DE102021207101A1 - Rekombinanter mikroorganismus, der fähig ist, unter ausschliesslicher verwendung von kohlendioxid und ameisensäure zu wachsen, und verfahren zur herstellung nützlicher substanzen unter verwendung des rekombinanten mikroorganismus - Google Patents

Rekombinanter mikroorganismus, der fähig ist, unter ausschliesslicher verwendung von kohlendioxid und ameisensäure zu wachsen, und verfahren zur herstellung nützlicher substanzen unter verwendung des rekombinanten mikroorganismus Download PDF

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Junho Bang
Chang Hun Hwang
Jung Ho Ahn
Jong An LEE
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Abstract

Offenbart wird ein rekombinanter Mikroorganismus, der in der Lage ist, unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure zu wachsen, indem ein Stoffwechselweg zur Synthese von Brenztraubensäure aus Kohlendioxid und Ameisensäure eingeführt und verbessert wird, um die Effizienz der Brenztraubensäure-Synthese zu erhöhen, und indem zusätzliche genetische Manipulationen durchgeführt werden, sowie ein Verfahren zur Herstellung nützlicher Substanzen unter Verwendung desselben. Vorteilhafterweise ist der rekombinante Mikroorganismus in der Lage, Brenztraubensäure, eine organische C3-Verbindung, mit einer bemerkenswert verbesserten Rate zu synthetisieren, und wächst insbesondere auch in einem Medium gut, das nur Kohlendioxid und Ameisensäure als Kohlenstoffquellen ohne Glucosezufuhr enthält, und ist dadurch in der Lage, Brenztraubensäure und verschiedene Verbindungen mit hohem Mehrwert unter Verwendung derselben als Zwischenprodukt in einer wirtschaftlich effizienten Weise zu synthetisieren.

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Bereich der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen rekombinanten Mikroorganismus, der in der Lage ist, unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure zu wachsen, und ein Verfahren zur Herstellung nützlicher Substanzen unter Verwendung des rekombinanten Mikroorganismus. Genauer gesagt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen rekombinanten Mikroorganismus, der in der Lage ist, unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure zu wachsen, indem der Stoffwechselweg zur Synthese von Brenztraubensäure aus Kohlendioxid und Ameisensäure eingeführt und verbessert wird, um die Effizienz der Brenztraubensäure-Synthese zu verbessern, und indem zusätzliche genetische Manipulationen durchgeführt werden, sowie auf ein Verfahren zur Herstellung nützlicher Substanzen unter Verwendung des rekombinanten Mikroorganismus.
  • Beschreibung des Standes der Technik
  • In dem Bestreben, Maßnahmen zur Verringerung der Treibhausgasemissionen zu ergreifen, die eine der Hauptursachen für den raschen Klimawandel sind, wird aktiv an der Synthese einer flüssigen oder festen organischen Substanz mit einer höheren Kohlenstoffzahl geforscht und nicht an einer gasförmigen Verbindung, die nur aus einem Kohlenstoff besteht, wie z. B. Kohlendioxid, das der Hauptbestandteil des Treibhausgases ist. Die Forschung zur Umwandlung einer Verbindung, die aus einem Kohlenstoff besteht, (C1-Verbindung) lässt sich grob in chemische und biologische Methoden einteilen. Bei den chemischen Methoden werden elektrochemische Reaktionen auf der Grundlage von metallischen und nichtmetallischen Katalysatoren eingesetzt. Durch solche Reaktionen wird Kohlendioxid in eine nicht gasförmige Kohlenstoffverbindung wie Methanol oder Ameisensäure umgewandelt, und Beispiele aus der einschlägigen Forschung umfassen die Umwandlung mit einem Kohlenstoffnanoröhrchen-Katalysator (Kumar et al., Nat. Comm. 2819, 2013), die Umwandlung mit einem Eisenkatalysator (Christopher et al. , Angew. Chem. Int. Ed. 49:50, 9777-9780, 2010), die Umwandlung mit einem Legierungskatalysator (Studt et al. , Nat. Chem., 6, 320-324, 2014) und dergleichen. Die Umwandlung mit diesen chemischen Methoden hat den Vorteil einer relativ hohen Geschwindigkeit, hat aber den Nachteil, dass die durch das Verfahren zur Umwandlung von Cl-Verbindungen gewonnenen Produkte Ein-Kohlenstoff-Substanzen wie Ameisensäure und Methanol sind, und nicht nützliche Verbindungen, die mehrere Kohlenstoffatome enthalten.
  • Im Bereich der biologischen Umwandlungsmethoden wird an der Umwandlung einer gasförmigen C1-Verbindung in eine nicht gasförmige Verbindung und an der Umwandlung einer C1-Verbindung in eine nützliche, aus mehreren Kohlenstoffatomen bestehende Verbindung geforscht. Im ersten Fall wurde die Nutzung von in der Natur vorhandenen Stoffwechselwegen und deren Verbesserung ( PCT/US2008/083056 ), die Entwicklung neuer Stoffwechselwege (Schwander et al., Science, 354: 6314, 900-904, 2016) und Ähnliches erforscht. Beispiele für den letzteren Fall sind die Herstellung nützlicher Verbindungen mit Hilfe von Methanol-assimilierenden Mikroorganismen ( US 2003/0124687 A1 ), die Herstellung von Verbindungen mit drei Kohlenstoffatomen aus Ameisensäure ( US 2013/0196359 A1 ) und dergleichen. Diese Forschung ist jedoch insofern begrenzt, als es aufgrund ihrer geringen Effizienz schwierig ist, ihre Auswirkungen unter In-vivo-Bedingungen zu ermitteln, und als nicht überprüft wurde, ob ihre Funktion mit Stoffwechselwegen in lebenden Organismen kompatibel ist.
  • Daher werden in der Industrie laufend
  • Forschungsarbeiten durchgeführt, um die Grenzen des oben beschriebenen biologischen C1-Verbindungsumwandlungsverfahrens zu überwinden und dadurch ein effizientes C1-Verbindungsumwandlungsverfahren zu entwickeln. Unter den Cl-Verbindungen hat insbesondere Ameisensäure den Vorteil, dass sie für Organismen relativ weniger toxisch ist als andere Cl-Verbindungen und im Vergleich zu anderen Cl-Verbindungen hinsichtlich der Reaktionsmechanik vorteilhaft für Assimilations-(anabolische) Reaktionen ist und durch chemische Methoden leicht und schnell aus Kohlendioxid synthetisiert werden kann. Die genomische Information der Gattung Methylobacterium, die ein repräsentatives Ameisensäureassimilierendes Bakterium ist, wurde jedoch erst 2009 entdeckt, d.h. die Grundlagenforschung für deren Anwendung wurde erst vor relativ kurzer Zeit durchgeführt. Derzeit werden die theoretisch nachgewiesenen Methoden zur Umwandlung von C1-Kohlenstoffquellen in nützliche Chemikalien überprüft. In einer aktuellen Studie wurde berichtet, dass E. coli unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure wächst (Gleizer, S. et al. Cell 179, 1255-1263, 2019, Kim, S. et al. Nat. Chem. Biol. 1-8, 2020). Eine Einschränkung besteht jedoch darin, dass das Niveau des Zellwachstums bemerkenswert niedrig ist.
  • Daher haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung in einer früheren Studie (koreanisches Patent Nr. 10-2000755 ) einen neuen Stoffwechselweg zur Umwandlung von Ameisensäure, einer C1-Verbindung, in eine nützliche, aus mehreren Kohlenstoffen zusammengesetzte Verbindung entwickelt und verifiziert und unter Verwendung derselben zusätzliche Untersuchungen zur Entwicklung von Mikroorganismen durchgeführt, die unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure als Kohlenstoffquellen wachsen. Als Ergebnis haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass Mikroorganismen gezüchtet werden können, die nur Kohlendioxid und Ameisensäure als Kohlenstoffquellen verwenden, indem das Gen, das für das Enzym Phosphoribosylglycinamid-Formyltransferase codiert, aus dem Genom von E. coli entfernt wird, der Stoffwechselfluss der Gluconeogenese verstärkt wird und Formiatdehydrogenase, die von Mikroorganismen der Gattung Candida stammt, und ein mutiertes Gen der Formiatdehydrogenase, das von Pflanzen der Gattung Arabidopsis stammt, eingeführt werden. Ferner haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass die Mikroorganismen zu einer ausreichend hohen Zelldichte wachsen können, um für die Produktion nützlicher Chemikalien geeignet zu sein, indem die Expressionsniveaus des Gens, das den rekonstruierten Tetrahydrofolat-Stoffwechselzyklus exprimiert, des Gens, das Formiatdehydrogenase exprimiert, das von dem Mikroorganismus der Gattung Candida stammt, und einer Formiatdehydrogenase-Mutante, die von Pflanzen der Gattung Arabidopsis stammt, reguliert werden, das Expressionsniveau von Membranproteinen, die für die Energieversorgung in Mikroorganismen erforderlich sind, effektiv reguliert wird durch Änderung der Kulturtemperaturbedingungen, Entwicklung eines Kulturverfahrens zur Erhöhung der Belüftung in Abhängigkeit vom Wachstum der Mikroorganismen und Entwicklung eines Kulturverfahrens zur Aufrechterhaltung der Konzentration von Ameisensäure im Kulturmedium auf einem optimalen Niveau. Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse wurde die vorliegende Erfindung abgeschlossen.
  • [Dokument des Stands der Technik]
  • [Patentdokumente]
  • [Patentdokument 1]
    • (Patentdokument 1) PCT/US2008/083056
    • (Patentdokument 2) US 2003/0124687
    • (Patentdokument 3) US 2013/0196359
    • (Patentdokument 4) KR 10-2000755
  • [Nicht-Patentdokumente]
    • (Nicht-Patentdokument 1) Kumar et al., Nat. Comm, 2819, 2013 (Nicht-Patentdokument 2) Christopher et al., Angew. Chem. Int. Ed. 49:50, 9777-9780, 2010
    • (Nicht-Patentdokument 3) Studt et al., Nat. Chem, 6, 320-324, 2014
    • (Nicht-Patentdokument 4) Schwander et al., Science, 354:6314. 900-904, 2016
    • (Nicht-Patentdokument 5) Gleizer, S. et al. Cell 179, 1255-1263, 2019
    • (Nicht-Patentdokument 6) Kim, S. et al. Nat. Chem. Biol. 1-8, 2020
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Daher wurde die vorliegende Erfindung im Hinblick auf die oben genannten Probleme gemacht, und es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten Mikroorganismus mit verbesserter Effizienz der Synthese von nützlichen Substanzen einschließlich C3-Verbindungen aus Ameisensäure und Kohlendioxid bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung nützlicher Substanzen einschließlich C3-Verbindungen aus Ameisensäure und Kohlendioxid unter Verwendung des rekombinanten Mikroorganismus bereitzustellen.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können die obigen und andere Aufgaben durch die Bereitstellung eines rekombinanten Mikroorganismus erreicht werden, in dem ein Gen, das für einen Transkriptionsrepressor des Glycinspaltungssystems, Pyruvat-Formiat-Lyase oder Phosphoglycerat-Dehydrogenase codiert, abgeschwächt oder aus einem Wirtsmikroorganismus mit einem Ameisensäureassimilationsweg deletiert ist, ein Gen, das für ein Enzym codiert, das an einer Glycinspaltungssystemreaktion beteiligt ist, in dem Wirtsmikroorganismus mit dem Ameisensäureassimilationsweg verstärkt exprimiert wird, und ein Gen, das für Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase, Methenyl-Tetrahydrofolat-Cyclohydrolase oder Methylen-Tetrahydrofolat-Dehydrogenase codiert, in den Wirtsmikroorganismus mit dem Ameisensäureassimilationsweg eingeführt wird.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer C3-Verbindung bereitgestellt, das (a) einen Schritt der Kultivierung des rekombinanten Mikroorganismus mit Ameisensäure und Kohlendioxid als Kohlenstoffquellen zur Herstellung einer C3-Verbindung und (b) einen Schritt des Sammelns der hergestellten C3-Verbindung umfasst.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer nützlichen Verbindung unter Verwendung von Brenztraubensäure als Zwischenprodukt bereitgestellt, das (a) einen Schritt der Kultivierung des rekombinanten Mikroorganismus mit Ameisensäure und Kohlendioxid als Kohlenstoffquellen zur Herstellung einer nützlichen Substanz mit einer Brenztraubensäure als Zwischenprodukt und (b) einen Schritt des Sammelns der hergestellten nützlichen Substanz umfasst.
  • Figurenliste
  • Die obigen und andere Aufgaben, Merkmale und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen deutlicher verstanden werden, in denen:
    • 1 zeigt den zentralen Stoffwechselweg zur Assimilation von Kohlendioxid und Ameisensäure rekombinanter Mikroorganismen sowie die daran beteiligten Gene, Enzyme und Metaboliten;
    • 2 ist eine Plasmidkarte, die durch Einführen des Gens, das an der Assimilation von Kohlendioxid und Ameisensäure beteiligt ist, eines Plasmids, in das Formiatdehydrogenase, die aus Candida und Arabidopsis stammt, eingefügt ist, und einer Mutante der Formiatdehydrogenase, die aus der Gattung Arabidopsis stammt, hergestellt wurde;
    • 3 ist ein Diagramm, das das Zellwachstum der produzierten Stämme DH5α FC1 bis DH5α FC5 zeigt, wenn sie unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure kultiviert werden;
    • 4 ist ein Diagramm, das die Menge der Veränderung in KBE des DH5α FC5-Stammes im Laufe der Zeit zeigt;
    • 5 ist ein Diagramm, in dem das Zellwachstum je nach Optimierung der Kulturbedingungen verglichen wird;
    • 6 zeigt eine Karte der Plasmide, die so hergestellt wurden, dass sie je nach Plasmidtyp
    • unterschiedliche Plasmidkopienzahlen und Veränderungen der Genexpressionsniveaus aufweisen;
    • 7 ist ein Diagramm, das das Zellwachstum der DH5α-Stämme FC5, FC7 und FC8 zeigt, die unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure kultiviert wurden;
    • 8 ist ein Diagramm, das das Zellwachstum eines DH5α FC8-Stammes in einer Kolbenkultur zeigt, die nur Kohlendioxid und Ameisensäure verwendet;
    • 9 ist ein Diagramm, das die relativen Expressionsniveaus von cyoA, cyoB, cydA und cydB durch den DH5α FC8-Stamm bei einer Kultur bei 32°C im Vergleich zu 37°C zeigt;
    • 10 ist ein Diagramm, das das Zellwachstum des DH5α FC8-Stammes in einer Fermenterkultur zeigt, die nur Kohlendioxid und Ameisensäure verwendet;
    • 11 ist ein Diagramm, das das Zellwachstum des DH5α FC8-Stammes in einer Fermenterkultur zeigt, die nur Kohlendioxid und Ameisensäure verwendet;
    • 12 ist ein Diagramm, das das Zellwachstum des DH5α FC8-Stammes in einer Fermenterkultur zeigt, die nur Kohlendioxid und Ameisensäure verwendet; und
    • 13 ist ein Diagramm, das den von Ameisensäure abgeleiteten 13C-Kohlenstoff zeigt, der in Serin in dem Mannheimia-Stamm, der mit dem Ameisensäure-Assimilations-Stoffwechselweg (LPK7_FTF) eingeführt wurde, und dem Mannheimia-Wildtyp-Stamm (LPK7) nachgewiesen wurde.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Sofern nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie von Fachleuten auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung verstanden wird. Im Allgemeinen ist die hier verwendete Nomenklatur auf dem Gebiet der Technik bekannt und wird üblicherweise verwendet.
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass die Umwandlungsrate von Kohlendioxid und Ameisensäure in Brenztraubensäure deutlich erhöht werden kann, indem ein rekombinanter Mikroorganismus mit einem neuartigen zirkulierenden Stoffwechselweg, der C3-Verbindungen aus Ameisensäure und Kohlendioxid synthetisieren kann, weiter verbessert wird, der von den vorliegenden Erfindern konzipiert wurde (KR Patent Nr. 10-2000755 ), insbesondere, dass die rekombinanten Mikroorganismen in die Lage versetzt werden können, unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure zu wachsen, ohne die zusätzliche Zufuhr von Glucose, die konventionell zugeführt wurde, um rekombinante Mikroorganismen zu züchten, und dass die Effizienz der Synthese von C3-Verbindungen im Vergleich zum Stand der Technik durch Verbesserung des Fermentationsprozesses, in dem der rekombinante Mikroorganismus auch Brenztraubensäure synthetisieren kann, deutlich verbessert werden kann.
  • In einem Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf einen rekombinanten Mikroorganismus gerichtet, in dem ein Gen, das für einen Transkriptionsrepressor des Glycinspaltungssystems, Pyruvat-Formiat-Lyase oder Phosphoglycerat-Dehydrogenase codiert, abgeschwächt oder aus einem Wirtsmikroorganismus mit einem Ameisensäureassimilationsweg deletiert ist,
    ein Gen, das für ein Enzym codiert, das an einer Glycinspaltungssystemreaktion beteiligt ist, in dem Wirtsmikroorganismus mit dem Ameisensäureassimilationsweg verstärkt exprimiert wird, und
    ein Gen, das für Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase, Methenyl-Tetrahydrofolat-Cyclohydrolase oder Methylen-Tetrahydrofolat-Dehydrogenase codiert, in den Wirtsmikroorganismus mit dem Ameisensäure-Assimilationsweg eingeführt wird.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Ameisensäure-Kohlenstoffassimilationsweg ein zyklischer Weg zur Assimilation von Kohlendioxid und Ameisensäure zu Brenztraubensäure mit drei Kohlenstoffatomen in Mikroorganismen. Gene, Coenzyme und Energieträger, die am Ameisensäure-Assimilationsweg von E. coli beteiligt sind, sind in 1 dargestellt.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann der Ameisensäure-Assimilationsweg mit dem zentralen Kohlenstoff-Assimilationsweg kombiniert werden, um eine Kohlenstoffverbindung mit drei oder mehr Kohlenstoffatomen zu synthetisieren. Der Wirtsmikroorganismus: i) verfügt von Natur aus über einen zentralen Kohlenstoff-Assimilationsweg; oder ii) hat einen zentralen Kohlenstoff-Assimilationsweg darin eingeführt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Wirtsmikroorganismus aus der Gruppe ausgewählt, die aus den Gattungen Escherichia, Mannheimia, Rhodobacter und Methylobacterium besteht, ist aber nicht auf diese beschränkt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Expression des Gens, das für das Enzym codiert, das an der Glycinspaltungsystemreaktion beteiligt ist, durch Ersetzen eines nativen Promotors durch einen starken Promotor verstärkt werden, aber die Erfindung ist darauf nicht beschränkt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der starke Promotor aus der Gruppe ausgewählt, die aus einem trc-Promotor, einem tac-Promotor, einem T7-Promotor, einem lac-Promotor und einem trp-Promotor besteht, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung stammen die Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase, die Methenyl-Tetrahydrofolat-Cyclohydrolase und die Ethylen-Tetrahydrofolat-Dehydrogenase von Methylobacterium extorquens, aber die Erfindung ist nicht darauf beschränkt. Das Gen, das für die Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase codiert, hat die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1, das Gen, das für die Methenyltetrahydrofolat-Cyclohydrolase codiert, hat die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2, und das Gen, das für die Methylen-Tetrahydrofolat-Dehydrogenase codiert, hat die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 3, aber die vorliegende Erfindung ist darauf nicht beschränkt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Gen, das für ein Phosphoenolpyruvat-Synthase-Regulationsprotein oder Phosphoribosylglycinamid-Formyltransferase codiert, in dem rekombinanten Mikroorganismus weiter abgeschwächt oder deletiert werden, die Expression eines Gens, das für Phosphoenolpyruvat-Synthase oder H+-translozierende NAD(P)-Transhydrogenase codiert, kann in dem rekombinanten Mikroorganismus weiter verstärkt werden, und ein Gen, das für Formiatdehydrogenase und/oder eine Mutante davon codiert, kann weiter in den rekombinanten Mikroorganismus eingeführt werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Expression des Gens, das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase (ppsA) und die H+-translozierende NAD(P)-Transhydrogenase (pntAB) codiert, durch Ersetzen eines nativen Promotors durch einen starken Promotor verstärkt, wobei der starke Promotor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem trc-Promotor, einem tac-Promotor, einem T7-Promotor, einem lac-Promotor und einem trp-Promotor besteht, wobei die vorliegende Erfindung jedoch nicht darauf beschränkt ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Gene, die für eines oder mehrere aus der Gruppe codieren, bestehend aus Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase, Methenyl-Tetrahydrofolat-Cyclohydrolase, Methylen-Tetrahydrofolat-Dehydrogenase, Formiat-Dehydrogenase und Formiat-Dehydrogenase-Mutante, eingeführt, indem sie in einen Vektor kloniert werden, der einen Replikationsursprung mit 1 bis 12 Kopien enthält, vorzugsweise indem sie in einen Vektor kloniert werden, der einen Replikationsursprung mit 1 bis 5 Kopien enthält, wobei die Erfindung jedoch nicht darauf beschränkt ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii stammen, und das Gen, das für die Formiatdehydrogenase-Mutante codiert, kann aus Arabidopsis thaliana stammen, aber die vorliegende Erfindung ist darauf nicht beschränkt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Gen, das für die Formiatdehydrogenase codiert, durch eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 18 dargestellt und das Gen, das für die Formiatdehydrogenasemutante codiert, wird durch eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 21 dargestellt, aber die vorliegende Erfindung ist darauf nicht beschränkt.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde der native Promotor durch einen starken Promotor ersetzt, um das Gen, das für das Enzym codiert, das an der Glycinspaltungssystemreaktion in dem rekombinanten Mikroorganismus beteiligt ist, zu verstärken, und das Gen, das für den Transkriptionsrepressor des Glycinspaltungssystems codiert, wurde deletiert, um das Glycinspaltungssystem zu unterdrücken. Außerdem wurde das Gen, das für die Pyruvat-Formiat-Lyase codiert, deletiert, um eine unnötige Umwandlung von Brenztraubensäure in Ameisensäure zu verhindern und den Pyruvatbildungsfluss zu verbessern. Darüber hinaus ist das Gen, das für die D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase codiert, ein Gen, das für das Wachstum in glucosehaltigem M9-Minimalmedium wesentlich ist. Wenn dieses Gen deletiert wird, kann 5,10-CH2-THF, das für die Biosynthese von Metaboliten wie Purin und Methionin erforderlich ist, nur über den C1-Verbindungsassimilationsweg produziert werden. Aus diesem Grund wird das Wachstum des Stammes gefördert, wenn der Stoffwechselfluss des C1-Verbindungsassimilationsweges verbessert wird. Daher wurde das Gen, das für D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase codiert, deletiert.
  • Der rekombinante Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, eine C3-Verbindung unter ausschließlicher Verwendung von Ameisensäure und Kohlendioxid als Kohlenstoffquellen herzustellen.
  • Der rekombinante Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch in der Lage, unter ausschließlicher Verwendung von Ameisensäure und Kohlendioxid als Kohlenstoffquellen zu wachsen.
  • Die Gene der vorliegenden Erfindung können in der codierenden Region auf verschiedene Weise verändert werden, solange die Aminosäuresequenz des Proteins, das von der codierenden Region exprimiert wird, nicht verändert wird, und sie können frei variiert oder modifiziert werden, solange die Expression der Gene in einer Region außerhalb der codierenden Region nicht beeinflusst wird, und solche variierten oder modifizierten Gene fallen ebenfalls in den Umfang der vorliegenden Erfindung.
  • Daher umfasst die vorliegende Erfindung auch ein Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die im Wesentlichen mit dem Gen identisch ist, sowie ein Fragment des Gens. Der Begriff „im Wesentlichen identisches Polynukleotid“ bedeutet ein Gen, das für ein Enzym codiert, das die gleiche Funktion hat wie das in der vorliegenden Erfindung verwendete, unabhängig von der Homologie der Sequenz. Der Begriff „Fragment des Gens“ bedeutet auch ein Gen, das für ein Enzym mit der gleichen Funktion wie das in der vorliegenden Erfindung verwendete codiert, unabhängig von der Länge des Fragments.
  • Darüber hinaus kann die Aminosäuresequenz des Proteins, das ein Expressionsprodukt des Gens der vorliegenden Erfindung ist, aus biologischen Ressourcen wie verschiedenen Mikroorganismen gewonnen werden, solange der Titer und die Aktivität des entsprechenden Enzyms nicht beeinträchtigt werden, und diese biologischen Ressourcen fallen ebenfalls in den Umfang der vorliegenden Erfindung.
  • Daher umfasst die vorliegende Erfindung auch Polypeptide mit Aminosäuresequenzen, die im Wesentlichen mit dem Protein identisch sind, sowie Fragmente der Polypeptide. Der Begriff „im Wesentlichen identisches Polypeptid“ bedeutet ein Protein mit der gleichen Funktion wie das in der vorliegenden Erfindung verwendete, unabhängig von der Homologie der Aminosäuresequenz. Der Begriff „Fragment des Polypeptids“ bezeichnet ebenfalls ein Protein, das die gleiche Funktion wie das in der vorliegenden Erfindung verwendete hat, unabhängig von der Länge des Fragments.
  • Der hier verwendete Begriff „Vektor“ bezeichnet ein DNA-Produkt, das eine DNA-Sequenz enthält, die funktionsfähig mit einer Regulationssequenz verknüpft ist, die in der Lage ist, DNA in einem geeigneten Wirt zu exprimieren, und kann ein Plasmid, ein Phagenpartikel oder eine einfache potenzielle Genom-Insertion sein. Sobald der Vektor in einen geeigneten Wirt transformiert ist, kann er sich replizieren und unabhängig vom Genom des Wirts funktionieren, oder er kann in einigen Fällen in das Genom des Wirts integriert werden. Da das Plasmid der am häufigsten verwendete Vektortyp ist, werden die Begriffe „Plasmid“ und „Vektor“ in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung manchmal synonym verwendet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise ein Plasmidvektor verwendet. Ein typischer Plasmidvektor, der für diesen Zweck verwendet werden kann, umfasst (a) einen Replikationsursprung, um die Replikation effizient durchzuführen, so dass mehrere bis mehrere hundert Plasmidvektoren pro Wirtszelle enthalten sind, (b) ein Antibiotikaresistenzgen, um eine mit dem Plasmidvektor transformierte Wirtszelle zu screenen, und (c) eine Restriktionsenzym-Spaltstelle, in die ein fremdes DNA-Fragment eingefügt wird. Auch wenn keine geeignete Restriktionsenzym-Spaltstelle vorhanden ist, können der Vektor und die Fremd-DNA mit Hilfe eines synthetischen Oligonukleotid-Adapters oder eines Linkers nach einem herkömmlichen Verfahren leicht ligiert werden. Nach der Ligation sollte der Vektor in eine geeignete Wirtszelle transformiert werden. Die Transformation kann leicht mit einer Calciumchlorid- oder Elektroporationsmethode durchgeführt werden (Neumann et al., EMBO J., 1: 841, 1982).
  • Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet „Gen ist abgeschwächt (oder inaktiviert)“, dass die Expression des Gens im Vergleich zum Wildtyp abgeschwächt ist, oder dass die Funktion oder Aktivität des vom Gen codierten Proteins im Vergleich zum Wildtyp abgeschwächt ist.
  • Als Vektoren zur Verstärkung oder Überexpression von Genen im Sinne der vorliegenden Erfindung können bekannte Expressionsvektoren verwendet werden.
  • Wenn eine Nukleotidsequenz mit einer anderen Nukleotidsequenz auf der Grundlage einer funktionellen Beziehung ausgerichtet ist, spricht man von „funktionsfähig verknüpft“ mit dieser. Dabei kann es sich um ein Gen/Gene und eine regulatorische Sequenz/regulatorische Sequenzen handeln, die so miteinander verbunden sind, dass sie die Genexpression ermöglichen, wenn ein geeignetes Molekül (z. B. ein Transkriptionsaktivatorprotein) mit der/den regulatorischen Sequenz(en) verbunden ist. Beispielsweise ist die DNA für eine Prä-Sequenz oder einen Sekretions-Leader funktionsfähig mit der DNA für ein Polypeptid verknüpft, wenn es als Prä-Protein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist, ein Promotor oder Enhancer ist funktionsfähig mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst, eine Ribosomen-Bindungsstelle ist funktionsfähig mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Transkription der Sequenz beeinflusst, oder eine Ribosomen-Bindungsstelle ist funktionsfähig mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet „funktionsfähig verknüpft“, dass die verknüpfte DNA-Sequenz mit ihr in Kontakt steht oder dass ein sekretorischer Leader mit ihr in Kontakt steht und im Leseraster vorhanden ist. Der Enhancer muss jedoch nicht in Kontakt sein. Die Verknüpfung dieser Sequenzen erfolgt durch Ligation (Verknüpfung) an einer geeigneten Restriktionsenzymstelle. Ist eine solche Stelle nicht vorhanden, wird ein synthetischer Oligonukleotid-Adapter oder ein Linker nach einem herkömmlichen Verfahren verwendet. Wie im Fachgebiet bekannt ist, sollte, um das Expressionslevel eines Transgens in einer Wirtszelle zu erhöhen, das Gen mit einer transkriptionellen/translationalen Expressionsregulationssequenz funktionsfähig verknüpft werden, die in einem ausgewählten Expressionswirt funktionsfähig ist. Vorzugsweise sind die Expressionsregulationssequenz und das entsprechende Gen in einem rekombinanten Vektor enthalten, der sowohl einen bakteriellen Selektionsmarker als auch einen Replikationsursprung enthält. Handelt es sich bei der Wirtszelle um eine eukaryotische Zelle, sollte der rekombinante Vektor außerdem einen nützlichen Expressionsmarker im eukaryotischen Expressionswirt enthalten.
  • Die mit dem oben beschriebenen rekombinanten Vektor transformierte Wirtszelle ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung. Der hier verwendete Begriff „Transformation“ bedeutet die Einführung von DNA in einen Wirt und die DNA durch einen extrachromosomalen Faktor oder chromosomale Integration replizierbar zu machen.
  • Es sollte klar sein, dass nicht alle Vektoren bei der Expression der DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung identisch funktionieren. Ebenso funktionieren nicht alle Wirte identisch für das gleiche Expressionssystem. Der Fachmann wird jedoch in der Lage sein, aus einer Vielzahl von Vektoren, Expressionsregulationssequenzen und Wirten eine geeignete Auswahl zu treffen, ohne übermäßigen Experimentieraufwand zu betreiben und ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Zum Beispiel sollte die Auswahl eines Vektors unter Berücksichtigung eines Wirts erfolgen, da der Vektor darin repliziert werden sollte. Die Anzahl der Replikationen des Vektors, die Fähigkeit, die Anzahl der Replikationen zu kontrollieren, und die Expression anderer Proteine, für die der entsprechende Vektor codiert, wie die Expression von Antibiotikamarkern, sollten ebenfalls berücksichtigt werden.
  • Darüber hinaus kann das im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingeführte Gen in das Genom einer Wirtszelle eingeführt werden und als chromosomaler Faktor vorliegen. Dem Fachmann wird klar sein, dass selbst die Insertion des Gens in das Genom der Wirtszelle die gleiche Wirkung hat wie die Einführung des rekombinanten Vektors in die Wirtszelle.
  • In der Zwischenzeit wurde bei der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass das Wachstum des rekombinanten Mikroorganismus auf das 7-11-fache verbessert werden kann, indem die IPTG-Dosis, die Kulturtemperatur, die Belüftung, die Ameisensäurekonzentration und die pH-Bedingungen im Schritt der Kultivierung des rekombinanten Mikroorganismus angepasst werden.
  • In einem anderen Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer C3-Verbindung gerichtet, das Folgendes umfasst: (a) einen Schritt der Kultivierung des rekombinanten Mikroorganismus mit Ameisensäure und Kohlendioxid als Kohlenstoffquellen zur Herstellung einer C3-Verbindung; und (b) einen Schritt des Sammelns der hergestellten C3-Verbindung.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden 0,02 bis 0,08 mM IPTG, vorzugsweise 0,04 bis 0,06 mM IPTG, am meisten bevorzugt 0,05 mM IPTG, in dem Schritt der Kultivierung des rekombinanten Mikroorganismus zugegeben. Dadurch wird die Genexpression mit einer deutlich geringeren IPTG-Dosis induziert als bei verwandten Verfahren, bei denen 1 mM IPTG verwendet wird. Dadurch kann das Wachstum der Mikroorganismen gefördert und gleichzeitig der Brenztraubensäure-Synthesestoffwechselweg unter Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure fein gesteuert werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der rekombinante Mikroorganismus bei 31 bis 33°C, vorzugsweise bei 32°C, kultiviert werden, ist aber nicht darauf beschränkt. Unter den oben genannten Temperaturbedingungen wandeln Cytochrombo3-Ubichinol-Oxidase (Cyo) und Cytochrom-bd-I-Ubichinol-Oxidase (Cyd) die Reduktionskraft am effizientesten in zelluläre Energie, nämlich ATP, um.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird während des Kultivierungsschritts die Ameisensäure bei einer Konzentration von 2 bis 3 g/l und der pH-Wert bei 6,6 bis 7,0 gehalten, aber die vorliegende Erfindung ist darauf nicht beschränkt. Darüber hinaus kann der rekombinante Mikroorganismus im Rahmen der vorliegenden Erfindung zunächst mit einer Rührgeschwindigkeit von 450 bis 550 U/min kultiviert werden und dann unter Erhöhung der Rührgeschwindigkeit auf eine Endgeschwindigkeit von 700 bis 800 U/min kultiviert werden, wobei die vorliegende Erfindung hierauf nicht beschränkt ist. Durch die Bereitstellung einer solchen Ameisensäurekonzentration, eines solchen pH-Werts und einer solchen Belüftung wird die Wachstumsrate des rekombinanten Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung erheblich verbessert.
  • In einem anderen Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer nützlichen Verbindung unter Verwendung von Brenztraubensäure als Zwischenprodukt gerichtet, das Folgendes umfasst: (a) einen Schritt der Kultivierung des rekombinanten Mikroorganismus mit Ameisensäure und Kohlendioxid als Kohlenstoffquellen zur Herstellung einer nützlichen Substanz mit einer Brenztraubensäure als Zwischenprodukt; und (b) einen Schritt des Sammelns der hergestellten nützlichen Substanz.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die nützliche Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Butanol, Isobutanol, Hexanol, Heptanol, Octanol, Nonanol, Decanol, tert-Butanol, 1-Pentanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 2-Methyl-1-butanol, 3-Methyl-1-butanol, 2-Methyl-2-butanol, Isobutanol, Putrescin, L-Ornithin, Arginin, polycyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAHs), Polylactat, Polylactat-Co-Glycolat, Polyisovalerat, Polyhydroxybutyrat (PHB), 4-Hydroxybutyrat, Biodiesel, Benzin, Olefin, 5-Aminovaleriansäure, Gamma-Iminobuttersäure, 3-Hydroxypyropionsäure, 3-Aminopropionsäure, Acrylsäure, 1,3-Diaminopropan, Caprolactam, Threonin, Valin, Isoleucin, Fumarsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Ceramid, Astaxanthin, Silybin, Lycopin, Lutein und Retinol, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • Der rekombinante Mikroorganismus und das Verfahren zur Herstellung einer C3-Verbindung unter Verwendung desselben gemäß der vorliegenden Erfindung weisen die folgenden Merkmale auf.
  • Erstens verbessert der rekombinante Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung die Umwandlungsrate von Kohlendioxid und Ameisensäure in Brenztraubensäure durch Verbesserung des metabolisch veränderten Stammes. Zum Beispiel wurden das pflB-Gen und das serA-Gen aus dem rekombinanten Mikroorganismus, der Brenztraubensäure unter Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure synthetisieren kann und der zuerst von den vorliegenden Erfindern entwickelt wurde, weiter entfernt, um einen Stamm zu entwickeln, der Brenztraubensäure aus Kohlendioxid und Ameisensäure mit einer verbesserten Rate synthetisieren kann (DH5α RG5). Dieser Stamm synthetisiert Brenztraubensäure aus Kohlendioxid und Ameisensäure mit einer Rate, die 12,9% der Rate der Synthese von Brenztraubensäure aus Glucose entspricht, was im Vergleich zu den herkömmlichen rekombinanten Mikroorganismen, die Brenztraubensäure aus Kohlendioxid und Ameisensäure synthetisieren können, die von den vorliegenden Erfindern entwickelt wurden, auf 70% erhöht ist.
  • Der rekombinante Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung kann unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure gezüchtet werden. Die rekombinanten Mikroorganismen, die zuvor von den vorliegenden Erfindern entwickelt wurden, sind in der Lage, Brenztraubensäure unter Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure zu produzieren, aber Glucose muss für das Wachstum der rekombinanten Mikroorganismen separat zugeführt werden. Der rekombinante Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung kann jedoch unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure ohne die Zufuhr von Glucose wachsen, durch Entfernen des ppsR-Gens und des purT-Gens aus dem Genom des rekombinanten Mikroorganismus (DH5α RG5) mit einer verbesserten Syntheserate von Brenztraubensäure aus Kohlendioxid und Ameisensäure, Ersetzen des nativen Promotors des ppsA-Gens durch den starken trc-Promotor und weiteres Einführen des Formiatdehydrogenase-Gens, das von Candida boidinii stammt, und des mutierten Gens der Formiatdehydrogenase, das von Arabidopsis thaliana stammt, mittels des Plasmids.
  • Um die Wachstumsrate des rekombinanten Mikroorganismus (DH5α FC5) weiter zu verbessern, wurde gemäß der vorliegenden Erfindung ein rekombinanter Mikroorganismus (DH5α FC8) entwickelt, bei dem die Anzahl der Kopien des eingeführten Plasmids weiter angepasst ist. Infolgedessen wurde die Wachstumsrate des rekombinanten Mikroorganismus DH5α FC8 auf das 1,14-fache der des rekombinanten Mikroorganismus DH5α FC5 erhöht. Um die Wachstumsrate des rekombinanten Mikroorganismus (DH5α FC8) weiter zu verbessern, wurde gemäß der vorliegenden Erfindung ein rekombinanter Mikroorganismus (DH5α FC9) entwickelt, bei dem der native Promotor des pntAB-Gens durch einen starken trc-Promotor ersetzt wurde. Infolgedessen war die Wachstumsrate des rekombinanten Mikroorganismus DH5α FC9 doppelt so hoch wie die des rekombinanten Mikroorganismus DH5α FC8.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden Kultur- und Fermentationsbedingungen bestimmt, die das Wachstum des rekombinanten Mikroorganismus maximieren können. Die Kultur- und Fermentationsbedingungen liefern die maximale Wachstumsgrenze, OD600=7,38-11,1, die 7-11 mal höher ist als die maximale Wachstumsgrenze, OD600 (etwa 1), von E. coli, die unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure gezüchtet wird, wie zuvor in der Literatur berichtet wurde (Kim, S. et al. Nat. Chem. Biol. 1-8, 2020), was durch die Verringerung der IPTG-Dosis für die Genexpression, die Senkung der Kulturtemperatur, die Verbesserung der Belüftung und die Kontrolle der Ameisensäurekonzentration und des pH-Werts erreicht wurde.
  • Beispiel
  • Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben. Dem Fachmann wird jedoch klar sein, dass die folgenden Beispiele nur zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen und nicht als Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung zu verstehen sind.
  • Beispiel 1: Verbesserung des Stoffwechselflusses für die Bildung von Brenztraubensäure aus Kohlendioxid und Ameisensäure durch Etablierung eines Kohlendioxid- und Ameisensäure-Assimilationsweges und einer metabolischen Engineering-Strategie
  • Zur Verbesserung des Kohlenstoffassimilations-Stoffwechselflusses im Kohlendioxid- und Ameisensäureassimilations-Stoffwechselweg wurde ein Plasmid, das die am Kohlendioxid- und Ameisensäureassimilationsweg beteiligten Gene ftl, fch und mtd enthält, in einen rekombinanten E. coli-Stamm eingeführt, in dem die Gene gcvR, pflB und serA von E. coli deletiert wurden und der gcvT-Promotor durch den starken trc-Promotor ersetzt wurde, um einen rekombinanten Stamm zu entwickeln, der 12,9% der gesamten Brenztraubensäure aus Kohlendioxid und Ameisensäure synthetisiert.
  • Konkret wurden die für die Plasmidproduktion erforderlichen fremden Genfragmente durch Durchführung einer PCR unter Verwendung der genomischen DNA von Mikroorganismen, die das entsprechende Gen als Matrize haben, und unter Verwendung eines Primers, der für die Amplifikation des Gens entwickelt wurde, hergestellt und dann die amplifizierten Genfragmente gesammelt und gereinigt. Die entsprechenden Gene und Primersequenzen sind in den Tabellen 1 und 2 unten aufgeführt. [Tabelle 1]
    Zielgen NCBI-Informationen Abgeleiteter Mikroorganismus
    ftfL Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase CP001298 REGION: 434499-436172 [SEQ ID NO: 01] Methylobacterium extorquens CM4
    fch Methenyltetrahydrofolat-CyclohydrolaseCP001298 REGION: 2231946-2232572 [SEQ ID NO: 02] Methylobacterium extorquens CM4
    mtdA Methylen-Tetrahydrofolat-Dehydrogenase CP001298 REGION: 2230986-2231852 [SEQ ID NO: 03] Methylobacterium extorquens CM4
    [Tabelle 2]
    Zielgen Primer-Sequenz
    ftfL[SEQ ID NO:01] [SEQ ID NO: 04]: 5'-CCCGCTCGCCAAGGCTTGA AGGAGGAATTCATGCCCTCAGATATCGAGATC-3' [SEQ ID NO: 05]: 5'-CTAGAACAGCCCGTCGATC-3'
    fch[SEQ ID NO:02] [SEQ ID NO: 06]: 5'-GATCGACGGGCTGTTCTAG AGGAGGAATTCATGGCCGGCAACGAGACGATC-3' [SEQ ID NO: 07]: 5'-TCAGTTTACCTTGGACTTCAC-3'
    mtdA[SEQ ID NO:03] [SEQ ID NO: 08]: 5'-GTGAAGTCCAAGGTAAACTGA AGGAGGAATTCATGTCCAAGAAGCTGCTCTTC-3' [SEQ ID NO: 09]: 5'-TCATCCGCCAAAACAGCCAAGTCA GGCCATTTCCTTGGCC-3'
  • Ein Plasmid mit Genen, die für die oben genannten Enzyme codieren, wurde hergestellt, um den Kohlendioxid- und Ameisensäure-Assimilationsweg zu konstruieren. [Tabelle 3]
    Plasmid Merkmale
    p100THF Enthält pBR322 Replikationsursprung, Ampicillin-Resistenzgen, BBa_23100 synthetischer Promotor, SEQ ID NO:01 Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase, SEQ ID NO:02 Methenyl-Tetrahydrofolat-Cyclohydrolase und SEQ ID NO:03 Methylen-Tetrahydrofolat-Dehydrogenase
  • Die Plasmide wurden aus den Genfragmenten des Plasmidrückgrats und den amplifizierten Genfragmenten mithilfe der Gibson-Assembly-Methode (Gibson et al., Nat. Methods, 6:5, 343-345, 2009) hergestellt, die üblicherweise für die Assemblierung von Genfragmenten verwendet wird, und jedes Plasmid wurde so hergestellt, dass es eines oder mehrere der in der obigen Tabelle aufgeführten Fremdgene enthält.
  • Das rekombinante Plasmid, das mit dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, wurde in E. coli transformiert, um rekombinante E. coli zu produzieren. Bei dem in der vorliegenden Erfindung verwendeten E. coli handelte es sich um E. coli DH5α (Invitrogen, USA), und die Transformation in E. coli wurde mit einer in der Technik üblichen chemischen Transformationsmethode durchgeführt.
  • Außerdem wurde der native Promotor durch einen starken trc-Promotor ersetzt, um das gcvTHP-Gen (gcvT, NCBI GeneID: 947390; gcvH, NCBI GeneID: 947393; gcvP, NCBI GeneID: 947394), das für das Enzym codiert, das an der Reaktion des Glycinspaltungssystems im rekombinanten Mikroorganismus beteiligt ist, zu verstärken, und das Gen gcvR, das das Glycinspaltsystem unterdrückt, wurde deletiert. Außerdem wurde das Gen pflB, das für die Pyruvat-Formiat-Lyase codiert, deletiert, um eine unnötige Umwandlung von Brenztraubensäure in Ameisensäure zu verhindern und den Pyruvatbildungsfluss zu verbessern. Darüber hinaus ist das Gen serA, das für D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase codiert, ein für das Wachstum in glucosehaltigem M9-Minimalmedium wesentliches Gen. Wenn dieses Gen deletiert wird, kann 5,10-CH2-THF, das für die Biosynthese von Metaboliten wie Purin und Methionin erforderlich ist, nur über den C1-Verbindungsassimilationsweg produziert werden. Wenn also der Stoffwechselfluss des C1-Verbindungsassimilationsweges verbessert wird, wird das Wachstum des Stammes erleichtert. Aus diesem Grund wurde das Gen serA deletiert. Die verstärkten und deletierten Gene sind unten aufgeführt. [Tabelle 4]
    Zielgen NCBI-Informationen Abgeleiteter Mikroorganismus
    gcvT Aminomethyltransferase Escherichia coli
    NCBI GeneID:947390
    [SEQ ID NO: 10]
    gcvH Glycinspaltungssystem H-Protein Escherichia coli
    NCBI GeneID:947393
    [SEQ ID NO: 11]
    gcvP Glycin-Decarboxylase Escherichia coli
    NCBI GeneID:947394
    [SEQ ID NO: 12]
    pflB Pyruvat-Formiat-Lyase Escherichia coli
    NCBI GeneID:945514
    [SEQ ID NO: 13]
    serA Phosphoglycerat-Dehydrogenase Escherichia coli
    NCBI GeneID:945258
    [SEQ ID NO: 14]
    gcvR Transkriptionsrepressor für das Glycinspaltungssystem Escherichia coli
    GeneID: 946950
    [SEQ ID NO: 15]
    [Tabelle 5]
    Name des Stammes Art des Gens
    DH5α GTPS DH5α-Stamm, bei dem gcvR-, pflB- und serA-Gene deletiert wurden und der native Promotor von gcvT durch den trc-Promotor ersetzt wurde
  • Das p100THF-Plasmid wurde in den erzeugten Stamm eingeführt, um den folgenden Stamm zu erzeugen. [Tabelle 6]
    DH5α RG5 DH5α_GTPS, das p100THF beherbergt
  • Die Kohlenstoffisotopenanalyse wurde an rekombinanten E. coli (DH5α RG5) als Versuchsgruppe und an Wildtyp-E. coli (DH5α WT) als Kontrollgruppe durchgeführt, um den erhöhten Stoffwechselfluss für die Assimilation von Kohlendioxid und Ameisensäure in den produzierten rekombinanten E. coli (DH5α RG5) zu ermitteln. [Tabelle 7]
    Inhaltsstoff Gehalt (g/l)
    Na2HPO4 3,6
    KH2PO4 3
    NaCl 0,5
    NH4Cl 1
    MgSO4 0,24
    CaCl2 0,011
    Glucose 5
    Natriumformiat 13C 2,76
    Folat 0,01
    Natriumhydrogenkarbonat 13C 3,4
    FeSO4 0,00455
    NiSO]4 0,00464
    Natriummolybdat 0,00618
    Thiamin 0,01
  • Die Kontroll- und Versuchs-E. coli wurden in M9-Medium kultiviert, das mit einem 13C-Kohlenstoffisotop markierte Formiat- und Bicarbonationen enthielt (siehe die in Tabelle 7 angegebene Zusammensetzung), und dann wurden die E. coli-Zellproben analysiert. Die Analyse der Massenzahl der Aminosäuren, aus denen E. coli besteht, unter Verwendung von E. coli-Zellproben erfolgte mittels Gaschromatographie/Massenspektroskopie nach Hydrolyse aller Proteine, aus denen Escherichia coli besteht, unter stark sauren und Hochtemperaturbedingungen (Zamboni et al., Nat. Protocols, 4:6, 878-892, 2009).
  • Das Ergebnis der Isotopenanalyse zeigte, dass der DH5α RG5-Stamm den Stoffwechselfluss für die Bildung von Brenztraubensäure durch Assimilation mit Kohlendioxid und Ameisensäure auf 12,9% des gesamten Stoffwechselflusses für die Bildung von Brenztraubensäure erhöhte.
  • Beispiel 2: Entwicklung rekombinanter Mikroorganismen, die unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure wachsen können, durch Verbesserung eines metabolisch veränderten Stammes
  • Die Gene ppsR und purT wurden aus dem Genom des in Beispiel 1 hergestellten rekombinanten E. coli-Stamms deletiert, der Promotor des ppsA-Gens wurde durch einen starken trc-Promotor ersetzt, um einen rekombinanten E. coli-Stamm (DH5α AKO1) zu erzeugen, und ein Plasmid (p100FA2), das durch Hinzufügen des fdh-Gens und des fdhmut-Gens zu dem in Beispiel 1 erzeugten Plasmid erzeugt wurde, wurde in den rekombinanten E. coli-Stamm (DH5a AKO1) eingeführt, um E. coli (DH5α FC5) zu erzeugen, das unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure wachsen kann. [Tabelle 8]
    Zielgen NCBI-Informationen Abgeleiteter Mikroorganismus
    ppsR Phosphoenolpyruvat-Synthase-Regulationsprotein NCBI GeneID:946207 Escherichia coli
    [SEQ ID NO: 16]
    purT Phosphoribosylglycinamid-Formyltransferase NCBI GenelD:946368 Escherichia coli
    [SEQ ID NO: 17]
    [Tabelle 9]
    Plasmid Merkmale
    p100FA2 Enthält pBR322 Replikationsursprung, Ampicillin-Resistenzgen, BBa_23100 synthetischer Promotor, SEQ ID NO: 01 Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase, SEQ ID NO: 02 Methenyl-Tetrahydrofolat-Cyclohydrolase, SEQ ID NO: 03 Methylen-Tetrahydrofolat-Dehydrogenase, SEQ ID NO: 18 Formiat-Dehydrogenase und SEQ ID NO: 21 Formiat-Dehydrogenase-Mutante
  • Damit Zellen unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure ohne Glucose wachsen können, ist eine ununterbrochene Versorgung mit Energie und Reduktionskraft (Redox) erforderlich. Zu diesem Zweck ist ein Stoffwechselweg zur Erzeugung von NADH und NADPH bei gleichzeitiger Umwandlung von Ameisensäure in Kohlendioxid erforderlich. Daher wurden das aus Candida boidinii stammende fdh-Gen, das für die Ameisensäure-Dehydrogenase unter Verwendung von NAD+ codiert, und eine Mutante fdhmut des aus Arabidopsis thaliana stammenden fdh-Gens, das für die Ameisensäure-Dehydrogenase unter Verwendung von NADP+ codiert, in das p100THF-Plasmid eingeführt, um ein p100FA2-Plasmid zu erstellen. [Tabelle 10]
    Plasmid Merkmale
    p100FA2 Enthält pBR322 Replikationsursprung, Ampicillin-Resistenzgen, BBa_23100 synthetischer Promotor, SEQ ID NO: 01 Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase, SEQ ID NO: 02 Methenyl-Tetrahydrofolat-Cyclohydrolase, SEQ ID NO: 03 Methylen-Tetrahydrofolat-Dehydrogenase, SEQ ID NO: 18 Formiat-Dehydrogenase und SEQ ID NO: 21 Formiat-Dehydrogenase-Mutante
    [Tabelle 11]
    Zielgen NCBI-Informationen Abgeleiteter Mikroorganismus
    fdh Formiat-Dehydrogenase EC:1.17.1.9 [SEQ ID NO: 18] Candida boidinii
    [Tabelle 12]
    Zielgen Primer-Sequenz
    fdh [SEQ ID NO:18] [SEQ ID NO: 19]: 5'- attgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaccatgaagatcgttttagtcttata -3' [SEQ ID NO: 20]: 5'- gtaccgagctcgaattccatttatttcttatcgtgtttac -3'
    [Tabelle 13]
    Zielgen NCBI-Informationen Abgeleiteter Mikroorganismus
    fdhmut Formiat-Dehydrogenase-Mutante Arabidopsis thaliana
    NCBI_GeneID:831330 [SEQ ID NO: 21]
    L229H-Mutante
    [Tabelle 14]
    Zielgen Primer-Sequenz
    fdhmut [SEQ ID NO:21] [SEQ ID NO: 22]: 5'gtaaacacgataagaaataaaggaggaattcatggcgatgagacaagccgc-3' [SEQ ID NO: 23]: 5'- tcatccgccaaaacagccaagttaccggtactgaggagcaag -3'
  • Der DH5α-FC5-Stamm, der durch Einbringen des p100FA2-Plasmids in den DH5α-AKO1-Stamm erzeugt wurde, wuchs von einer anfänglichen optischen Dichte von 0,051 bis zu einer optischen Dichte von 0,285 nach 150-stündiger Kultur, wenn dem M9-Minimalmedium nur Kohlendioxid und Ameisensäure zugesetzt wurden (Tabelle 15). Im Gegensatz dazu zeigte die negative Kontrollgruppe (DH5a FC1, FC2, FC3) kein Stammwachstum. [Tabelle 15]
    Inhaltsstoff Gehalt (g/l)
    Na2HPO4 6,8
    KH2PO4 3
    NaCl 0,5
    NH4Cl 2
    MgSO4 0,8
    NaHCO3 4,2
    IPTG 0,24
    EDTA 0,05
    Thiamin 0,002
    Lösung von Spurenelementen 5ml
    Natriumformiat 4,43
    [Tabelle 16]
    Name des Stammes Art des Gens
    DH5α AKO Das ppsR-Gen wurde ausgeschaltet und der native Promotor des ppsA-Gens wurde durch den trc-Promotor im DH5α_GTPS-Stamm ersetzt.
    DH5α AKO1 Das purT-Gen wurde aus dem AKO-Stamm ausgeschaltet
    DH5α FC1 DH5α_GTPS, das p100FA1 beherbergt
    DH5α FC2 AKO, das p100FA1 beherbergt
    DH5α FC3 AKO1, das p100FA1 beherbergt
    DH5α FC5 AKO1, das p100FA2 beherbergt
  • Zusätzlich wurde die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) bestimmt, um die Zunahme der Zellzahl durch Zellteilung zu messen. Das Ergebnis zeigte, dass die anfängliche KBE 4,8 × 107 KBE/ml (OD600 von 0,051) betrug, dass die KBE nach 50 Stunden auf 14,1 × 107 KBE/ml (OD600 von 0,2) anstieg und dass die KBE dann nach 150 Stunden allmählich auf 5,2 × 107 KBE/ml (OD600 von 0,285) abnahm (3 und 4).
  • Beispiel 3: Verbesserung der Wachstumsrate durch Optimierung der Kulturumgebung und der Genexpressionslevel
  • Die Kulturbedingungen des in Beispiel 2 hergestellten DH5α FC5-Stammes wurden optimiert, und ein Plasmid mit einer im Vergleich zum oben beschriebenen Plasmid abgeschwächten Anzahl von Kopien wurde hergestellt, um einen DH5α FC8-Stamm zu konstruieren, der schnell wächst, wenn nur Kohlendioxid und Ameisensäure hinzugefügt werden. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass der DH5α FC8-Stamm bei optischen Dichten von 0,018 bis zu 3,59 unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure wuchs, wenn die herkömmliche Kulturtemperatur von 37°C auf 32°C gesenkt wurde, um das Cyo-Expressionsniveau zu erhöhen und das Cyd-Expressionsniveau zu senken.
  • Beispiel 3-1: Optimierung der Kulturbedingungen für rekombinante Stämme, die unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure wachsen können
  • Die Kulturbedingungen für den in Beispiel 2 hergestellten DH5α FC5-Stamm wurden optimiert. Um die Konzentration von IPTG, einem Induktor zur Förderung der Genexpression, von einer konventionellen Konzentration von 1 mM auf 0,05 mM zu reduzieren, wurden die konventionellen Kulturbedingungen (30 ml Kulturlösung wurden in einen 100 ml Baffle-Kolben gegeben) durch neue Kulturbedingungen (50 ml Kulturlösung wurden in einen 300 ml Baffle-Kolben gegeben) geändert, um die Belüftung zu verbessern. Das Ergebnis der Kultur zeigte, dass die endgültige Zelldichte auf das 2,16-fache der herkömmlichen Kulturbedingungen anstieg (5).
  • Beispiel 3-2: Wachstumsverbesserung von rekombinanten Stämmen, die unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure wachsen können, durch Optimierung der Genexpression
  • Das Genexpressionsniveau wurde so optimiert, dass eine ausreichend hohe Zellkonzentration erreicht wurde, da eine übermäßige Expression von Zellen über das eigentlich erforderliche Expressionsniveau hinaus das Zellwachstum aufgrund der begrenzten Nährstoffversorgung beim Wachstum unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure negativ beeinflusst. Der p15A-Replikationsursprung mit 10 bis 12 Plasmidkopien und der pSC101-Replikationsursprung mit 1 bis 5 Plasmidkopien wurden jeweils in das p100FA1-Plasmid eingeführt, um die folgenden Plasmide zu konstruieren (6). [Tabelle 17]
    Plasmid Merkmale
    p184FA Enthält p15A-Replikationsursprung, Chloramphenicol-Resistenzgen, BBa_23100 synthetischen Promotor, SEQ ID NO: 01 Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase, SEQ ID NO: 02 Methenyl-Tetrahydrofolat-Cyclohydrolase, SEQ ID NO: 03 Methylen-Tetrahydrofolat-Dehydrogenase, SEQ ID NO: 18 Formiat-Dehydrogenase und SEQ ID NO: 21 Formiat-Dehydrogenase-Mutante
    p518FA Enthält pSC101 Replikationsursprung, Chloramphenicol-Resistenzgen, BBa_23100 synthetischer Promotor, SEQ ID NO: 01 Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase, SEQ ID NO: 02 Methenyl-Tetrahydrofolat-Cyclohydrolase, SEQ ID NO: 03 Methylen-Tetrahydrofolat-Dehydrogenase, SEQ ID NO: 18 Formiat-Dehydrogenase und SEQ ID NO: 21 Formiat-Dehydrogenase-Mutante
  • Die PCR wurde unter Verwendung des pACYC184-Plasmids, das ein Chloramphenicol-Resistenzgen, einen p15A-Replikationsursprung und einen synthetischen Promotor BBa_23100 enthält, und des pJH518-Plasmids, das ein Chloramphenicol-Resistenzgen, einen pSC101-Replikationsursprung und einen synthetischen Promotor BBa_23100 enthält, sowie der Primer von SEQ ID NO: 24 bis SEQ ID NO: 27, durchgeführt, und die amplifizierten Genfragmente wurden gesammelt und gereinigt, um Genfragmente herzustellen, die als Plasmidrückgrat für die Herstellung rekombinanter Plasmide verwendet werden.
    • [SEQ NO: 24]: 5'-TGCTGAAAATAAGTCGTCCTGGATCCACTAGTTCTAGAGCGG-3'
    • [SEQ NO: 25]: 5'-ACTATTTACGAAAGTCTCGGGCTTATCGATACCGTCGACCTCG-3'
    • [SEQ NO: 26]: 5'-TGCTGAAAATAAGTCGTCCTGCACCTCGCTAACGGATTCACCAC-3'
    • [SEQ NO: 27]: 5'-ACTATTTACGAAAGTCTCGGGAATTACAACTTATATCGTATGGGGC-3'
  • Das Plasmid p184FA wurde in den DH5α AKO1-Stamm eingeführt, um einen DH5α FC7-Stamm zu erzeugen, und ein Plasmid p518FA wurde in den DH5α FC7-Stamm eingeführt, um einen DH5α FC8-Stamm zu erzeugen. Wenn die beiden Stämme unter den in Beispiel 3-1 entwickelten optimalen Kulturbedingungen kultiviert wurden, wuchs der DH5α FC8-Stamm von einer anfänglichen optischen Dichte von 0,06 bis zu 0,607 für 200 Stunden, was dem 1,14-fachen des DH5α FC5-Stammes entsprach, und der DH5α FC8-Stamm wies die höchste Wachstumsrate auf (7). [Tabelle 18]
    Name des Stammes Art des Gens
    DH5α FC7 AKO1, das p184FA beherbergt
    DH5α FC8 AKO1, das p518FA beherbergt
  • Beispiel 3-3: Verbesserung des Wachstums rekombinanter Stämme, die unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure wachsen können, durch Optimierung der Expressionslevel des Enzyms Cytochrom-bo3-Ubichinol-Oxidase (Cyo) und des Enzyms Cytochrom-bd-I-Ubichinol-Oxidase (Cyd)
  • Das Enzym Cytochrom-bo3-Ubichinol-Oxidase (Cyo) (NCBI GeneID: 945080, 945615, 946897, 944918) und das Enzym Cytochrom-bd-I-Ubichinol-Oxidase (Cyd) (NCBI GeneID: 945341, 945347) sind Enzyme, die sich in der inneren Membran von E. coli befinden und Reduktionskraft in ATP umwandeln, das Zellenergie ist. In einem Artikel (Gadgil, M., Kapur, V. & Hu, WS Biotechnol. Prog. 21, 689-699, 2005) wurde berichtet, dass das Expressionslevel von Cyo anstieg und das Expressionslevel von Cyd abnahm, wenn E. coli bei einer Temperatur von weniger als 37°C kultiviert wurde. Von den beiden Enzymen wandelt Cyo die Reduktionskraft effizienter in ATP um als Cyd. Aus diesem Grund wurde der FC8-Stamm bei 30, 32 und 33°C kultiviert, um das Expressionslevel von Cyo zu erhöhen und das Expressionslevel von Cyd zu verringern. Als Ergebnis der Kultur bei 32°C wuchs E. coli von einer anfänglichen optischen Dichte von 0,018 bis zu 3,59 für 791,5 Stunden (8), das Expressionsniveau von Cyo stieg und das Expressionsniveau von Cyd sank (9). Die Veränderung des Expressionsniveaus wurde durch Vergleich der für die Cyo-Expression verwendeten mRNA-Menge mit der für die Cyd-Expression verwendeten mRNA-Menge mittels relativer RNA-Quantifizierung unter Verwendung von Echtzeit-Quantifizierungs-PCR bestimmt. Die in der relativen mRNA-Quantifizierung verwendeten Primer sind in Tabelle 19 unten aufgeführt. [Tabelle 19]
    Zielgen Primer-Sequenz
    rrsA [SEQ ID NO: 28]: 5'- tgcataaaccgacactggcg -3'
    [SEQ ID NO: 29]: 5'- ttaacctgcttgccgtgctc -3'
    cyoA [SEQ ID NO: 30]: 5'- tggctgcgttcgaaaaactg -3'
    [SEQ ID NO: 31]: 5'- acatcggcaaacaagtctgg -3'
    cyoB [SEQ ID NO: 32]: 5'- ttgcgcacttccataacgtg -3'
    [SEQ ID NO: 33]: 5'- tgaaaccgaacgctttaggc -3'
    cydA [SEQ ID NO: 34]: 5'- ttacgcactgggcatcattg -3'
    [SEQ ID NO: 35]: 5'- atgcgttcttcatgctgcac -3'
    cydB [SEQ ID NO: 36]: 5'- aactccattgcaccacactg -3'
    [SEQ ID NO: 37]: 5'- aagaacaaagacgccagcac -3'
  • Beispiel 4: Entwicklung eines optimierten Fermentationsverfahrens für rekombinante Stämme, die unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure wachsen können
  • Das Wachstum der rekombinanten Stämme wurde durch die Entwicklung eines Fermentationsverfahrens verbessert, das für rekombinante Stämme optimiert wurde, die unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure wachsen können. Um die Ameisensäurekonzentration und den pH-Wert des Kulturmediums auf einem vorgegebenen Niveau zu halten, wurde automatisch eine 30%-ige Ameisensäurelösung zugeführt, wobei der pH-Stat-Modus verwendet wurde, um die Ameisensäurekonzentration (2 - 3 g/l) und den pH-Wert (6,8) im Medium während der Kultur auf einem optimalen Niveau zu halten. Um die Belüftung zu verbessern, wurde außerdem die Rührgeschwindigkeit von der anfänglichen Rührgeschwindigkeit von 500 U/min bis zur endgültigen Rührgeschwindigkeit von 750 U/min um 50 U/min erhöht, sobald die optische Dichte um 1 anstieg. Bei dem optimierten Fermentationsprozess wuchs der DH5α FC8-Stamm von einer anfänglichen optischen Dichte von 1,02 auf eine optische Dichte von 7,38 nach 450 Stunden (10). Darüber hinaus wurde ein weiterer Fermentationsprozess durchgeführt. In dem optimierten Fermentationsprozess wuchs der DH5α FC8-Stamm von einer anfänglichen optischen Dichte von 0,91 bis auf 11,1 nach 577 Stunden (11).
  • Beispiel 5: Entwicklung eines rekombinanten Stammes mit höherer Wachstumsrate durch Anwendung eines optimierten Fermentationsverfahrens auf einen rekombinanten Stamm, der unter ausschließlicher Verwendung von Kohlendioxid und Ameisensäure wachsen kann
  • In dem optimierten Fermentationsprozess, der in Beispiel 4 entwickelt wurde, wuchs der DH5α FC8-Stamm von einer anfänglichen optischen Dichte von 1,02 bis zu 7,38 nach 450 Stunden und von einer anfänglichen optischen Dichte von 0,91 bis zu 11,1 nach 577 Stunden (10 und 11). Der Promotor des pntAB-Gens wurde durch den starken trc-Promotor auf dem Genom des DH5α FC8 ersetzt, um einen rekombinanten E. coli-Stamm (DH5α FC9) herzustellen. In dem optimierten Fermentationsprozess, der in Beispiel 4 entwickelt wurde, wuchs der DH5α FC9-Stamm von einer anfänglichen optischen Dichte von 1,01 bis auf 10,2 nach 206 Stunden. Dies zeigt, dass der DH5α FC9-Stamm in der gleichen Zeit (206 Stunden) mit einer etwa doppelt so hohen Rate wuchs wie der DH5α FC8-Stamm, der von einer anfänglichen optischen Dichte von 0,91 bis auf etwa 5 wuchs (12). [Tabelle 20]
    Zielgen NCBI-Informationen Abgeleiteter Mikroorganismus
    pntA H+-translozierende NAD(P)-Transhydrogenase-Untereinheit alpha Escherichia coli
    NCBI GeneID:946628
    Figure DE102021207101A1_0001
    Figure DE102021207101A1_0002
    pntB H+-translozierende NAD(P)-Transhydrogenase-Untereinheit beta NCBI GeneID:946144
    Figure DE102021207101A1_0003
    		 Escherichia coli
  • Beispiel 6: Einführung des Ameisensäure-Assimilations-Stoffwechselweges in Mikroorganismen der Gattung Mannheimia und Überprüfung der Ameisensäure-Assimilationsfähigkeit
  • Es wurde festgestellt, dass die Ameisensäure-Assimilation sogar in Wirtsmikroorganismen mit einem zentralen Kohlenstoff-Stoffwechselweg sowie in E. coli durch den in der vorliegenden Erfindung entwickelten Ameisensäure-Assimilations-Stoffwechselweg erfolgt. In diesem Beispiel wurde der Ameisensäure-Assimilations-Stoffwechselweg in den Mikroorganismus der Gattung Mannheimia eingeführt, und ob die Ameisensäure-Assimilation durchgeführt wurde oder nicht, wurde durch KohlenstoffIsotopenanalyse ermittelt.
  • Zunächst wurde ein Plasmid, das die Gene ftl, fch und mtd enthält, die am Ameisensäure-Assimilationsweg beteiligt sind, in einen Mikroorganismus der Gattung Mannheimia eingeführt, um einen rekombinanten Mikroorganismus mit dem Ameisensäure-Assimilationsweg zu erzeugen. Konkret wurden die für die Plasmidproduktion erforderlichen fremden Genfragmente durch PCR unter Verwendung des in Beispiel 1 hergestellten p100THF-Plasmids mit dem entsprechenden Gen als Matrize und unter Verwendung von Primern, die für die Amplifikation des entsprechenden Gens bestimmt sind, hergestellt, gefolgt von der Sammlung und Reinigung der amplifizierten Genfragmente. Die PrimerSequenzen sind in Tabelle 21 unten aufgeführt. [Tabelle 21]
    Zielgen Primer-Sequenz
    ftfLfch-mtd [SEQ ID NO: 38]: 5'ttatcaactctactggggaggaattcatgccctcagatatcgagatc -3' [SEQ ID NO: 39]: 5'- tctagaggatccccgggtacctcaggccatttccttggcc -3'
  • Zur Konstruktion des Ameisensäure-Assimilationsweges wurde ein Plasmid hergestellt, das Gene enthält, die für die oben genannten Enzyme codieren. [Tabelle 22]
    Plasmid Merkmale
    pMS3-THF Enthält pMB1-Replikationsursprung, Mannheimia-Replikationsursprung, Ampicillin-Resistenzgen, frdA-Promotor, SEQ ID NO:01 Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase, SEQ ID NO:02 Methenyl-Tetrahydrofolat-Cyclohydrolase und SEQ ID NO:03 Methylen-Tetrahydrofolat-Dehydrogenase
  • Die Plasmide wurden aus den Genfragmenten des Plasmidrückgrats und den amplifizierten Genfragmenten mit Hilfe der Gibson-Assembly-Methode (Gibson et al., Nat. Methods, 6:5, 343-345, 2009) hergestellt, die üblicherweise für die Assemblierung von Genfragmenten verwendet wird, und jedes Plasmid wurde so hergestellt, dass es eines oder mehrere der in der obigen Tabelle aufgeführten Fremdgene enthält.
  • Das rekombinante Plasmid, das mit dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, wurde in Mannheimia transformiert, um rekombinante Mannheimia zu produzieren. Bei den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mannheimia handelte es sich um Mannheimia succiniciproducens LPK7, und die Transformation in Mannheimia wurde mittels der in der Technik üblichen Elektroporation durchgeführt.
  • Für die Analyse der Ameisensäure-Assimilationsfähigkeit wurden der rekombinante Mannheimia-Stamm (LPK7_FTF), der mit dem Ameisensäure-Assimilations-Stoffwechselweg eingeführt wurde, und der negative Kontrollstamm (LPK7), der mit dem leeren Vektor eingeführt wurde, in Gehirn-Herz-Infusionsmedium (BHI) kultiviert, das mit 2 g/l Glycin und 4,43 g/l 13C-markiertem Formiat ergänzt wurde, und dann wurde das Verhältnis der Kohlenstoffisotope gemessen, die in dem in der Biomasse enthaltenen Serin enthalten sind. Wenn die Ameisensäure-Assimilation über den Ameisensäure-Assimilationsweg erfolgt, befindet sich der aus der Ameisensäure gewonnene Kohlenstoff am Kohlenstoff 1 des Serins über den in 1 dargestellten Ameisensäure-Assimilations-Stoffwechselweg. Das Ergebnis der Messung zeigte, dass 13C-Kohlenstoff aus Ameisensäure in etwa 19,5% des gesamten Serins, das in der Biomasse des LPK7_FTF-Stammes enthalten ist, der mit dem Ameisensäure-Assimilations-Stoffwechselweg eingeführt wurde, nachgewiesen wurde, während 13C-Kohlenstoff im Serin des negativen Kontrollstammes überhaupt nicht nachgewiesen wurde (13).
  • [Tabelle 23]
  • In diesem Beispiel verwendete Gensequenzen
    Gen-Name Gensequenz (5 - 3)
    ftfL [SEQ ID NO: 1]
    Figure DE102021207101A1_0004
    Figure DE102021207101A1_0005
    fch [SEQ ID NO: 2]
    Figure DE102021207101A1_0006
    mtdA [SEQ ID NO: 3]
    Figure DE102021207101A1_0007
    Figure DE102021207101A1_0008
    gcvT [SEQ ID NO: 10]
    Figure DE102021207101A1_0009
    gcvH [SEQ ID NO: 11]
    Figure DE102021207101A1_0010
    gcvP [SEQ ID NO: 12]
    Figure DE102021207101A1_0011
    Figure DE102021207101A1_0012
    pflB [SEQ ID NO: 13]
    Figure DE102021207101A1_0013
    Figure DE102021207101A1_0014
    serA [SEQ ID NO: 14]
    Figure DE102021207101A1_0015
    Figure DE102021207101A1_0016
    gcvR [SEQ ID NO: 15]
    Figure DE102021207101A1_0017
    ppsR [SEQ ID NO: 16]
    Figure DE102021207101A1_0018
    purT [SEQ ID NO: 17]
    Figure DE102021207101A1_0019
    fdh [SEQ ID NO: 18]
    Figure DE102021207101A1_0020
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen rekombinanten Mikroorganismus zur Verfügung, der Brenztraubensäure, eine organische C3-Verbindung, mit einer deutlich verbesserten Rate im Vergleich zum Stand der Technik synthetisiert, unter Verwendung von Kohlendioxid, das in der Natur reichlich vorhanden ist, und Ameisensäure, die eine geringe Toxizität aufweist, und für eine Assimilationsreaktion in Bezug auf die Reaktionskinetik geeignet ist und leicht und schnell aus Kohlendioxid synthetisiert werden kann, und der insbesondere mit einer deutlich verbesserten Rate auch in einem Medium wachsen kann, das nur Kohlendioxid und Ameisensäure als Kohlenstoffquellen enthält, ohne Glucose zu enthalten. Daher hat der rekombinante Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung den Vorteil, Brenztraubensäure und verschiedene wertsteigernde Verbindungen unter Verwendung desselben als Zwischenprodukt in einer wirtschaftlich effizienten Weise zu synthetisieren.
  • Obwohl spezifische Konfigurationen der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben worden sind, wird der Fachmann verstehen, dass diese detaillierte Beschreibung als bevorzugte Ausführungsformen zu Veranschaulichungszwecken bereitgestellt wird und nicht als Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung ausgelegt werden sollte. Daher wird der wesentliche Umfang der vorliegenden Erfindung durch die begleitenden eingereichten Ansprüche und deren Äquivalente definiert.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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    • US 2013/0196359 [0005]

Claims (20)

  1. Rekombinanter Mikroorganismus, in dem ein Gen, das für einen Transkriptionsrepressor des Glycinspaltungssystems, Pyruvat-Formiat-Lyase oder Phosphoglycerat-Dehydrogenase codiert, abgeschwächt oder aus einem Wirtsmikroorganismus mit einem Ameisensäure-Assimilationsweg deletiert ist, ein Gen, das für ein Enzym codiert, das an einer Glycinspaltungssystemreaktion beteiligt ist, in dem Wirtsmikroorganismus mit dem Ameisensäureassimilationsweg verstärkt exprimiert wird, und ein Gen, das für Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase, Methenyl-Tetrahydrofolat-Cyclohydrolase oder Methylen-Tetrahydrofolat-Dehydrogenase codiert, in den Wirtsmikroorganismus mit dem Ameisensäure-Assimilationsweg eingeführt ist.
  2. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei der Wirtsmikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Gattungen Escherichia, Mannheimia, Rhodobacter und Methylobacterium.
  3. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei die Expression des Gens, das für das an der Glycinspaltsystemreaktion beteiligte Enzym codiert, durch Ersetzen eines nativen Promotors durch einen starken Promotor verstärkt wird.
  4. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 3, wobei der starke Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem trc-Promotor, einem tac-Promotor, einem T7-Promotor, einem lac-Promotor und einem trp-Promotor.
  5. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei das Gen, das für Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase codiert, durch eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, das Gen, das für Methenyl-Tetrahydrofolat-Cyclohydrolase codiert, durch eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 dargestellt wird und das Gen, das für Methylen-Tetrahydrofolat-Dehydrogenase codiert, durch eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 dargestellt wird.
  6. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei ein Gen, das für ein Phosphoenolpyruvat-Synthase-Regulationsprotein oder für Phosphoribosylglycinamid-Formyltransferase codiert, weiter abgeschwächt oder aus dem rekombinanten Mikroorganismus deletiert ist, die Expression eines Gens, das für Phosphoenolpyruvat-Synthase (ppsA) oder H+-translozierende NAD(P)-Transhydrogenase (pntAB) codiert, in dem rekombinanten Mikroorganismus weiter verstärkt ist, und ein Gen, das für Formiatdehydrogenase und/oder eine Mutante davon codiert, zusätzlich in den rekombinanten Mikroorganismus eingeführt ist.
  7. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 6, wobei die Expression des Gens, das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase (ppsA) oder die H+-translozierende NAD(P)-Transhydrogenase (pntAB) codiert, durch Ersetzen eines nativen Promotors durch einen starken Promotor verstärkt wird.
  8. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 7, wobei der starke Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem trc-Promotor, einem tac-Promotor, einem T7-Promotor, einem lac-Promotor und einem trp-Promotor.
  9. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 6, wobei Gene, die für eines oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase, der Methenyl-Tetrahydrofolat-Cyclohydrolase, der Methylen-Tetrahydrofolat-Dehydrogenase, der Formiat-Dehydrogenase und der Formiat-Dehydrogenase-Mutante, codieren, eingeführt werden, indem sie in einen Vektor kloniert werden, der einen Replikationsursprung mit 1 bis 12 Kopien enthält.
  10. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 9, wobei der Vektor einen Replikationsursprung mit 1 bis 5 Kopien enthält.
  11. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 9, wobei das Gen, das für Formiatdehydrogenase codiert, durch eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 18 dargestellt wird und das Gen, das für die Formiatdehydrogenasemutante codiert, durch eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 21 dargestellt wird.
  12. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei der rekombinante Mikroorganismus in der Lage ist, eine C3-Verbindung unter ausschließlicher Verwendung von Ameisensäure und Kohlendioxid als Kohlenstoffquellen herzustellen.
  13. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 12, wobei die C3-Verbindung Brenztraubensäure ist.
  14. Verfahren zur Herstellung einer C3-Verbindung, umfassend: (a) einen Schritt der Kultivierung des rekombinanten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 13 unter Verwendung von Ameisensäure und Kohlendioxid als Kohlenstoffquellen zur Herstellung einer C3-Verbindung; und (b) einen Schritt des Sammelns der hergestellten C3-Verbindung.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei 0,02 bis 0,08 mM IPTG in dem Schritt der Kultivierung des rekombinanten Mikroorganismus zugegeben wird.
  16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der rekombinante Mikroorganismus bei 31 bis 33°C kultiviert wird.
  17. Verfahren nach Anspruch 14, wobei im Schritt der Kultivierung die Ameisensäure bei einer Konzentration von 2 bis 3 g/l gehalten wird und der pH-Wert bei 6,6 bis 7,0 gehalten wird.
  18. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der rekombinante Mikroorganismus zunächst mit einer Rührgeschwindigkeit von 450 bis 550 U/min kultiviert wird und anschließend kultiviert wird, während die Rührgeschwindigkeit auf eine Endgeschwindigkeit von 700 bis 800 U/min erhöht wird.
  19. Verfahren zur Herstellung einer nützlichen Verbindung unter Verwendung von Brenztraubensäure als Zwischenprodukt, umfassend: (a) einen Schritt der Kultivierung des rekombinanten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 13 unter Verwendung von Ameisensäure und Kohlendioxid als Kohlenstoffquellen zur Herstellung einer nützlichen Substanz mit einer Brenztraubensäure als Zwischenprodukt; und (b) einen Schritt des Sammelns der hergestellten nützlichen Substanz.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die nützliche Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Butanol, Isobutanol, Hexanol, Heptanol, Octanol, Nonanol, Decanol, tert-Butanol, 1-Pentanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 2-Methyl-1-butanol, 3-Methyl-1-butanol, 2-Methyl-2-butanol, Isobutanol, Putrescin, L-Ornithin, Arginin, polycyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAHs), Polylactat, Polylactat-Co-Glycolat, Polyisovalerat, Polyhydroxybutyrat (PHB), 4-Hydroxybutyrat, Biodiesel, Benzin, Olefin, 5-Aminovaleriansäure, Gamma-Iminobuttersäure, 3-Hydroxypyropionsäure, 3-Aminopropionsäure, Acrylsäure, 1,3-Diaminopropan, Caprolactam, Threonin, Valin, Isoleucin, Fumarsäure, Apfelsäure, Bernsteinsäure, Ceramid, Astaxanthin, Silybin, Lycopin, Lutein und Retinol.
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