den Strukturgenen hoxFUYH.
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Die
Erfindung sieht in allen Varianten grundsätzlich vor, dass
nur diejenigen Gene heterolog rekombiniert sind, die solche Enzymaktivitäten
eines erfindungsgemäß identifizierten Stoffwechselwegs
codieren, die nicht zur Enzymausstattung des Wildtyps der rekombinierten
Zelle gehören. Die homologe Expression ist bevorzugt zur
homologen Überexpression modifiziert. Alternativ ist in
einer erfindungsgemäßen Zelle mindestens eine
der beteiligten Enzymaktivitäten sowohl homolog als auch
heterolog exprimiert.
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Bevorzugt
ist eine Zelle, die eine Lactat-Dehydrogenase-Aktivität
exprimiert beziehungsweise aufweist. Dazu enthält diese
Zelle zusätzlich bevorzugt mindestens ein heterologes oder
homologes Nucleinsäuremolekül codierend für
diese Enzymaktivität.
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Zur
Herstellbarkeit des Endprodukts Lactat/Milchsäure sieht
die Erfindung bevorzugt vor, dass in der erfindungsgemäßen
Zelle die bei der CO2-Assimilation gebildeten Zwischenprodukte überwiegend
oder ausschließlich über die Aktivität
einer Lactat-Dehydrogenase zu Lactat umsetzbar sind. Vorzugsweise
ist in der erfindungsgemäßen Zelle dazu zusätzlich
die Expression mindestens eines Lactat-Transporters realisiert.
Alternativ sieht die Erfindung vor, dass die bei der CO2-Assimilation
gebildeten Zwischenprodukte in der erfindungsgemäßen
Zelle überwiegend oder ausschließlich über
die Aktivität einer Lactat-Oxidoreduktase zu Lactat umsetzbar
sind. Alternativ sieht die Erfindung vor, dass die bei der CO2-Assimilation
gebildeten Zwischenprodukte in der erfindungsgemäßen
Zelle überwie gend oder ausschließlich über
den Methylglyoxalweg zu Lactat umsetzbar sind. Alternativ sieht
die Erfindung vor, dass die bei der CO2-Assimilation gebildeten
Zwischenprodukte in der erfindungsgemäßen Zelle überwiegend
oder ausschließlich über die Aktivität
einer Aldehyd-Dehydrogenase zu Lactat umsetzbar sind.
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Für
enantiomerenreines Lactat ist in der erfindungsgemäßen
Zelle die Expression von Aktivitäten eines enantiomerenselektiven
Enzyms realisiert. Die Aktivität gegebenenfalls vorhandener
homologer Enzyme mit mangelnder oder umgekehrter Stereospezifität
und gegebenenfalls vorhandener Lactat-Racemase-Aktivität
ist in der erfindungsgemäßen Zelle bevozugt gehemmt
oder bevorzugt durch Deletion der beteiligten Gene ausgeschaltet.
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Die
Erfindung umfasst bevorzugt solche transgenen oder rekombinanten
Zellen, die aus Bakterien, Cyanobakterien, Pilzen und Hefen ausgewählt
oder abgeleitet sind. Bevorzugt ist die Zelle ausgewählt
aus Bakterien der Gattungen Escherichia, Corynebacterium, Ralstonia,
Clostridium, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus und Lactococcus.
Besonders bevorzugt ist die Zelle ausgewählt aus Bakterien
der Spezies Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Ralstonia
eutropha, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum und Clostridium
acetobutylicum.
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Die
Erfindung umfasst auch solche biologischen Zellen, die ein synthetischer
Mikroorganismus sind oder davon abgeleitet sind. Unter einer Zelle
werden vorliegend auch Membranvesikel, Membrankompartimente sowie
Teile und Fragmente davon verstanden. Erfindungsgemäß bevorzugt
befinden sich die Enzymaktivitäten im „Inneren"
beziehungsweise Cytosol oder Cytoplasma der Zelle. Alternativ oder
zusätzlich liegt mindestens eine der Enzymaktivitäten
an einer Membran, besonders an einer Zellmembran assoziiert vor.
Die Erfindung umfasst demgemäß auch oder Teile
oder Fragmente eines erfindungsgemäßen transgenen
Mikroorganismus, welche bevorzugt und in an sich bekannter Weise
und unter Erhalt der Enzymaktivität an Trägerstrukturen
assoziiert oder gebunden sind.
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Die
Erfindung umfasst als „Zelle" auch einen Biokatalysator,
worin die Enzymaktivitäten durch isolierte oder synthetisierte
Enzymproteine mit den vorliegend angegebenen Aminosäuresequenzen
realisiert sind. Dies geschieht vorzugsweise unter Umgehung zellulärer
Expressions- und Translationssysteme durch Inkorporation der Enzymproteine
in die Zelle oder den Biokatalysator.
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Rekombinante
Zellen, besonders rekombinante Mikroorganismen, welche die erfindungsgemäßen Gene
enthalten und exprimieren, werden in an sich bekannter Weise durch übliche
Rekombinationstechnologien hergestellt. Es versteht sich, dass die
für die Rekombination ausgewählten Zellen oder
Mikroorganismen gegenüber den gewünschten Stoffwechselendprodukten
ausreichende Resistenz aufweisen. Bevorzugt sind Mikroorganismen,
für die in der biotechnologischen Produktion standardisierte
Kultivierungsbedingungen etabliert sind, sodass sich eine aufwändige
Anpassung der etablierten biotechnologischen Prozessführung
minimieren oder weitgehend vermeiden lässt.
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Vom
Umfang der Erfindung sind auch solche Zellen beziehungsweise Mikroorganismen
und Zelllinien erfasst, die bereits in der nicht rekombinierten/transgenen
Form zumindest eines oder mehrere der Gene beinhalten und exprimieren,
die für eine der erfindungsgemäß vorgesehenen
Enzymaktivitäten codieren. Es versteht sich, dass je nach
Aktivität des vorhanden homologen Gens gegebenenfalls keine
entsprechende Rekombination mit den analogen heterologen Genen erfolgen
braucht. Gegebenenfalls werden an sich bekannte Maßnahmen
zur Sicherstellung der homologen Expression beziehungsweise Überexpression
des homologen Gens getroffen, um den erfindungsgemäßen
Stoffwechselweg vollständig zu realisieren.
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Je
nach Enzymausstattung des Ausgangsorganismus kann es zusätzlich
erforderlich sein, eventuell vorhandene konkurrierende Stoffwechselwege
auszuschalten beziehungsweise zu unterdrücken. Dies kann durch
an sich bekannte Maßnahmen erfolgen. Bevorzugte Ausgestaltungen
solcher „enzymhemmender" Maßnahmen sind nachstehend
beispielhaft für Mikroorganismen der Gattungen Escherichia
und Ralstonia dargestellt. Zellen beziehungsweise Mikroorganismen,
die entsprechende Deletionen zur Unterdrückung von konkurrierenden
Stoffwechselwegen aufweisen, sind ebenfalls von der Erfindung umfasst.
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Eine
bevorzugte Ausführung der Erfindung ist eine transgene
beziehungsweise rekombinante E. coli Zelle, beispielsweise abgeleitet
aus den Zelllinien K12. Eine alternative bevorzugte Ausführung
der Erfindung ist eine transgene beziehungsweise rekombinante Ralstonia
eutropha Zelle.
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Neben
den nachstehend bevorzugt genannten Nucleotidsequenzen und zugehörigen
Aminosäuresequenzen können vergleichbare Gene
aus dem Genom von weiteren Mikroorganismen in an sich bekannter Weise
gefunden werden. Es wird auf die gängigen und an sich bekannten
Tools und Datenbanken der Bioinformatik verwiesen. Ist ein entsprechender
Mikroorganismus, welcher die gewünschte Nucleotidsequenz
in seinem Genom trägt, identifiziert, so können
die entsprechenden Nucleinsäuremoleküle (DNA)
mit den üblichen Verfahren daraus isoliert und amplifiziert
werden.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
Erfindung wird durch die 1 bis 16 näher
erläutert.
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1 zeigt
die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff
in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um die Reaktionen
des Calvin-Benson-Bassham-Zyklus, beteiligt sind.
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2 zeigt
die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff
in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um Teile
des Calvin-Benson-Bassham-Zyklus, beteiligt sind.
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3 und 4 zeigen
die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff
in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um eine
Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase, beteiligt sind.
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5 und 6 zeigen
die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff
in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um eine
Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase und die Schlüsselenzyme des
Serin-Zyklus beteiligt sind.
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7 und 8 zeigen
die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff
in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um die Schlüsselenzyme
des reduktiven Tricarbonsäure zyklus (Citrat-Lyase, Oxoglutarat-Oxidoreduktase
und Fumarat-Reduktase), beteiligt sind.
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9 zeigt
eine Flussverteilung, die das Synthesepotential für Lactat
aus CO2 und Wasserstoff mit den in 1 dargestellten
Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen
auf den Aufnahmefluss an Wasserstoff (100%).
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10 zeigt
eine Flussverteilung, die das Synthesepotential für Lactat
aus CO2 und Wasserstoff mit den in 2 dargestellten
Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen
auf den Aufnahmefluss an Wasserstoff (100%).
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11 zeigt
eine Flussverteilung, die das Synthesepotential für Lactat
aus CO2 und Wasserstoff mit den in 3 dargestellten
Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen
auf den Aufnahmefluss an Wasserstoff (100%).
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12 zeigt
eine Flussverteilung, die das Synthesepotential für Lactat
aus CO2 und Wasserstoff mit den in 4 dargestellten
Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen
auf den Aufnahmefluss an Wasserstoff (100%).
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13 zeigt
eine Flussverteilung, die das Synthesepotential für Lactat
aus CO2 und Wasserstoff mit den in 5 dargestellten
Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen
auf den Aufnahmefluss an Wasserstoff (100%).
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14 zeigt
eine Flussverteilung, die das Synthesepotential für Lactat
aus CO2 und Wasserstoff mit den in 6 dargestellten
Reakti onsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen
auf den Aufnahmefluss an Wasserstoff (100%).
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15 zeigt eine Flussverteilung, die das Synthesepotential
für Lactat aus CO2 und Wasserstoff mit den in 7 dargestellten
Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen
auf den Aufnahmefluss an Wasserstoff (100%).
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16 zeigt eine Flussverteilung, die das Synthesepotential
für Lactat aus CO2 und Wasserstoff mit den in 8 dargestellten
Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen
auf den Aufnahmefluss an Wasserstoff (100%).
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(1) Hydrogenase-Aktivität
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Unter
einer Hydrogenase-Aktivität, wird vorliegend die Fähigkeit
zur Assimilation von elementarem Wasserstoff unter Bildung von Reduktionsäquivalenten
verstanden.
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Die
Erfindung sieht also bevorzugt vor, dass die Wirtszelle mit mindestens
einem heterologen Hydrogenase-Operon ausgestattet wird. In einer
weiteren Variante wird zusätzlich mindestens eine im Wildtyp
der Zelle vorhandene homologe Hydrogenase-Aktivität exprimiert.
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Zur
Realisierung der Hydrogenase-Aktivität ist bevorzugt die
Einbringung des pHG1-Megaplasmids aus Ralstonia eutropha vorgesehen.
Die Nucleotidsequenz des pHG1-Megaplasmids ist in Schwartz et al. 2003
(Schwartz E., Henne A., Cramm R, Eitinger T., Friedrich
B., Gottschalk G. (2003). Complete Nucleotide Sequence of PHG1:
A Ralstonia eutropha H16 Megaplasmid Encoding Key Enzymes of H2-based
Lithoautotrophy and Anaerobiosis. J Mol Biol 332, 369–383.) und
unter Genbank Accession No. AY305378 publiziert; der Inhalt dieser
Publikationen wird vollständig in den Offenbarungsgehalt
der vorliegenden Beschreibung einbezogen. Das Megaplasmid ist 452
kbp groß und trägt 429 potentielle Gene. Darunter
auch mindestens 41 Gene für Hydrogenase-Aktivität.
In einer bevorzugten Variante ist deshalb vorgesehen, dass in die
erfindungsgemäße Zelle ein verkürztes
beziehungsweise modifiziertes Megaplasmid in die Zelle eingebracht
ist, welches zumindest ein Hydrogenase-Operon des Megaplasids enthält.
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Die
Erfindung sieht dazu bevorzugt die rekombinante Expression der cytoplasmatischen
NAD-reduzierenden Hydrogenase-Aktivität aus Ralstonia eutropha
vor. Dazu wird in der erfindungsgemäßen Zelle
bevorzugt die Expression der Strukturgene hoxFUYH, vorzugsweise
zusammen mit der an der Reifung des Enzyms beteiligten Gene, hypC1,
hypD1, hypE1 und hypABF realisiert. Im Zusammenhang mit der Umsetzung mit
dem Transkriptionssystem von Ralstonia ist bevorzugt die Expression
des H2-Sensorsystems hoxA, hoxBC, hoxJ vorgesehen.
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Bevorzugt
stammt die heterologe Hydrogenase-Aktivität aus dem Mikroorganismus
Ralstonia eutropha, besonders das Enzym NAD-Hydrogenase (EC 1.12.7.2),
oder ist daraus abgeleitet. Die Erfindung macht sich dabei die Erkenntnis
zunutze, dass vor allem die rekombinante Hydrogenase aus Ralstonia
eutropha, vorteilhafterweise vergleichsweise aerotolerant ist und
bereits selbst den universell verwendbaren Elektronenakzeptor NAD
nutzt.
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Nach
dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist die NAD-Hydrogenase (EC
1.12.7.2) aus Ralstonia eutropha ein Heterotetramer aus 4 Untereinheiten.
Bevorzugte, diese Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen
sind SEQ ID NO: 1 für Untereinheit hoxF, SEQ ID NO: 3 für
Untereinheit hoxU, SEQ ID NO: 5 für Untereinheit hoxY und
SEQ ID NO: 7 für Untereinheit hoxH. Das Enzymprotein weist
also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 2, 4,
6, und 8 auf.
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Die
Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche mindestens
ein, bevorzugt mindestens zwei, mindestens drei oder bevorzugt alle
heterologe Nucleinsäuremoleküle enthält,
welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
- a) Nucleinsäuremolekülen,
die die Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 enthalten oder daraus bestehen;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die für
Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO:
2, 4, 6, 8 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
- c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter
a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen
zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt
zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine Hydrogenase-Aktivität
codieren.
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Die
Erfindung sieht zur Expression der Hydrogenase-Aktivität
bevorzugt weiter vor: die Expression mindestens eines an der Reifung
der Hydrogenase-Aktivität beteiligten Proteins. Bevorzugt
sind die Strukturgene ausgewählt aus: codierenden Nucleotidsequenzen
SEQ ID NO: 9 für hypC1, SEQ ID NO: 11 für hypD1 und
SEQ ID NO: 13 für hypE1. Für die Proteine hypA,
hypB und hypF sind bevorzugt die codierenden Nucleotidsequenzen
SEQ ID NO: 15 für hypA1, SEQ ID NO: 17 für hypB1
und SEQ ID NO: 19 für hypF1 vorgesehen. Alternativ sind
SEQ ID NO: 21 für hypA2, SEQ ID NO: 23 für hypB2
und SEQ ID NO: 25 für hypF2. Die für die Reifung
relevanten Proteine weisen also bevorzugt die entsprechenden Aminosäuresequenzen
SEQ ID NO: 10, 12, 14, sowie 16, 18, 20 und/oder 22, 24, 26 auf.
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Die
Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche außerdem
mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, drei, vier, fünf,
sechs, sieben, acht oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle
enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe
bestehend aus:
- a) Nucleinsäuremolekülen,
die die Sequenzen SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 enthalten
oder daraus bestehen;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die für
Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO:
10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 enthalten oder daraus bestehen,
codieren; und
- c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter
a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen
zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt
zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt ein Reifungsprotein
für Hydrogenase-Aktivität codieren.
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Die
Erfindung sieht im Zusammenhang mit der Expression der Hydrogenase-Aktivität
bevorzugt weiter vor: die Expression mindestens eines der am H2-Sensor-System
beteiligten Proteine. Bevorzugt ist das H2-Sensor-Protein ausgewählt
aus: codierenden Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 27 für hoxA,
SEQ ID NO: 29 für Untereinheit hoxB und SEQ ID NO: 31 für
Untereinheit hoxC von hoxBC sowie SEQ ID NO: 33 für hoxJ. Die
H2-Sensor-Proteine weisen also bevorzugt die entsprechenden Aminosäuresequenzen
SEQ ID NO: 28, 30, 32 und 34 auf. Das H2-Sensorsystem (hoxA, hoxBC,
hoxJ) wird bevorzugt nur dann realisiert, wenn ein Ralstonia-eigenes
Transkriptionssystem verwendet wird.
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Die
Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche außerdem
mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, mindestens drei oder
bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle enthält,
welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
- a) Nucleinsäuremolekülen,
die die Sequenzen SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33 enthalten oder daraus
bestehen;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die für
Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO:
28, 30, 32, 34 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
- c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter
a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen
zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt
zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt ein H2-Sensor-Protein codieren.
-
Zur
Realisierung der Hydrogenase-Aktivität sieht die Erfindung
alternativ oder bevorzugt zusätzlich die Expression der
Aktivität einer membranständigen Hydrogenase aus
E. coli vor. Dies ist besonders das Enzym Hydrogenase hyaABC und
das Enzym Hydrogenase hybOCAB. In dieser Variante sieht die Erfindung
vor, dass, alternativ oder bevorzugt zusätzlich, die Aktivität
einer membranständigen Hydrogenase exprimiert wird. Bevorzugt
stammt die Hydrogenase-Aktivität aus dem Mikroorganismus
E. coli, besonders das Enzym Hydrogenase hyaABC oder Hydrogenase
hybOCAB, oder es ist davon abgeleitet.
-
In
einer ersten Alternative dieser Variante ist die Expression der
membranständigen Hydrogenase hyaABC realisiert. Nach dem
bisherigen Stand der Erkenntnis ist die Hydrogenase hyaABC aus E.
coli ein Heteromer aus 3 Untereinheiten. Diese Untereinheiten codierenden
Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 137 für Untereinheit
hyaA, SEQ ID NO: 139 für Untereinheit hyaB und SEQ ID NO:
141 für Untereinheit hyaC. Das Enzymprotein Hydrogenase
hyaABC weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ
ID NO: 138, 140 und 142 auf.
-
Die
Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche außerdem
mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle
enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe
bestehend aus:
- a) Nucleinsäuremolekülen,
die die Sequenzen SEQ ID NO: 137, 139, 141 enthalten oder daraus
bestehen;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die für
Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO:
138, 140, 142 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
- c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter
a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen
zumindest 50%, be vorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt
zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine Hydrogenase-Aktivität
codieren.
-
Analog
dazu in einer weiteren Alternative ist, bevorzugt zusätzlich,
die Expression der membranständigen Hydrogenase hybOCAB
realisiert. Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist die Hydrogenase
hybOCAB aus E. coli ein Heteromer aus 4 Untereinheiten. Diese Untereinheiten
codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 149 für
Untereinheit hybO, SEQ ID NO: 155 für Untereinheit hybC,
und SEQ ID NO: 151 für Untereinheit hybA und SEQ ID NO:
153 für Untereinheit hybB. Das Enzymprotein Hydrogenase
hybOCAB weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ
ID NO: 150, 156, 152 und 154 auf.
-
Die
Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche außerdem
mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, mindestens drei oder
bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle enthält,
welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
- a) Nucleinsäuremolekülen,
die die Sequenzen SEQ ID NO: 149, 151, 153, 155 enthalten oder daraus
bestehen;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die für
Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO:
150, 152, 154, 156 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
- c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter
a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen
zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest
90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine Hydrogenase-Aktivität
codieren.
-
Im
Zusammenhang mit der Verwendung der membranständigen Hydrogenasen
aus E. coli ist auch die Expression der zugehörigen Chaperone
hyaD, hyaE und hyaF beziehungsweise hybD, hybE, hybF und hybG zumindest
teilweise realisiert. Die die Chaperone codierenden Nucleotidsequenzen
sind SEQ ID NO: 143 für hyaD, SEQ ID NO: 145 für
hyaE und SEQ ID NO: 147 für hyaF. Die Chaperone weisen
also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 144,
146 und 148 auf. Die Chaperon-Gene hyaE und hyaF sind optional und brauchen
nicht exprimiert zu werden.
-
Die
die Chaperone hybD, hybE, hybF und hybG codierenden Nucleotidsequenzen
sind SEQ ID NO: 157 für hybD, SEQ ID NO: 159 hybE, SEQ
ID NO: 161 für hybF und SEQ ID NO: 163 für hybG.
Die Chaperone weisen also bevorzugt die Aminosäuresequenzen
SEQ ID NO: 158, 160, 162 und 164 auf.
-
Die
Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche außerdem
mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, mindestens drei oder
bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle enthält,
welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
- a) Nucleinsäuremolekülen,
die die Sequenzen SEQ ID NO: 143, 145, 147, 157, 159, 161, 163 enthalten oder
daraus bestehen;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die für
Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO:
144, 146, 148, 158, 160, 162, 164 enthalten oder daraus bestehen,
codieren; und
- c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter
a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen
zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt
zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt Hydrogenase-Chaperone
codieren.
-
(2a) Calvin-Benson-Bassham-Zyklus (CBB)
-
Unter
einer Enzymaktivität eines am CBB beteiligten Enzyms wird
vorliegend die Fähigkeit zur Umsetzung eines Zwischenprodukts
des CBB, Calvin-Zyklus oder reduktivem Pentosephosphatweg, als Substrat
in ein anderes Zwischenprodukt des Zyklus als Produkt der Enzymreaktion
verstanden. Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis sind 11 Enzyme
am CBB beteiligt. Allgemein ist der CBB in drei Abschnitte einteilbar: eigentliche
Kohlenstoff-Fixierung (Carboxylierung), Reduktionsphase (pro drei
Zyklen wird ein C3-Körper als Produkt abgegeben) und Regenerationsphase
des Kohlenstoff-Akzeptors Ribulose-1,5-bisphosphat.
-
Erfindungsgemäß werden
als Schlüsselenzymaktivitäten des CBB die Aktivitäten
einer Phosphoribulose-Kinase (Phosphoribulokinase) und einer Ribulosebisphosphat-Carboxylase
angesehen. Die Erfindung sieht zur Realisierung des CBB in der erfindungsgemäßen
Zelle vor: die gegebenenfalls heterologe Expression von zumindest
einer Phosphoribulose-Kinase-Aktivität und einer Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität.
-
1 zeigt
die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff
in Lactat in Escherichia coli, rekombinant erweitert um die Reaktionen
des Calvin-Benson-Bassham-Zyklus, beteiligt sind.
-
Im
Zusammenhang mit der Realisierung der Phosphoribulose-Kinase-Aktivität
und Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität sieht die
Erfindung vor allem vor, dass in der erfindungsgemäßen
Zelle die Expression von Fructose-Bisphosphatase-Aktivität
und/oder von Fructosebisphosphat-Aldolase-Aktivität durch
Deletion der diese Aktivität codierenden Nucleotidsequenzen
ausgeschaltet ist.
-
Die
Erfindung sieht dazu vor allem vor, dass zur CO2-Assimilation überwiegend
oder ausschließlich der Calvin-Benson-Bassham-Zyklus (CBB)
realisiert wird, wobei in der erfindungsgemäßen
Zelle mindestens eine am CBB beteiligte Enzymaktivitäten
in ausreichendem Umfang exprimiert werden. Es ist bevorzugt vorgesehen,
dass die Expression von Aktivitäten von Enzymen, ausgewählt
aus:
Phosphoribulose-Kinase-Aktivität (Phosphoribulokinase)
und
Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität
und/oder
damit vergleichbare Aktivitäten realisiert ist.
-
Die
Erfindung sieht dazu weiter vor, dass der Calvin-Benson-Bassham-Zyklus
(CBB) unter Vermeidung, Hemmung beziehungsweise Deletion mindestens
einer, bevorzugt beider, gegebenenfalls im Wildtyp der Zelle vorhandenen
Enzymaktivität, ausgewählt aus:
Fructose-Bisphosphatase-Aktivität
und
Fructosebisphosphat-Aldolase-Aktivität
realisiert
wird, falls solche Enzymaktivitäten im Wildtyp homolog
exprimiert werden. Dies ist vor allem im Zusammenhang mit der Verwendung
einer Wirtszelle aus Ralstonia besonders von Ralstonia eutropha
beziehungsweise des Megaplasmids pHG 1 aus Ralstonia eutropha zur
Transformation von Wirtszellen relevant.
-
In
einer Variante sieht die Erfindung vor, dass der CBB unter Hemmung
beziehungsweise Deletion einer Fructose-Bisphosphatase-Aktivität
realisiert ist. Dies geschieht erfindungsgemäß bevorzugt
durch Hemmung der Expression und/oder Deletion mindestens einer
diese Enzymaktivität codierenden Nucleotidsequenz beziehungsweise
mindestens eines der Gene. In Verbindung mit der Verwendung einer
rekombinanten E. coli Zelle sieht die Erfindung dazu bevorzugt vor:
die
Hemmung der Aktivität der Fructose-Bisphosphatase I fbp,
bevorzugt durch Deletion mindestens des Gens für fbp, dargestellt
durch die SEQ ID NO: 77 oder codierend für die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 78, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
die
Hemmung der Aktivität der Fructose-Bisphosphatase II glpX
bevorzugt durch Deletion mindestens des Gens für glpX,
dargestellt durch die SEQ ID NO: 79 oder codierend für
die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 80
-
In
einer, alternativen oder bevorzugt zusätzlichen, Variante
sieht die Erfindung vor, dass der CBB unter Hemmung beziehungsweise
Deletion einer Fructosebisphosphat-Aldolase-Aktivität realisiert
ist. Dies geschieht erfindungsgemäß bevorzugt
durch Hemmung der Expression und/oder Deletion mindestens einer
diese Enzymaktivität codierenden Nucleotidsequenz beziehungsweise
mindestens eines der Gene. In Verbindung mit der Verwendung einer
rekombinanten E. coli Zelle sieht die Erfindung dazu bevorzugt
alternativ oder bevorzugt zusätzlich vor:
die Hemmung
der Fructosebisphosphat-Aldolase II-Aktivität fbaA durch
Deletion mindestens des Gens für fbaA, dargestellt durch
die SEQ ID NO: 81 oder codierend für die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 82, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
die
Hemmung der Fructosebisphosphat-Aldolase I-Aktivität fbaB
durch Deletion mindestens des Gens für fbaB, dargestellt
durch die SEQ ID NO: 83 oder codierend für die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 84.
-
Bevorzugt
stammt die Phosphoribulose-Kinase-Aktivität aus dem Mikroorganismus
Ralstonia eutropha, besonders das Enzym Phosphoribulose-Kinase cbbPp,
oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität
codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 35. Das Enzymprotein
weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 36
auf.
-
Bevorzugt
stammt die Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität aus
dem Mikroorganismus Ralstonia eutropha, besonders das Enzym Ribulosebisphosphat-Carboxylase
cbbSp/cbbLp, oder ist daraus abgeleitet. Nach dem bisherigen Stand
der Erkenntnis ist die Ribulosebisphosphat-Carboxylase aus 2 Untereinheiten aufgebaut.
Bevorzugte, diese Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen
sind SEQ ID NO: 37 für Untereinheit cbbLp und SEQ ID NO:
39 für Untereinheit cbbSp. Das Enzymprotein weist also
bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 40 und 42
auf.
-
In
einer Variante sieht die Erfindung bevorzugt vor, dass zur Realisierung
des CBB in der erfindungsgemäßen Zelle in der
Zelle das pHG1-Megaplasmid aus Ralstonia eutropha vorliegt und dort,
neben des Hydrogenase-Operons besonders die Phosphoribulose-Kinase-Operon
und/oder die Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Operon exprimiert werden.
Dabei ist gemäß der Erfindung vorgesehen, ein
verkürztes oder modifiziertes pHG1-Megaplasmid einzusetzen,
worin die Operons, codierend für Fructose-Bisphosphatase-Aktivität
und Fructosebisphosphat-Aldolase-Aktivität, deletiert oder
unterdrückt sind.
-
Die
Erfindung betrifft bevorzugt eine Zelle, welche mindestens ein,
bevorzugt mindestens zwei oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle
enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe
bestehend aus:
- a) Nucleinsäuremolekülen,
die die Sequenzen SEQ ID NO: 35, 37, 39 enthalten oder daraus bestehen;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die für
Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO:
36, 38, 40 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
- c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter
a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen
zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt
zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine Phosphoribulose-Kinase-Aktivität
und/oder eine Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität
codieren.
-
In
diesen Varianten ist bevorzugt vorgesehen, dass die Expression einer
Fructose-6-Phosphat-Aldolase-Aktivität realisiert ist.
Bevorzugt stammt die Fructose-6-Phosphat-Aldolase-Aktivität
aus dem Mikroorganismus E. coli, besonders ist es das Enzym Fructose-6-Phosphat-Aldolase
fsaA, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität
codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 85. Das Enzymprotein
weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 86
auf.
-
Alternativ
bevorzugt ist das Enzym Fructose-6-Phosphat-Aldolase fsaB, oder
es ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität
codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 87. Das Enzymprotein
weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 88
auf.
-
In
diesen Varianten ist bevorzugt weiter vorgesehen, dass die Expression
einer Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität realisiert
ist. Bevorzugt stammt die Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität
aus dem Mikroorganismus E. coli, besonders ist das Enzym Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase
gpsA, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität
codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 89. Das Enzymprotein
weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 90
auf.
-
Alternativ
bevorzugt ist das Enzym Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase glpABC,
oder es ist daraus abgeleitet. Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis
ist diese Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase aus 3 Untereinheiten
aufgebaut. Bevorzugte, diese Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen
sind SEQ ID NO: 91 für Untereinheit glpA, SEQ ID NO: 93
für Untereinheit glpB und SEQ ID NO: 95 für Untereinheit
glpC. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen
SEQ ID NO: 92, 94 und 96 auf.
-
Alternativ
bevorzugt ist das Enzym Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase glpD,
oder es ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität
codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 97. Das Enzymprotein weist
also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 98 auf.
-
In
diesen Varianten ist bevorzugt weiter vorgesehen, dass die Expression
einer Glycerol-Kinase-Aktivität realisiert ist. Bevorzugt
stammt die Glycerol-Kinase-Aktivität aus dem Mikroorganismus
E. coli, besonders ist das Enzym Glycerol-Kinase glpK, oder ist
daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz
ist SEQ ID NO: 99. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 100 auf.
-
In
diesen Varianten ist bevorzugt weiter vorgesehen, dass die Expression
einer Glycerol-Dehydrogenase-Aktivität realisiert ist.
Bevorzugt stammt die Glycerol-Dehydrogenase-Aktivität aus
dem Mikroorganismus E. coli, besonders ist das Enzym Glycerol-Dehydrogenase
gldA, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität
codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 101. Das Enzymprotein
weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 102
auf.
-
In
diesen Varianten ist schließlich bevorzugt weiter vorgesehen,
dass die Expression einer Transaldolase-Aktivität realisiert
ist. Bevorzugt stammt die Transaldolase-Aktivität aus dem
Mikroorganismus E. coli, besonders ist das Enzym die Transaldolase
talA, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität
codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 103. Das Enzymprotein
weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 104
auf.
-
Alternativ
bevorzugt ist das Enzym die Transaldolase talB, oder es ist daraus
abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende
Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 105. Das Enzymprotein weist also
bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 106 auf.
-
Die
Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche mindestens
ein, bevorzugt mindestens zwei, drei, vier, fünf, sechs,
sieben, acht, neun, zehn oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle
enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe
bestehend aus:
- a) Nucleinsäuremolekülen,
die die Sequenzen SEQ ID NO: 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101,
103, 105 enthalten oder daraus bestehen;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die für
Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO:
86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106 enthalten oder daraus
bestehen, codieren; und
- c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter
a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen
zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt
zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine Enzymaktivität,
ausgewählt aus:
Fructose-6-Phosphat-Aldolase-Aktivität,
Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität,
Glycerolkinase-Aktivität,
Glycerol-Dehydrogenase-Aktivität
und
Transaldolase-Aktivität, codieren.
-
2 zeigt
die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff
in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um Teile
des Calvin-Benson-Bassham-Zyklus, beteiligt sind; Fructosebisphosphat-Aldolase
und Fructose-Bisphosphatase wurden zur Steigerung des Synthesepotentials
ersetzt durch Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase, Glycerol-Kinase,
Glycerol-Dehydrogenase, Fructose-6-Phosphat-Aldolase und Transaldolase.
-
(2b) Serin-Zyklus (SC)
-
Als
Alternative zur Realisierung des CBB steht erfindungsgemäß auch
der Serin-Zyklus (SC) zur Verfügung. Aufgrund des hohen
Energiebedarfs der Fixierung von CO2 im CBB ist mit diesem Weg der
CO2-Fixierung eine Produktion von organischen Substanzen (z. B.
Lactat) nur möglich, wenn zusätzlich zu CO2 ein weiterer
Elektronenakzeptor, beispielsweise Sauerstoff, zur Verfügung
steht. Darüber hinaus weist die im CBB bevorzugt eingesetzte
Ribulosebisphosphat-Carboxylase eine vergleichsweise niedrige Aktivität
auf. Im SC besteht hingegen vorteilhafterweise die prinzipielle
Möglichkeit, auf einen zusätzlichen Elektronenakzeptor
neben CO2 gänzlich zu verzichten. Der SC ist nicht angewiesen
auf die Fixierung von CO2 in der Reaktion der Ribulosebisphosphat-Carboxylase.
Dieses Enzym katalysiert über die CO2-Fixierung hinaus
auch eine unerwünschte Nebenreaktion mit O2 als Substrat,
wodurch die Effizienz des Stoffwechselwegs reduziert wird.
-
Die
Erfindung sieht in dieser alternativen Variante bevorzugt vor, dass
zur CO2-Assimilation überwiegend oder ausschließlich
der Serin-Zyklus (SC) realisiert wird. Die erfindungsgemäße
Realisierung dieses Stoffwechselwegs sieht primär die Expression
einer Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität vor.
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3 zeigt
die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff
in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um eine
Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase, beteiligt sind; zur Assimilation des
Wasserstoffs und zur Synthese von Glycin werden hier homologe Enzyme
verwendet.
-
4 zeigt
die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff
in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um eine
Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase, beteiligt sind; zur Synthese von Glycin
werden hier homologe Enzyme verwendet; die Assimilation von Wasserstoff
geschieht durch eine rekombinante Hydrogenase.
-
Die
erfindungsgemäße Realisierung einer Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität
stellt vor allem die Einschleusung von Formiat in die Übertragung
von C1-Körpern sicher, besonders die Übertragung
von C1-Körpern auf Glycin im Zusammenhang mit einer Serin-Hydroxymethyl-Transferase-Aktivität.
Dieser Prozess ist vor allem in Verbindung mit der Verwendung von
E. coli als Wirtszelle relevant. Bevorzugt ist zusätzlich die
homologe oder heterologe Expression einer, bevorzugt cytosolischen,
Formiat-Dehydrogenase-Aktivität und/oder einer damit vergleichbaren
Aktivität realisiert.
-
Vor
allem im Zusammenhang mit der Verwendung von E. coli als Wirtszelle
im anaeroben Prozess und unter Voraussetzung einer reversiblen Formiat-Hydrogen-Lyase
und Energieerzeugung durch eine Protonengradient-erzeugende Formiat-Dehydrogenase-Aktivität
reicht die Realisierung der erfindungsgemäßen
heterologen Formyl- Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität überraschenderweise
aus, um die Einschleusung von Formiat in die Übertragung
von C1-Körpern zu sichern. Diese überraschende
Erkenntnis macht sich die Erfindung zu nutze, um eine mit geringerem
Aufwand transformierte Zelle bereitzustellen. In diesem Zusammenhang
werden Reduktionsäquivalente, die bei der homologen Formiat-Dehydrogenase-Aktivität
anfallen, übertragen auf C1-Tetrahydrofolat, Pyruvat etc.
Es wird auf die in 3 dargestellten erfindungsgemäßen
Stoffwechselwege verwiesen.
-
Zur
erfindungsgemäßen Realisierung dieses Stoffwechselwegs
wird erfindungsgemäß mindestens eine Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität
exprimiert. Bevorzugt stammt die Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität
aus dem Mikroorganismus Methylobacterium extorquens, besonders das
Enzym Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase ftfL, oder ist daraus abgeleitet.
Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist
SEQ ID NO: 107. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 108 auf.
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Die
Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche mindestens
ein, Nucleinsäuremolekül enthält, welche
ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
- a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenz
SEQ ID NO: 107 enthalten oder daraus bestehen;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die für
Aminosäuremoleküle, die die Sequenz SEQ ID NO:
108 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
- c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter
a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen
zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt
zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine Aktivität
von Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase codieren.
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In
einer bevorzugten Variante dieser Ausführung ist der SC
unter Einbeziehung einer in der Wirtszelle vorhandenen Glycin-Cleavage-System-Aktivität
realisiert. Dies ist vor allem bei Verwendung der Wirtszellen E. coli
oder Ralstonia relevant. Erfindungsgemäß bevorzugt
wird eine, bevorzugt wirtseigene, Glycin-Cleavage-System-Aktivität
exprimiert. Bevorzugt stammt die Glycin-Cleavage-System-Aktivität
gcvPHT und lpd aus E. coli oder ist daraus abgeleitet. Nach dem
bisherigen Stand der Erkenntnis ist das Glycin-Cleavage-System von
E. coli aus 4 Untereinheiten aufgebaut. Bevorzugte, diese Untereinheiten
codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 189 für
Untereinheit gcvP, SEQ ID NO: 191 für Untereinheit gcvH
und SEQ ID NO: 193 für Untereinheit gcvT sowie SEQ ID NO:
63 für Untereinheit lpd. Das Enzymsystem weist also bevorzugt
die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 190, 192, 194 und 64
auf.
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Die
Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche mindestens
ein, Nucleinsäuremolekül enthält, welche
ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
- a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen
SEQ ID NO: 189, 191, 193, 63 enthalten oder daraus bestehen;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die für
Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO:
190, 192, 194, 64 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
- c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter
a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen
zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt
zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine Aktivität
des Glycin-Cleavage-Systems codieren.
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In
einer bevorzugten alternativen Variante ist vorgesehen, dass, alternativ
zum wirtseigenen Glycin-Cleavage-Systems oder gegebenenfalls zusätzlich,
die rekombinante Expression von Aktivitäten von Schlüsselenzymen
des SC, ausgewählt aus:
Serin-Glyoxylat-Aminotransferase-Aktivität,
Hydroxypyruvat-Reduktase-Aktivität,
Malat-Thiokinase-Aktivität,
Malyl-CoA-Lyase-Aktivität
und
Isocitrat-Lyase-Aktivität
und/oder damit
vergleichbare Aktivitäten realisiert ist. Unter einer Enzymaktivität
eines am SC beteiligten Enzyms wird vorliegend die Fähigkeit
zur Umsetzung eines Zwischenprodukts des SC als Substrat in ein
anderes Zwischenprodukt des Zyklus als Produkt der Enzymreaktion
verstanden. Unter Schlüsselenzymen des SC werden vorliegend
Serin-Glyoxylat-Aminotransferase, Hydroxypyruvat-Reduktase, Malat-Thiokinase,
Glycerol-Dehydrogenase Malyl-CoA-Lyase und Isocitrat-Lyase verstanden.
Bevorzugt werden alle der vorgenannten Enzymaktivitäten
exprimiert, bevorzugt werden alle am SC beteiligten Enzymaktivitäten
in ausreichendem Umfang exprimiert. Bevorzugt wird mindestens eine,
besonders bevorzugt mindestens zwei dieser Enzymaktivitäten
heterolog exprimiert.
-
In
einer erfindungsgemäß bevorzugten Realisierung
der Serin-Glyoxylat-Aminotransferase-Aktivität erlaubt
dies die Umgehung der Glycin-Cleavage-System-Aktivität,
welche im Zusammenhang mit der Verwendung von E. coli als Wirtszelle
vorhanden ist. Sie nutzt gleichzeitig die Aminogruppe aus Serin
zur Synthese von Glycin aus Glyoxylat. Die erfindungsgemäß bevorzugte
Realisierung einer Hydroxypyruvat-Reduktase-Aktivität erlaubt
die Umsetzung des Stoffwechselprodukts der Serin-Glyoxylat-Aminotransferase
gemeinsam mit der Glycerat-Kinase im Embden-Meyerhof-Parnas-Weg,
welcher in der erfindungsgemäßen Zelle bevorzugt realisiert
ist. Die Regeneration von Glyoxylat erfolgt optional, alternativ
oder bevorzugt zusätzlich, über eine homologe
Phosphoenolpyrovat-Carboxylase-Aktivität, Tricarbonsäure-
und Glyoxylat-Weg; dies ist vor allem im Zusammenhang mit der Verwendung
von E. coli als Wirtszelle relevant. Die erfindungsgemäße
bevorzugte Realisierung der Isocitrat-Lyase-Aktivität wird
bevorzugt auch als Teil des Glyoxylat-Wegs auch an der Glyoxylat-Regenerierung
im Serin-Weg wirken. Dies ist vor allem im Zusammenhang mit der
Verwendung von E. coli als Wirtszelle relevant.
-
Bevorzugt
stammt die Serin-Glyoxylat-Aminotransferase-Aktivität aus
dem Mikroorganismus Methylobacterium extorquens, besonders ist das
Enzym Serin-Glyoxylat-Aminotransferase sgaA, oder ist daraus abgeleitet.
Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz
ist SEQ ID NO: 113. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 114 auf.
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Bevorzugt
stammt die Hydroxypyruvat-Reduktase-Aktivität aus dem Mikroorganismus
Methylobacterium extorquens, besonders ist das Enzym Hydroxypyruvat-Reduktase
hprA, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität
codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 115. Das Enzymprotein
weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 116
auf.
-
Bevorzugt
stammt die Serin-Malat-Thiokinase-Aktivität aus dem Mikroorganismus
Methylobacterium extorquens, besonders ist das Enzym Malat-Thiokinase
mtkAB, oder ist daraus abgeleitet. Nach dem bisherigen Stand der
Erkenntnis ist die Malat-Thiokinase aus 2 Untereinheiten aufgebaut.
Bevorzugte, diese Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen
sind SEQ ID NO: 117 für Untereinheit mtkA und SEQ ID NO:
119 für Untereinheit mtkB. Das Enzymprotein weist also
bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 118 und 120
auf.
-
Bevorzugt
stammt die Glycerol-Dehydrogenase Malyl-CoA-Lyase-Aktivität
aus dem Mikroorganismus Methylobacterium extorquens, besonders ist
das Enzym Glycerol-Dehydrogenase Malyl-CoA-Lyase mclA, oder ist
daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende
Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 121. Das Enzymprotein weist also
bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 122 auf.
-
Bevorzugt
stammt die Isocitrat-Lyase-Aktivität aus E. coli, besonders
ist das Enzym Isocitrat-Lyase aceA, oder ist daraus abgeleitet.
Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz
ist SEQ ID NO: 111. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 112 auf. Im Zusammenhang mit der Verwendung einer Wirtszelle
vom Stamm E. coli, ist die Expression der Isocitrat- Lyase-Aktivität
realisiert durch homologe Expression, bevorzugt durch homologe Überexpression.
-
Die
Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche mindestens
ein, bevorzugt mindestens zwei, drei, vier, fünf oder bevorzugt
alle Nucleinsäuremoleküle enthält, welche
ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
- a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen
SEQ ID NO: 111, 113, 115, 117, 119 enthalten oder daraus bestehen;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die für
Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO:
112, 114, 116, 118, 120 enthalten oder daraus bestehen, codieren;
und
- c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter
a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen
zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt
zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt die Aktivität
von Schlüsselenzymen des SC, ausgewählt aus: Serin-Glyoxylat-Aminotransferase-Aktivität,
Hydroxypyruvat-Reduktase-Aktivität, Malat-Thiokinase-Aktivität,
Glycerol-Dehydrogenase Malyl-CoA-Lyase-Aktivität und Isocitrat-Lyase-Aktivität,
codieren.
-
5 zeigt
die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff
in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um eine
Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase und die Schlüsselenzyme des Serin-Zyklus
(Serin-Glyoxylat-Aminotransferase, Hydroxypyruvat-Reduktase, Malat-Thiokinase
und Malyl-CoA-Lyase), beteiligt sind; zur Assimilation von Wasserstoff
wird eine homologe Hydrogenase verwendet.
-
6 zeigt
die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff
in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um eine
Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase und die Schlüsselenzyme des Serin-Zyklus
(Serin-Glyoxylat-Aminotransferase, Hydroxypyruvat-Reduktase, Malat-Thiokinase
und Malyl-CoA-Lyase), beteiligt sind; zur Assimilation von Wasserstoff
wird eine rekombinante Hydrogenase verwendet.
-
Wird
zur erfindungsgemäßen Realisierung einer rekombinanten
Hydrogenase-Aktivität das pHG1-Megaplasmid aus Ralstonia
eutropha in die erfindungsgemäße Zelle eingeführt,
muss zur Unterdrückung des CBB dort zumindest eine Deletion
von Genen für Schlüsselenzyme des CBB, welche
auf dem kompletten pHG1-Megaplasmid vorhanden sind, erfolgt sein.
Bevorzugt sind auf dem Megaplasmid die Gene für Phosphoribulose-Kinase
cbbPp (SEQ ID NO: 35) und/oder Ribulosebisphoshat-Carboxylase cbbLp
(SEQ ID NO: 37) und cbbSp (SEQ ID NO: 39) deletiert.
-
(2c) reduktiver Tricarbonsäurezyklus
(RTCC)
-
Als
weitere Alternative zum CBB steht der erfindungsgemäß auch
der reduktive Tricarbonsäurezyklus (RTCC) zur Verfügung.
Ebenso wie bei der erfindungsgemäßen Variante
der Realisierung des SC kann vorteilhafterweise auf einen zusätzlichen
Elektronenakzeptor neben CO2 gänzlich verzichtet werden;
auf die gegebenenfalls nachteilige Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität
des CBB wird in dieser alternativen Weiterbildung ebenfalls verzichtet.
-
Unter
einer Enzymaktivität eines am RTCC beteiligten Enzyms wird
vorliegend die Fähigkeit zur Umsetzung eines Zwischenprodukts
des RTCC als Substrat in ein anderes Zwischenprodukt des Zyklus
als Produkt der Enzymreaktion verstanden. Unter Schlüsselenzymen
des RTCC werden vorliegend Citrat-Lyase, Oxoglutarat-Oxidoreduktase
und Fumarat-Reduktase verstanden.
-
Die
Erfindung sieht in einer alternativen Variante bevorzugt vor, dass
zur CO2-Assimilation überwiegend oder ausschließlich
der reduktive Tricarbonsäurezyklus (RTCC) realisiert wird,
wobei in der erfindungsgemäßen Zelle alle am RTCC
beteiligten Enzymaktivitäten in ausreichendem Umfang exprimiert
werden. Dazu ist erfindungsgemäß primär
vorgesehen, dass die Expression von Aktivitäten von Schlüsselenzymen
des RTCC, ausgewählt aus:
Citrat-Lyase-Aktivität,
Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität
und
Fumarat-Reduktase-Aktivität
und/oder damit
vergleichbare Aktivitäten realisiert wird.
-
Bevorzugt
werden alle der vorgenannten Enzymaktivitäten exprimiert,
bevorzugt werden alle am RTCC beteiligten Enzymaktivitäten
in ausreichendem Umfang exprimiert. Bevorzugt wird mindestens eine,
besonders bevorzugt mindestens zwei dieser Enzymaktivitäten
heterolog exprimiert.
-
Bevorzugt
stammt die Citrat-Lyase-Aktivität aus dem Mikroorganismus
Chlorobium tepidum, besonders ist das Enzym Citrat-Lyase aclAB,
oder ist daraus abgeleitet. Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist
diese Citrat-Lyase aus 2 Untereinheiten aufgebaut. Be vorzugte, diese
Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 123
für Untereinheit aclA, und SEQ ID NO: 125 für
Untereinheit aclB. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen
SEQ ID NO: 124 und 126 auf.
-
Alternativ
stammt die Citrat-Lyase-Aktivität aus E. coli, besonders
das Enzym Citrat-Lyase citFED, oder ist daraus abgeleitet. Nach
dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist diese Citrat-Lyase aus 3
Untereinheiten aufgebaut. Bevorzugte, diese Untereinheiten codierenden
Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 127 für Untereinheit
citF, SEQ ID NO: 129 für Untereinheit citE und SEQ ID NO:
131 für Untereinheit citD. Das Enzymprotein weist also
bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 128, 130 und
132 auf. Im Zusammenhang mit der Verwendung einer Wirtszelle vom
Stamm E. coli, ist die Expression einer aktiven Citrat-Lyase-Aktivität realisiert
durch homologe Expression, bevorzugt durch homologe Überexpression
eines, gegebenenfalls durch Spontanmutation, mutierten Allels der
ursprünglich inaktiven Citrat-Lyase von E. coli.
-
Bevorzugt
stammt die Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität aus dem
Mikroorganismus Hydrogenobacter thermophilus, besonders ist das
Enzym Oxoglutarat-Oxidoreduktase korAB, oder ist daraus abgeleitet. Nach
dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist diese Oxoglutarat-Oxidoreduktase
aus 2 Untereinheiten aufgebaut. Bevorzugte, diese Untereinheiten
codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 133 für
Untereinheit korA, und SEQ ID NO: 135 für Untereinheit
korB. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen
SEQ ID NO: 134 und 136 auf.
-
Bevorzugt
stammt die Fumarat-Reduktase-Aktivität aus E. coli, besonders
ist das Enzym Fumarat-Reduktase frdDCBA, oder ist daraus abgeleitet.
Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist die Fumarat-Reduktase
aus 4 Untereinheiten aufgebaut. Bevorzugte, diese Untereinheiten
codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 57 für Untereinheit
frdD, SEQ ID NO: 55 für Untereinheit frdC, SEQ ID NO: 53
für Untereinheit frdB und SEQ ID NO: 51 für Untereinheit
frdA. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen
SEQ ID NO: 58, 56, 54 und 52 auf. Im Zusammenhang mit der Verwendung
einer Wirtszelle vom Stamm E. coli, ist die Expression der Fumarat-Reduktase-Aktivität
realisiert durch homologe Expression, bevorzugt durch homologe Überexpression.
-
Die
Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche mindestens
ein, bevorzugt mindestens zwei, drei, vier, fünf, sechs,
sieben, acht, neun, zehn oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle
enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe
bestehend aus:
- a) Nucleinsäuremolekülen,
die die Sequenzen SEQ ID NO: 51, 53, 57, 123, 125, 127, 129, 131,
133, 135 enthalten oder daraus bestehen;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die für
Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO:
52, 54, 56, 58, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136 enthalten oder
daraus bestehen, codieren; und
- c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter
a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen
zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt
zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und be vorzugt eine Aktivitäten
von Schlüsselenzymen des RTCC, ausgewählt aus:
Citrat-Lyase-Aktivität, Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität
und Fumarat-Reduktase-Aktivität, codieren.
-
In
einer bevorzugten Variante ist zusätzlich die homologe
und bevorzugt die heterologe Expression einer, bevorzugt reversiblen,
Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreduktase-Aktivität beziehungsweise
Pyruvat-Synthase-Aktivität und/oder einer damit vergleichbaren
Aktivität realisiert. Besonders im Zusammenhang mit der
Verwendung von E. coli oder Pseudomonas putida als Wirtszelle ist
in einer alternativen Variante vorgesehen, dass durch die homologe
oder gegebenenfalls heterologe Expression von Enzymaktivität
des Malat-Wegs, bevorzugt durch eine NAD-abhängige Malatenzym-Aktivität,
vozugsweise das NAD-abhängige Malatenzym aus E. coli, das
Zwischenprodukt Oxalacetat durch Decarboxylierung irreversibel in
Pyruvat umgewandelt wird. Alternativ oder zusätzlich ist
vorgesehen, das Zwischenprodukt Oxalacetat durch homologe oder gegebenenfalls heterologe
Expression von Oxalacetat-Decarboxylase-Aktivität, vorzugsweise
die Oxalacetat-Decarboxylase aus E. coli, umzuwandeln. Es ziegt
sich, dass vorteilhafterweise sowohl Malatenzym als auch Oxalacetat-Decarboxylase
jeweils allein die erforderliche Funktion der Bereitstellung von
Pyruvat aus einem Metaboliten des RTCC (Malat oder Oxalacetat) leisten
können.
-
Bevorzugt
ist die homologe Überexpression mindestens einer der vorgenannten
Enzym-Aktivitäten vorgesehen, um vorteilhafterweise zu
verhindern, dass Nebenprodukte aus dem Tricarbonsäurezyklus
anstelle von Lactat produziert werden. Im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen
Herstellung von Lactat/Milchsäure ist daher be vorzugt diese
Maßnahme vorgesehen, um den irreversiblen Abfluss aus dem
Tricarbonsäurezyklus zu realisieren. In Organismen, die
natürlicherweise den RTCC als Fixierungsweg für
CO2 einsetzen, ist dieser in der Regel verbunden mit einer Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreduktase-Aktivität.
Entgegen der Erwartung führt aber auch der mit Malatenzym-Aktivität
oder Oxalacetat-Decarboxylase-Aktivität verbundene Decarboxylierungsschritt,
der ebenfalls die Herstellung von Pyruvat aus einem Metaboliten
des RTCC zur Folge hat, nicht zu einer Einschränkung der
Einsetzbarkeit des RTCC als hocheffizienten Weg zur CO2-Fixierung.
-
7 zeigt
die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff
in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um die Schlüsselenzyme
des reduktiven Tricarbonsäurezyklus (Citrat-Lyase, Oxoglutarat-Oxidoreduktase
und Fumarat-Reduktase), beteiligt sind. Hierbei wird zur Assimilation von
Wasserstoff eine homologe Hydrogenase verwendet.
-
8 zeigt
die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff
in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um die Schlüsselenzyme
des reduktiven Tricarbonsäurezyklus (Citrat-Lyase, Oxoglutarat-Oxidoreduktase
und Fumarat-Reduktase), beteiligt sind. Hierbei wird Sauerstoff
als terminaler Elektronenakzeptor verwendet. Zur Assimilation von
Wasserstoff wird eine rekombinante Hydrogenase verwendet.
-
Wird
zur erfindungsgemäßen Realisierung einer rekombinanten
Hydrogenase-Aktivität das pHG1-Megaplasmid aus Ralstonia
eutropha in die erfindungsgemäße Zelle eingeführt,
muss zur Unterdrückung des CBB dort zumindest eine Deletion
von Genen für Schlüsselenzyme des CBB, welche
auf dem kompletten pHG1-Megaplasmid vorhanden sind, erfolgt sein.
Bevorzugt sind auf dem Megaplasmid die Gene für Phosphoribulose-Kinase
cbbPp und/oder Ribulosebisphoshat-Carboxylase cbbLp und cbbSp deletiert.
-
(3) Lactat-Synthese
-
Zur
Unterstützung des Lactat-Synthesestoffwechsels sieht die
Erfindung bevorzugt weiter vor, den potentiellen Abbau von Lactat-Vorläufern
zu unterdrücken und den Stofffluss in Richtung Lactat zu
lenken. Dies wird bevorzugt realisiert durch Hemmung von gegebenenfalls
in der erfindungsgemäßen Zelle vorhandenen Enzymaktivitäten
konkurrierender Stoffwechselwege und/oder vergleichbarer Enzymaktivitäten,
vorzugsweise durch Hemmung der Expression und/oder Deletion der
diese Enzymaktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen beziehungsweise
Gene.
-
Besonders
im Zusammenhang mit der Verwendung von E. coli oder Pseudomonas
putida als Wirtszelle ist zur Herstellung von Lactat/Milchsäure
weiter vorgesehen, Acetat-umsetzende Stoffwechselwege zu unterdrücken,
um die Bildung von Acetat als unerwünschtem Nebenprodukt
zu unterdrücken. Im Zusammenhang mit der Realisierung des
CBB wird dazu bevorzugt mindestens ein Enzym, bevorzugt alle Enzyme,
ausgewählt aus:
Acetat-Kinase A-/Propionat-Kinase
2-Aktivität
Phosphat-Acetyl-Transferase-Aktivität,
Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität,
Pyruvat-Formiat-Lyase
I-Aktivität,
Acetaldehyd-CoA-Dehydrogenase-Aktivität,
Fumarat-Reduktase-Aktivität,
Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität,
Succinat-Dehydrogenase-Aktivität
gehemmt
beziehungsweise deletiert.
-
Im
Zusammenhang mit der Realisierung des SC oder RTCC wird dazu mindestens
ein Enzym, bevorzugt alle Enzyme, ausgewählt aus:
Acetat-Kinase
A-/Propionat-Kinase 2-Aktivität
Phosphat-Acetyl-Transferase-Aktivität,
Pyruvat-Formiat-Lyase
I-Aktivität,
Acetaldehyd-CoA-Dehydrogenase-Aktivität,
Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität
gehemmt
beziehungsweise deletiert.
-
Besonders
in Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten E. coli Zelle
sieht die Erfindung dazu bevorzugt vor:
die Hemmung der Phosphat-Acetyltransferase-Aktivität
bevorzugt durch Deletion mindestens eines der Gene für
pta, dargestellt durch die SEQ ID NO: 41 oder codierend für
die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 42, und alternativ oder
bevorzugt zusätzlich
gegebenenfalls (bei CBB) die
Hemmung der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität bevorzugt
durch Deletion mindestens eines der Gene für ppc, dargestellt
durch die SEQ ID NO: 43 oder codierend für die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 44, wobei die Hemmung der Phosphoenolpyruvat- Carboxylase-Aktivität
ppc in diesem Zusammenhang weniger bevorzugt ist.
-
Besonders
in Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten E. coli Zelle
im anaeroben Prozess sieht die Erfindung dazu alternativ oder bevorzugt
zusätzlich vor:
die Hemmung der Pyruvat-Formiat-Lyase
I-Aktivität bevorzugt durch Deletion mindestens eines der
Gene für pflB, dargestellt durch die SEQ ID NO: 45 oder
codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:
46, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
die Hemmung
der Acetat-Kinase A/Propionat-Kinase 2-Aktivität bevorzugt
durch Deletion mindestens eines der Gene für ackA, dargestellt
durch die SEQ ID NO: 47 oder codierend für die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 48, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
die
Hemmung der Acetaldehyd-CoA-Dehydrogenase-Aktivität bevorzugt
durch Deletion mindestens eines der Gene für adhE, dargestellt
durch die SEQ ID NO: 49 oder codierend für die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 50, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
gegebenenfalls
(bei CBB) die Hemmung der anaeroben Fumarat-Reduktase-Aktivität
bevorzugt durch Deletion mindestens eines der Gene für
frdABCD, dargestellt durch die SEQ ID NO: 51, 53, 55 und 57 oder
codierend für die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO:
52, 54, 56 und 58, besonders bevorzugt von frdA und/oder frdB.
-
Besonders
in Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten E. coli Zelle
im aeroben Prozess sieht die Erfindung dazu alternativ bevorzugt
vor:
die Hemmung der Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität
bevorzugt durch Deletion mindestens eines der Gene für aceEF/lpdA,
dargestellt durch die SEQ ID NO: 59 und 61, sowie 63 oder codierend
für die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 60 und
62, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
die Hemmung
der Acetat-Kinase A/Propionat-Kinase 2-Aktivität bevorzugt
durch Deletion mindestens eines der Gene für ackA und alternativ
oder bevorzugt zusätzlich
die Hemmung der Acetaldehyd-CoA-Dehydrogenase-Aktivität
bevorzugt durch Deletion mindestens eines der Gene für
adhE und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
die
Hemmung der Succinat-Dehydrogenase-Aktivität bevorzugt
durch Deletion mindestens eines der Gene für sdhABCD, dargestellt
durch die SEQ ID NO: 65, 67, 69 und 71 oder codierend für
die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 66, 68, 70 und 72, besonders
bevorzugt von sdhA und/oder sdhB.
-
Zur
Herstellung von enantiomerenreinem D-Lactat sieht die Erfindung
bevorzugt vor, dass die Expression einer D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität
und/oder einer damit vergleichbaren Aktivität realisiert
ist. Bevorzugt stammt die D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität
aus E. coli, besonders ist es das Enzym Lactat-Dehydrogenase ldhA,
oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität
codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 73. Das Enzymprotein
weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 74
auf.
-
Alternativ
oder bevorzugt zusätzlich stammt die D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität
aus Lactobacillus plantarum, besonders ist es das Enzym Lactat-Dehydrogenase
ldhD, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität
codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 185. Das Enzymprotein
weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 186
auf.
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Im
Zusammenhang mit der Verwendung einer Wirtszelle vom Stamm E. coli,
ist die Expression der D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität
realisiert durch homologe Expression, bevorzugt durch homologe Überexpression.
Im Zusammenhang mit einer aeroben Prozessführung ist die
heterologe Expression oder homologe Überexpression einer
Lactat-Dehydrogenase-Aktivität obligatorisch.
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Weiter
ist zur Herstellung von enantiomerenreinem D-Lactat bevorzugt vorgesehen,
dass die Expression einer D-Lactat-Transporter-Aktivität
und/oder einer damit vergleichbaren Aktivität realisiert
ist. Bevorzugt stammt die D-Lactat-Transporter-Aktivität
aus E. coli, besonders ist es der Transporter lldP beziehungsweise lctP,
oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität
codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 165. Das Enzymprotein
weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 166
auf.
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Die
Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche mindestens
ein, oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle
enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe
bestehend aus:
- a) Nucleinsäuremolekülen,
die die Sequenzen SEQ ID NO: 73, 165, 185 enthalten oder daraus
bestehen;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die für
Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO:
74, 166, 186 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
- c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter
a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen
zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt
zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität
und/oder D-Lactat-Transporter-Aktivität codieren.
-
Vor
allem im Zusammenhang mit der Verwendung einer E. coli Zelle zur
Herstellung von D-Lactat sieht die Erfindung dazu zusätzlich
vor:
die Hemmung der homologen L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität,
bevorzugt durch Deletion der Gene für lldD, dargestellt
durch die SEQ ID NO: 75 oder codierend für die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 76.
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Vor
allem im Zusammenhang mit der Verwendung einer Lactobacillus Zelle
zur Herstellung von D-Lactat im anaeroben Prozess sieht die Erfindung
dazu zusätzlich vor:
die Hemmung der homologen L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität,
bevorzugt durch Deletion des Gens für ldhL1, dargestellt
durch die SEQ ID NO: 167 oder codierend für die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 168, und alternativ und bevorzugt zusätzlich
durch Deletion des Gens für ldhL2, dargestellt durch die
SEQ ID NO: 169 oder codierend für die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 170, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
die
Hemmung der homologen Lactat-Racemase-Aktivität, bevorzugt
durch Deletion mindestens eines der Gene für larABC1C2E_glpF1,
dargestellt durch die SEQ ID NO: 173, 175, 177, 179 und 181 oder
codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:
174, 176, 178, 180 und 182.
-
Zur
Herstellung von enantiomerenreinem L-Lactat sieht die Erfindung
bevorzugt vor, dass die Expression einer L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität
und/oder einer damit vergleichbaren Aktivität realisiert
ist. Bevorzugt stammt die L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität
aus E. coli, besonders ist es das Enzym L-Lactat:Chinon-Oxidoreduktase
(L-Lactat-Dehydrogenase) lctD beziehungsweise lldD, oder ist daraus
abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende
Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 75. Das Enzymprotein weist also
bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 76 auf. Im Zusammenhang
mit der Verwendung einer Wirtszelle vom Stamm E. coli, ist die homologe
Expression der L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität bevorzugt
realisiert durch homologe Überexpression der L-Lactat:Chinon-Oxidoreduktase
(L-Lactat-Dehydrogenase) lctD beziehungsweise lldD.
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Alternativ
oder bevorzugt zusätzlich stammt die L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität
aus dem Mikroorganismus Lactobacillus plantarum. Bevorzugt ist es
das Enzym Lactat-Dehydrogenase ldhL1 oder es ist daraus abgeleitet.
Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz
ist SEQ ID NO: 167. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 168 auf. Alternativ oder zusätzlich ist es das
Enzym Lactat-Dehydrogenase ldhL2 oder es ist daraus abgeleitet.
Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz
ist SEQ ID NO: 169. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ
ID NO: 170 auf.
-
Weiter
ist zur Herstellung von enantiomerenreinem L-Lactat bevorzugt vorgesehen,
dass die Expression einer L-Lactat-Transporter-Aktivität
und/oder einer damit vergleichbaren Aktivität realisiert
ist. Bevorzugt stammt die L-Lactat-Transporter-Aktivität
aus dem Mikroorganismus Lactobacillus plantarum, besonders ist es der
Transporter lctP, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese
Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 171.
Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 172 auf.
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Die
Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche mindestens
ein, bevorzugt mindestens zwei, oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle
enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe
bestehend aus:
- a) Nucleinsäuremolekülen,
die die Sequenzen SEQ ID NO: 167, 171, 75 enthalten oder daraus
bestehen;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die für
Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO:
168, 172, 76 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
- c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter
a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen
zumindest 50%, be vorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt
zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität
und/oder eine L-Lactat-Transporter-Aktivität codieren.
-
Vor
allem im Zusammenhang mit der Verwendung einer E. coli Zelle zur
Herstellung von L-Lactat im anaeroben Prozess sieht die Erfindung
dazu zusätzlich vor:
die Hemmung der homologen fermentativen
D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität, bevorzugt durch Deletion
der Gene für ldhA, dargestellt durch die SEQ ID NO: 73
oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID
NO: 74.
-
Vor
allem im Zusammenhang mit der Verwendung einer E. coli Zelle zur
Herstellung von L-Lactat im aeroben Prozess sieht die Erfindung
dazu zusätzlich vor:
die Hemmung der homologen D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität,
bevorzugt durch Deletion der Gene für dld, dargestellt
durch die SEQ ID NO: 187 oder codierend für die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 188.
-
Vor
allem im Zusammenhang mit der Verwendung einer Lactobacillus Zelle
zur Herstellung von L-Lactat sieht die Erfindung dazu zusätzlich
vor:
die Hemmung der homologen D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität,
bevorzugt durch Deletion des Gens für ldhD, dargestellt
durch die SEQ ID NO: 185 oder codierend für die Ami nosäuresequenz
SEQ ID NO: 186, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
die
Hemmung der homologen Lactat-Racemase-Aktivität, bevorzugt
durch Deletion mindestens eines der Gene für larABC1C2E_glpF1,
dargestellt durch die SEQ ID NO: 173, 175, 177, 179 und 181 oder
codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:
174, 176, 178, 180 und 182.
-
Die
vorstehend charakterisierten erfindungsgemäßen
rekombinanten Mikroorganismen beziehungsweise transgenen biologischen
Zellen sind besonders geeignet für die biotechnologische
Synthese von Lactat/Milchsäure und anderen Carbonsäuren
oder kurzkettigen Fettsäuren. Das sind erfindungsgemäß C2-
bis C6-Körper, bevorzugt C3 bis C6-Körper. Bevorzugte
Stoffwechselendprodukte, die sich mittels der erfindungsgemäßen
Zellen erzeugen lassen, sind kurzkettige Carbonsäuren,
vor allem Mono- und Dicarbonsäuren, bevorzugt D-Lactat
und L-Lactat, Acetat/Essigsäure, Formiat/Ameisensäure
und Succinat/Bernsteinsäure, sowie ein- und mehrwertige
Alkohole, bevorzugt Ethanol. Sie dienen als Ausgangssubstanzen für
die weitere organische Synthese, zum Beispiel zur Herstellung von
Kunststoffen (z. B. Polylactate). Die erfindungsgemäß herstellbaren
Produkte können auch als Energieträger eingesetzt
werden, vor allem als Treibstoffe/Kraftstoffe sowie zu deren Herstellung.
-
Gegenstand
der Erfindung ist auch ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung
von organischen Kohlenstoffverbindungen, und zwar vor allem C2-
bis C6-Körper, als Produkt aus CO2 als Substrat und einem anorganischen
Elektronendonor wie Wasserstoff, wobei in Schritt (a) eine erfindungsgemäße
Zelle bereitgestellt wird, in Schritt (b) die Zelle mit dem Substrat
und dem Elektronendonor in Kontakt gebracht wird und in Schritt
(c) die Zelle unter Bedingungen kultiviert wird, unter denen die
Substrate umgesetzt und die Zelle die organischen Kohlenstoffverbindundungen
bildet. In einem weiteren Schritt (d) wird das Produkt aus dem Kulturmedium
und/oder der Zelle isoliert und gegebenenfalls aufgereinigt. Üblicherweise
wird das intrazellulär gebildete Produkt aus der Zelle
in das Extrazellulärmedium abgegeben.
-
Die
Kultivierung findet bevorzugt in vorzugsweise flüssigem
Kulturmedium statt. Es ist bevorzugt vorgesehen, die Zelle dabei
unter anaeroben Bedingungen zu kultivieren. Je nach Wirtsorganismus
ist es in einer alternativen Variante auch vorgesehen, die Zelle
unter aeroben Bedingungen zu kultivieren. Anhand der vorstehenden
Beschreibung der Erfindung kann der Fachmann die jeweils günstige
Enzymausstattung wählen.
-
Bevorzugt
ist der Elektronendonor elementarer Wasserstoff, bevorzugt gasförmiger
Wasserstoff. Bevorzugte alternative Elektronendonoren sind ausgewählt
aus Schwefelwasserstoff, elementarem Schwefel, Sulfit, Thiosulfat,
Ammonium, Nitrit und Metallen in reduzierter Form.
-
Als
Elektronenakzeptor wird neben CO2, alternativ oder bevorzugt zusätzlich,
mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus O2, Nitrat,
Nitrit, Sulfat, Sulfit, Thiosulfat und Fumarat, verwendet.
-
Zu
dieser Beschreibung gehört ein Sequenzprotokoll; dieses
enthält Angaben zu nachstehend aufgelisteten Genen und
damit codierten Proteinen:
Abkürzung: | hoxF |
Bezeichnung: | NAD-reducing
hydrogenase diaphorase |
| moiety
large subunit [Ralstonia eutropha |
| H16] |
EC-Nummer: | 1.12.1.2 |
NCBI-GI: | 38637753 |
NCBI-GeneID: | 2656814 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 1 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 2 |
| |
Abkürzung: | hoxU |
Bezeichnung: | NAD-reducing
hydrogenase diaphorase |
| moiety
small subunit [Ralstonia eutropha |
| H16] |
EC-Nummer: | 1.12.1.2 |
NCBI-GI: | 38637754 |
NCBI-GeneID: | 2656815 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 3 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 4 |
| |
Abkürzung: | hoxY |
Bezeichnung: | NAD-reducing
hydrogenase hydrogenase |
| moiety
small subunit [Ralstonia eutropha |
| H16] |
EC-Nummer: | 1.12.1.2 |
NCBI-GI: | 38637755 |
NCBI-GeneID: | 2656816 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 5 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 6 |
| |
Abkürzung: | hoxH |
Bezeichnung: | NAD-reducing
hydrogenase hydrogenase |
| moiety
large subunit [Ralstonia eutropha |
| H16] |
EC-Nummer: | 1.12.1.2 |
NCBI-GI: | 38637756 |
NCBI-GeneID: | 2656817 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 7 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 8 |
| |
Abkürzung: | hypC1 |
Bezeichnung: | Protein
HypC1 involved in metallocenter |
| formation
of hydrogenases [Ralstonia |
| eutropha
H16] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 38637683 |
NCBI-GeneID: | 2656436 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 9 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 10 |
| |
Abkürzung: | hypD1 |
Bezeichnung: | Protein
HypD1 involved in metallocenter |
| formation
of hydrogenases [Ralstonia |
| eutropha
H16] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 38637684 |
NCBI-GeneID: | 2656437 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 11 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 12 |
| |
Abkürzung: | hypE1 |
Bezeichnung: | Protein
HypE1 involved in metallocenter |
| formation
of hydrogenases [Ralstonia |
| eutropha
H16] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 38637685 |
NCBI-GeneID: | 2656438 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 13 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 14 |
| |
Abkürzung: | hypA1 |
Bezeichnung: | Protein
HypA1 involved in metallocenter |
| formation
of hydrogenases [Ralstonia |
| eutropha
H16] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 38637680 |
NCBI-GeneID: | 2656433 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 15 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 16 |
| |
Abkürzung: | hypB1 |
Bezeichnung: | Protein
HypB1 involved in metallocenter |
| formation
of hydrogenases [Ralstonia |
| eutropha
H16] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 38637681 |
NCBI-GeneID: | 2656434 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 17 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 18 |
| |
Abkürzung: | hypF1 |
Bezeichnung: | Protein
HypF1 involved in metallocenter |
| formation
of hydrogenases [Ralstonia |
| eutropha
H16] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 38637682 |
NCBI-GeneID: | 2656435 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 19 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 20 |
| |
Abkürzung: | hypA2 |
Bezeichnung: | Protein
HypA2 involved in metallocenter |
| formation
of hydrogenases [Ralstonia |
| eutropha
H16] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 38637759 |
NCBI-GeneID: | 2656548 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 21 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 22 |
| |
Abkürzung: | hypB2 |
Bezeichnung: | Protein
HypB2 involved in metallocenter |
| formation
of hydrogenases [Ralstonia |
| eutropha
H16] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 38637760 |
NCBI-GeneID: | 2656549 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 23 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 24 |
| |
Abkürzung: | hypF2 |
Bezeichnung: | Protein
HypF2 involved in metallocenter |
| formation
of hydrogenases [Ralstonia |
| eutropha
H16] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 38637761 |
NCBI-GeneID: | 2656550 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 25 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 26 |
| |
Abkürzung: | hoxA |
Bezeichnung: | HoxA
component of the hydrogen sensoring |
| and
signal transduction system |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 38637687 |
NCBI-GeneID: | 2656440 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 27 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 28 |
| |
Abkürzung: | hoxB |
Bezeichnung: | HoxB
component of the hydrogen sensoring |
| and
signal transduction system |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 38637688 |
NCBI-GeneID: | 2656441 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 29 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 30 |
| |
Abkürzung: | hoxC |
Bezeichnung: | HoxC
component of the hydrogen sensoring |
| and
signal transduction system |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 38637689 |
NCBI-GeneID: | 2656442 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 31 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 32 |
| |
Abkürzung: | hoxJ |
Bezeichnung: | HoxJ
histidine Protein kinase component |
| of
the hydrogen sensoring and signal |
| transduction
system |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 38637690 |
NCBI-GeneID: | 2656443 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 33 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 34 |
| |
Abkürzung: | cbbPp |
Bezeichnung: | Phosphoribulokinase
[Ralstonia eutropha |
| H16] |
EC-Nummer: | 2.7.1.19 |
NCBI-GI: | 38638082 |
NCBI-GeneID: | 2656765 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 35 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 36 |
| |
Abkürzung: | cbbLp |
Bezeichnung: | Ribulose-1,5-bisphosphate |
| carboxylase/oxygenase
large subunit [Ralstonia |
| eutropha
H16] |
EC-Nummer: | 4.1.1.39 |
NCBI-GI: | 38638088 |
NCBI-GeneID: | 2656546 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 37 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 38 |
| |
Abkürzung: | cbbSp |
Bezeichnung: | Ribulose-1,5-bisphosphate |
| carboxylase/oxygenase
small subunit [Ralstonia |
| eutropha
H16] |
EC-Nummer: | 4.1.1.39 |
NCBI-GI: | 38638087 |
NCBI-GeneID: | 2656545 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 39 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 40 |
| |
Abkürzung: | pta |
Bezeichnung: | phosphate
acetyltransferase [Escherichia |
| coli
K12] |
EC-Nummer: | 2.3.1.8 |
NCBI-GI: | 16130232 |
NCBI-GeneID: | 946778 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 41 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 42 |
| |
Abkürzung: | ppc |
Bezeichnung: | phosphoenolpyruvate
carboxylase |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 4.1.1.31 |
NCBI-GI: | 16131794 |
NCBI-GeneID: | 948457 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 43 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 44 |
| |
Abkürzung: | pflB |
Bezeichnung: | pyruvate
formate lyase I [Escherichia coli |
| K12] |
EC-Nummer: | 2.3.1.54 |
NCBI-GI: | 16128870 |
NCBI-GeneID: | 945514 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 45 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 46 |
| |
Abkürzung: | ackA |
Bezeichnung: | acetate
kinase A and propionate kinase 2 |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 2.7.2.1 |
NCBI-GI: | 16130231 |
NCBI-GeneID: | 946775 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 47 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 48 |
| |
Abkürzung: | adhE |
Bezeichnung: | fused
acetaldehyde-CoA |
| dehydrogenase/iron-dependent
alcohol |
| dehydrogenase/pyruvate-formate
lyase |
| deactivase
[Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 1.2.1.10/1.1.1.1 |
NCBI-GI: | 16129202 |
NCBI-GeneID: | 945837 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 49 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 50 |
| |
Abkürzung: | frdA |
Bezeichnung: | fumarate
reductase (anaerobic) catalytic |
| and
NAD/flavoprotein subunit |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 1.3.99.1 |
NCBI-GI: | 16131979 |
NCBI-GeneID: | 948667 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 51 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 52 |
| |
Abkürzung: | frdB |
Bezeichnung: | fumarate
reductase (anaerobic), Fe-S |
| subunit
[Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 1.3.99.1 |
NCBI-GI: | 16131978 |
NCBI-GeneID: | 948666 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 53 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 54 |
| |
Abkürzung: | frdC |
Bezeichnung: | fumarate
reductase (anaerobic), |
| membrane
anchor subunit [Escherichia coli |
| K12] |
EC-Nummer: | 1.3.99.1 |
NCBI-GI: | 16131977 |
NCBI-GeneID: | 948680 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 55 |
DNA-Sequenz:Aminosäure-Sequenz | SEQ
ID NO: 56 |
| |
Abkürzung: | frdD |
Bezeichnung: | fumarate
reductase (anaerobic), |
| membrane
anchor subunit [Escherichia coli |
| K12] |
EC-Nummer: | 1.3.99.1 |
NCBI-GI: | 16131976 |
NCBI-GeneID: | 948668 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 57 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 58 |
| |
Abkürzung: | aceE |
Bezeichnung: | pyruvate
dehydrogenase, decarboxylase |
| component
E1, thiamin-binding |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 1.2.4.1 |
NCBI-GI: | 16128107 |
NCBI-GeneID: | 944834 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 59 |
DNA-Sequenz:Aminosäure-Sequenz | SEQ
ID NO: 60 |
| |
Abkürzung: | aceF |
Bezeichnung: | pyruvate
dehydrogenase, |
| dihydrolipoyltransacetylase
component E2 |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 1.2.4.1 |
NCBI-GI: | 16128108 |
NCBI-GeneID: | 944794 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 61 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 62 |
| |
Abkürzung: | lpd
(= lpdA) |
Bezeichnung: | lipoamide
dehydrogenase, E3 component |
| is
part of three enzyme complexes, e. g. |
| of
pyruvate dehydrogenase [Escherichia |
| coli
K12] |
EC-Nummer: | 1.8.1.4 |
NCBI-GI: | 16128109 |
NCBI-GeneID: | 944854 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 63 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 64 |
| |
Abkürzung: | sdhA |
Bezeichnung: | succinate
dehydrogenase, flavoprotein |
| subunit
[Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 1.3.5.1 |
NCBI-GI: | 16128698 |
NCBI-GeneID: | 945402 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 65 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 66 |
| |
Abkürzung: | sdhB |
Bezeichnung: | succinate
dehydrogenase, FeS subunit |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 1.3.5.1 |
NCBI-GI: | 16128699 |
NCBI-GeneID: | 945300 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 67 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 68 |
| |
Abkürzung: | sdhC |
Bezeichnung: | succinate
dehydrogenase, membrane |
| subunit,
binds cytochrome b556 |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 1.3.5.1 |
NCBI-GI: | 16128696 |
NCBI-GeneID: | 945316 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 69 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 70 |
| |
Abkürzung: | sdhD |
Bezeichnung: | succinate
dehydrogenase, membrane |
| subunit,
binds cytochrome b556 |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 1.3.5.1 |
NCBI-GI: | 16128697 |
NCBI-GeneID: | 945322 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 71 |
DNA-Sequenz:Aminosäure-Sequenz | SEQ
ID NO: 72 |
| |
Abkürzung: | ldhA |
Bezeichnung: | fermentative
D-lactate dehydrogenase, |
| NAD-dependent
[Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 1.1.1.28 |
NCBI-GI: | 16129341 |
NCBI-GeneID: | 946315 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 73 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 74 |
| |
Abkürzung: | lctD
(= lldD) |
Bezeichnung: | L-lactate
dehydrogenase, FMN-linked |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 1.1.2.3 |
NCBI-GI: | 16131476 |
NCBI-GeneID: | 948121 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 75 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 76 |
| |
Abkürzung: | fbp |
Bezeichnung: | fructose-1,6-bisphosphatase
I [Escherichia |
| coli
K12] |
EC-Nummer: | 3.1.3.11 |
NCBI-GI: | 16132054 |
NCBI-GeneID: | 948753 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 77 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 78 |
| |
Abkürzung: | glpX |
Bezeichnung: | fructose
1,6-bisphosphatase II [Escherichia |
| coli
K12] |
EC-Nummer: | 3.1.3.11 |
NCBI-GI: | 16131763 |
NCBI-GeneID: | 948424 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 79 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 80 |
| |
Abkürzung: | fbaA |
Bezeichnung: | fructose-bisphosphate
aldolase, class II |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 4.1.2.13 |
NCBI-GI: | 16130826 |
NCBI-GeneID: | 947415 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 81 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 82 |
| |
Abkürzung: | fbaB |
Bezeichnung: | fructose-bisphosphate
aldolase class I |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 4.1.2.13 |
NCBI-GI: | 90111385 |
NCBI-GeneID: | 946632 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 83 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 84 |
| |
Abkürzung: | fsaA |
Bezeichnung: | fructose-6-phosphate
aldolase 1 |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 4.-.-.- |
NCBI-GI: | 90111174 |
NCBI-GeneID: | 945449 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 85 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 86 |
| |
Abkürzung: | fsaB |
Bezeichnung: | fructose-6-phosphate
aldolase 2 |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 4.-.-.- |
NCBI-GI: | 16131784 |
NCBI-GeneID: | 948439 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 87 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 88 |
| |
Abkürzung: | gpsA |
Bezeichnung: | glycerol-3-phosphate
dehydrogenase |
| (NAD
+) [Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 1.1.1.94 |
NCBI-GI: | 16131479 |
NCBI-GeneID: | 948125 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 89 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 90 |
| |
Abkürzung: | glpA |
Bezeichnung: | sn-glycerol-3-phosphate
dehydrogenase |
| (anaerobic),
large subunit, FAD/NAD(P)-binding |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 1.1.99.5 |
NCBI-GI: | 16130176 |
NCBI-GeneID: | 946713 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 91 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 92 |
| |
Abkürzung: | glpB |
Bezeichnung: | sn-glycerol-3-phosphate
dehydrogenase |
| (anaerobic),
membrane anchor subunit |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 1.1.99.5 |
NCBI-GI: | 16130177 |
NCBI-GeneID: | 946733 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 93 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 94 |
| |
Abkürzung: | glpC |
Bezeichnung: | sn-glycerol-3-phosphate
dehydrogenase |
| (anaerobic),
small subunit [Escherichia |
| coli
K12] |
EC-Nummer: | 1.1.99.5 |
NCBI-GI: | 16130178 |
NCBI-GeneID: | 946735 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 95 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 96 |
| |
Abkürzung: | glpD |
Bezeichnung: | sn-glycerol-3-phosphate
dehydrogenase, |
| aerobic,
FAD/NAD(P)-binding |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 1.1.99.5 |
NCBI-GI: | 16131300 |
NCBI-GeneID: | 947934 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 97 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 98 |
| |
Abkürzung: | glpK |
Bezeichnung: | glycerol
kinase [Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 2.7.1.30 |
NCBI-GI: | 16131764 |
NCBI-GeneID: | 948423 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 99 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 100 |
| |
Abkürzung: | gldA |
Bezeichnung: | glycerol
dehydrogenase, NAD |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | 1.1.1.6 |
NCBI-GI: | 90111668 |
NCBI-GeneID: | 948440 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 101 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 102 |
| |
Abkürzung: | talA |
Bezeichnung: | transaldolase
A [Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 2.2.1.2 |
NCBI-GI: | 16130389 |
NCBI-GeneID: | 947006 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 103 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 104 |
| |
Abkürzung: | talB |
Bezeichnung: | transaldolase
B [Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 2.2.1.2 |
NCBI-GI: | 16128002 |
NCBI-GeneID: | 944748 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 105 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 106 |
| |
Abkürzung: | ftfL |
Bezeichnung: | Methylobacterium
extorquens |
| formatetetrahydrofolate
ligase (ftfL) |
EC-Nummer: | 6.3.4.3 |
NCBI-GI: | 30721807 |
NCBI-GeneID: | - |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 107 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 108 |
| |
Abkürzung: | fdhF |
Bezeichnung: | formate
dehydrogenase-H [Escherichia |
| coli
K12] |
EC-Nummer: | 1.2.1.2 |
NCBI-GI: | 16131905 |
NCBI-GeneID: | 948584 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 109 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 110 |
| |
Abkürzung: | aceA |
Bezeichnung: | isocitrate
lyase [Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 4.1.3.1 |
NCBI-GI: | 16131841 |
NCBI-GeneID: | 948517 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 111 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 112 |
| |
Abkürzung: | sgaA |
Bezeichnung: | Methylobacterium
extorquens |
| serineglyoxylate
aminotransferase |
EC-Nummer: | 2.6.1.45 |
NCBI-GI: | 439605
(Ausschnitt) |
NCBI-GeneID: | - |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 113 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 114 |
| |
Abkürzung: | hprA |
Bezeichnung: | Methylobacterium
extorquens |
| NADH-dependent
hydroxypyruvate reductase |
| (HPR) |
EC-Nummer: | 1.1.1.81 |
NCBI-GI: | 439605
(Ausschnitt) |
NCBI-GeneID: | |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 115 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 116 |
| |
Abkürzung: | mtkA |
Bezeichnung: | Methylobacterium
extorquens malate |
| thiokinase
(beta subunit) |
EC-Nummer: | 6.2.1.9 |
NCBI-GI: | 505336
(Ausschnitt) |
NCBI-GeneID: | |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 117 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 118 |
| |
Abkürzung: | mtkB |
Bezeichnung: | Methylobacterium
extorquens malate |
| thiokinase
(alpha subunit) |
EC-Nummer: | 6.2.1.9 |
NCBI-GI: | 505336
(Ausschnitt) |
NCBI-GeneID: | |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 119 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 120 |
| |
Abkürzung: | mclA |
Bezeichnung: | malyl-CoA
lyase [Methylobacterium |
| extorquens] |
EC-Nummer: | 4.1.3.24 |
NCBI-GI: | 1657785
bzw. 28572161 (Ausschnitt) |
NCBI-GeneID: | |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 121 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 122 |
| |
Abkürzung: | aclA |
Bezeichnung: | citrate
lyase, subunit 2 [Chlorobium |
| tepidum
TLS] |
EC-Nummer: | 2.3.3.8 |
NCBI-GI: | 21673914 |
NCBI-GeneID: | 1006925 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 123 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 124 |
| |
Abkürzung: | aclB |
Bezeichnung: | citrate
lyase, subunit 1 [Chlorobium |
| tepidum
TLS] |
EC-Nummer: | 2.3.3.8 |
NCBI-GI: | 21673915 |
NCBI-GeneID: | 1006924 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 125 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 126 |
| |
Abkürzung: | citF |
Bezeichnung: | citrate
lyase, citrate-ACP transferase |
| (alpha)
subunit [Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 2.3.3.8 |
NCBI-GI: | 16128598 |
NCBI-GeneID: | 945230 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 127 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 128 |
| |
Abkürzung: | citE |
Bezeichnung: | citrate
lyase, citryl-ACP lyase (beta) |
| subunit
[Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 2.3.3.8 |
NCBI-GI: | 90111153 |
NCBI-GeneID: | 945406 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 129 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 130 |
| |
Abkürzung: | citD |
Bezeichnung: | citrate
lyase, acyl carrier (gamma) |
| subunit
[Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 2.3.3.8 |
NCBI-GI: | 16128600 |
NCBI-GeneID: | 945415 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 131 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 132 |
| |
Abkürzung: | korA |
Bezeichnung: | 2-oxoglutarate
ferredoxin oxidoreductase |
| alpha
subunit [Hydrogenobacter |
| thermophilus] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 12583690
(Ausschnitt) |
NCBI-GeneID: | |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 133 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 134 |
| |
Abkürzung: | korB |
Bezeichnung: | 2-oxoglutarate
ferredoxin oxidoreductase |
| beta
subunit [Hydrogenobacter |
| thermophilus] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 12583690
(Ausschnitt) |
NCBI-GeneID: | |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 135 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 136 |
| |
Abkürzung: | hyaA |
Bezeichnung: | hydrogenase
1, small subunit [Escherichia |
| coli
K12] |
EC-Nummer: | 1.12.7.2 |
NCBI-GI: | 16128938 |
NCBI-GeneID: | 945579 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 137 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 138 |
| |
Abkürzung: | hyaB |
Bezeichnung: | hydrogenase
1, large subunit [Escherichia |
| coli
K12] |
EC-Nummer: | 1.12.7.2 |
NCBI-GI: | 16128939 |
NCBI-GeneID: | 945580 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 139 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 140 |
| |
Abkürzung: | hyaC |
Bezeichnung: | hydrogenase
1, b-type cytochrome |
| subunit
[Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 1.12.7.2 |
NCBI-GI: | 16128940 |
NCBI-GeneID: | 945581 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 141 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 142 |
| |
Abkürzung: | hyaD |
Bezeichnung: | Protein
involved in processing of HyaA |
| and
HyaB Proteins [Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 16128941 |
NCBI-GeneID: | 945575 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 143 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 144 |
| |
Abkürzung: | hyaE |
Bezeichnung: | Protein
involved in processing of HyaA |
| and
HyaB Proteins [Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 16128942 |
NCBI-GeneID: | 945573 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 145 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 146 |
| |
Abkürzung: | hyaF |
Bezeichnung: | Protein
involved in nickel incorporation |
| into
hydrogenase-1 Proteins [Escherichia |
| coli
K12] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 16128943 |
NCBI-GeneID: | 945572 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 147 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 148 |
| |
Abkürzung: | hybO |
Bezeichnung: | hydrogenase
2, small subunit [Escherichia |
| coli
K12] |
EC-Nummer: | 1.12.7.2 |
NCBI-GI: | 16130897 |
NCBI-GeneID: | 945902 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 149 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 150 |
| |
Abkürzung: | hybA |
Bezeichnung: | hydrogenase
2 4Fe-4S ferredoxin-type |
| component
[Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 1.12.7.2 |
NCBI-GI: | 16130896 |
NCBI-GeneID: | 944842 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 151 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 152 |
| |
Abkürzung: | hybB |
Bezeichnung: | hydrogenase
2 cytochrome b type |
| component
[Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 1.12.7.2 |
NCBI-GI: | 16130895 |
NCBI-GeneID: | 948615 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 153 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 154 |
| |
Abkürzung: | hybC |
Bezeichnung: | hydrogenase
2, large subunit [Escherichia |
| coli
K12] |
EC-Nummer: | 1.12.7.2 |
NCBI-GI: | 16130894 |
NCBI-GeneID: | 945182 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 155 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 156 |
| |
Abkürzung: | hybD |
Bezeichnung: | maturation
element for hydrogenase 2 |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 16130893 |
NCBI-GeneID: | 948982 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 157 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 158 |
| |
Abkürzung: | hybE |
Bezeichnung: | hydrogenase
2-specific chaperone |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 16130892 |
NCBI-GeneID: | 947483 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 159 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 160 |
| |
Abkürzung: | hybF |
Bezeichnung: | Protein
involved with the maturation of |
| hydrogenases
1 and 2 [Escherichia coli |
| K12] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 16130891 |
NCBI-GeneID: | 948004 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 161 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 162 |
| |
Abkürzung: | hybG |
Bezeichnung: | hydrogenase
2 accessory Protein |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 16130890 |
NCBI-GeneID: | 948020 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 163 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 164 |
| |
Abkürzung: | lldP
(= lctP) |
Bezeichnung: | L-lactate
permease [Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 16131474 |
NCBI-GeneID: | 948114 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 165 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 166 |
| |
Abkürzung: | ldhL1 |
Bezeichnung: | L-lactate
dehydrogenase [Lactobacillus |
| plantarum
WCFS1] |
EC-Nummer: | 1.1.1.27 |
NCBI-GI: | 28377422 |
NCBI-GeneID: | 1061886 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 167 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 168 |
| |
Abkürzung: | ldhL2 |
Bezeichnung: | L-lactate
dehydrogenase [Lactobacillus |
| plantarum
WCFS1] |
EC-Nummer: | 1.1.1.27 |
NCBI-GI: | 28377890 |
NCBI-GeneID: | 1063343 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 169 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 170 |
| |
Abkürzung: | lctP |
Bezeichnung: | L-lactate
transport Protein [Lactobacillus |
| plantarum
WCFS1] |
EC-Nummer: | - |
NCBI-GI: | 28378482 |
NCBI-GeneID: | 1062021 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 171 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 172 |
| |
Abkürzung: | larA |
Bezeichnung: | lp_0104
[Lactobacillus plantarum |
| WCFS1] |
EC-Nummer: | zu
5.1.2.1 |
NCBI-GI: | 28377057 |
NCBI-GeneID: | 1061369 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 173 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 174 |
| |
Abkürzung: | larB |
Bezeichnung: | lp_0105
[Lactobacillus plantarum |
| WCFS1] |
EC-Nummer: | zu
5.1.2.1 |
NCBI-GI: | 28377058 |
NCBI-GeneID: | 1061366 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 175 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 176 |
| |
Abkürzung: | larC1 |
Bezeichnung: | lp_0106
[Lactobacillus plantarum |
| WCFS1] |
EC-Nummer: | zu
5.1.2.1 |
NCBI-GI: | |
NCBI-GeneID: | 1061367 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 177 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 178 |
| |
Abkürzung: | larC2 |
Bezeichnung: | lp_0107
[Lactobacillus plantarum |
| WCFS1] |
EC-Nummer: | zu
5.1.2.1 |
NCBI-GI: | |
NCBI-GeneID: | 1061364 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 179 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 180 |
Abkürzung: | glpF1 |
Bezeichnung: | lp_0108;
"glycerol uptake facilitator |
| Protein"
[Lactobacillus plantarum WCFS1] |
EC-Nummer: | zu
5.1.2.1 |
NCBI-GI: | 28377059 |
NCBI-GeneID: | 1061363 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 181 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 182 |
| |
Abkürzung: | larE |
Bezeichnung: | lp_0109
[Lactobacillus plantarum |
| WCFS1] |
EC-Nummer: | zu
5.1.2.1 |
NCBI-GI: | 28377060 |
NCBI-GeneID: | 1061362 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 183 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 184 |
| |
Abkürzung: | ldhD |
Bezeichnung: | D-lactate
dehydrogenase [Lactobacillus |
| plantarum
WCFS1] |
EC-Nummer: | 1.1.1.28 |
NCBI-GI: | 28378688 |
NCBI-GeneID: | 1061762 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 185 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 186 |
| |
Abkürzung: | dld |
Bezeichnung: | D-lactate
dehydrogenase, FAD-binding, |
| NADH
independent [Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 1.1.1.28 |
NCBI-GI: | 16130071 |
NCBI-GeneID: | 946653 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 187 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 188 |
| |
Abkürzung: | gcvP |
Bezeichnung: | glycine
decarboxylase, PLP-dependent, |
| subunit
(protein P) of glycine cleavage |
| complex
[Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 1.4.4.2 |
NCBI-GI: | 16130805 |
NCBI-GeneID: | 947394 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 189 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 190 |
| |
Abkürzung: | gcvH |
Bezeichnung: | glycine
cleavage complex lipoylprotein |
| [Escherichia
coli K12] |
EC-Nummer: | |
NCBI-GI: | |
NCBI-GeneID: | |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 191 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 192 |
| |
Abkürzung: | gcvT |
Bezeichnung: | aminomethyltransferase,
tetrahydrofolatedependent, |
| subunit
(T protein) of glycine |
| cleavage
complex [Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 2.1.2.10 |
NCBI-GI: | 16130807 |
NCBI-GeneID: | 947390 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 193 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 194 |
| |
Abkürzung: | lpd
(= lpdA) |
Bezeichnung: | lipoamide
dehydrogenase, is part of three |
| enzyme
complexes [Escherichia coli K12] |
EC-Nummer: | 1.8.1.4 |
NCBI-GI: | 16128109 |
NCBI-GeneID: | 944854 |
DNA-Sequenz
SEQ ID NO: | 195 |
Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO: | 196 |
-
Ausführungsbeispiel: Synthese
von Milchsäure aus CO2 und H2 in einem rekombinanten E.
coli-Stamm
-
Ausgangspunkt
für die Transformation ist der E. coli-Stamm K12. Zur Realisierung
der Hydrogenase-Aktivität, des Serin-Zyklus und der Lactat-Synthese
wurden Expressionskassetten für: NAD-reduzierende cytosolische
Hydrogenase-Aktivität aus Ralstonia, Strukturgene hoxFUYH
und Reifungsgene hypC1, hypD1, hypE1 und hypABF, sowie Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität
aus Methylobacterium, speziell enthaltend Nucleinsäuremoleküle
mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 und
107, in Expressionsvektoren pUC oder pPCU18 oder ähnlichen
cloniert/ligiert. Die Ligation der Plasmid-DNA erfolgt in an sich bekannter
Weise. Beispielsweise wird der Vektor durch Hydrolyse mit Restriktionsendonuclease
geöffnet und die entsprechenden DNA-Sequenzen inseriert.
Die Ligation erfolgt beispielsweise durch Kassettenmutagenese.
-
Die
Transformation transformationskompetenter E. coli-Zellen sowie die
Herstellung transformationskompetenter E. coli-Zellen erfolgt vorzugsweise
nach dem Protokoll von Hanahan, 1985 (Hanahan, D. in Glover,
D. M. (ed.) DNA Cloning: „A Practical Approach" IRL Press
Oxford 109–135).
-
Zur
Herstellung der transformationskompetenten E. coli-Zellen werden
E. coli K12-Stämme, beispielsweise TH1, TH2, TH5, TH5α,
C600, Top 10, XL1-Blue und deren Derivate eingesetzt. Aus einer
Vorabkultur aus einer Dauerkultur wird eine frische Zellkolonie
in 5 ml SOB-Medium suspendiert und unter Schütteln bei 37°C
bis zu einer Zelldichte von 1 bis 2 × 108/ml
kultiviert. Anschließend wird 1:1 mit 40% Glycerol/60% SOB-Medium
(1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Trypton-mmol/l NaCl, 2,5 mmol/l KCl, nach
Autoklavieren auf 10 mmol/l MgCl2 und MgSO4 einstellen) verdünnt und auf Eis
gekühlt.
-
Aus
der Vorabkultur wird ein Zellausstrich auf eine LM-Platte angelegt
und über Nacht bei 37°C inkubiert. Daraus werden
jeweils 5 Kolonien mit einem Durchmesser von etwa 0,5 bis 1 mm abgeimpft
und in 50 ml SOB-Medium angeimpft; die Zellen werden für
etwa 3 Stunden bis zu einer Dichte von 4 bis 7 × 107/ml bei 37°C unter Schütteln
kultiviert. Die Zellen werden auf Eis gekühlt und in Zentrifugenröhrchen überführt
und bei 2500 rpm bei 4°C für 5 Minuten sedimentiert.
Das Sediment wird mit 17 ml LM-Agar-FSB-Puffer resuspendiert und
in Eis inkubiert. Der Vorgang wird gegebenenfalls wiederholt. Schließlich
wird das Sediment in 5 ml LM-Agar-FSB-Puffer resuspendiert und 5
Minuten in Eis inkubiert. Dann werden 140 μl DMSO zugegeben,
5 Minuten in Eis inkubiert, nochmals 140 μl DMSO zugegeben,
und 5 Minuten in Eis inkubiert. Die Zellsuspension kann beispielsweise
in 1,5 ml-Reaktionsgefäßen nach langsamen Tieffrieren
bei –70°C mehrere Monate aufbewahrt werden.
-
Die
Ligation wird in einem molaren Verhältnis von DNA zu Vektor-DNA
von 1:1 bis 1:3 durchgeführt. Der Ligationsansatz: 4 μl
steriles Wasser, 2 μl 5 × Ligasepuffer (250 mmol/l
Tris-HCl, pH 7,6, 50 mmol/l MgCl2, 5 mmol/l
ATP, 5 mmol/l DTT, 25% PEE (w/v)), 1 ml amplifizierte DNA, 2 μl
Vektor-DNA (mit 3'-T-Überhang in 1 μl T4-Ligase,
wird in einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß vorgelegt
und nach Vermischen über Nacht bei 14°C inkubiert.
Jeweils 1–5 μl des Ansatzes werden zur Transformation
von transformationskompetenten E. coli-Zellen eingesetzt; gegebenenfalls
kann der Ligationsansatz bei –20°C gelagert werden.
-
Zur
Transformation der kompetenten E. coli-Zellen werden jeweils 30 μl
der zu tranformierenden DNA vorgelegt und bei Kühlung in
Eis je 200 μl der Zellsuspension zugegeben und etwa 30
Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wird für
90 Minuten bei 42°C ohne Schütteln inkubiert und
danach für 2 Minuten auf Eis abgekühlt. Nach Zugabe
von 800 μl SOC-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Trypton-mmol/l
NaCl, 2,5 mmol/l KCl, nach Autoklavieren auf 10 mmol/l MgCl2 und MgSO4 einstellen
und zusätzlich auf 20 mmol/l Glucolse einstellen) wird
bei 37°C bei etwa 200 RPM für etwa 1 Stunde inkubiert.
Je 200 μl einer geeigneten Verdünnung des Transformationsansatzes
wird auf LB-AMP-Platten ausplattiert. Die Inkubation erfolgt bei
37°C über Nacht.
-
Zur
Selektion der rekombinanten Zellen werden Selektionsplatten verwendet,
wobei jeweils 100 μl einer Mischung aus 10 μl
100 mmol/l IPTG, 40 μl 3% X-Gal und 50 μl SOC-Medium
auf einer LB-AMP-Agarplatte ausplattiert werden und diese für
etwa 1 Stunde bei 37°C inkubiert werden. Nach Inkubation
werden jeweils 200 μl der Zellsuspension auf der Selektionsplatte
ausplattiert. Anhand des α-Komplementationstests lassen sich
die Kolonien, die kein rekombinantes Plasmid enthalten, aufgrund
der Blaufärbung von den rekombinanten Clonen, welche keine
Färbung aufweisen, leicht unterscheiden. Die stabile heterlologe
Expression in den so erhältlichen rekombinanten E. coli
Zellen wird in an sich bekannter Weise verifiziert.
-
Die
erhaltenen rekombinanten E. coli Zellen werden nach Inokulation
in einem 50 L-Fermenter mit Kulturmedium angesetzt und bei 25 bis
40°C kultiviert. Die Zugabe des C3–C6-Substrates,
hier Glucose oder alternative Glycerol, erfolgt in das Kulturmedium.
-
In
verschiedenen Ansätzen wird die Kultur unter Einleitung
von gasförmigem CO2 und H2 im Reaktor kultiviert.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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werden.
-
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-
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-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Schwartz E.,
Henne A., Cramm R, Eitinger T., Friedrich B., Gottschalk G. (2003).
Complete Nucleotide Sequence of PHG1: A Ralstonia eutropha H16 Megaplasmid
Encoding Key Enzymes of H2-based Lithoautotrophy and Anaerobiosis.
J Mol Biol 332, 369–383. [0051]
- - Hanahan, D. in Glover, D. M. (ed.) DNA Cloning: „A
Practical Approach" IRL Press Oxford 109–135 [0153]